ÁP DỤNG KỸ THUẬT SSCP

Chia sẻ: Nguyễn Thắng | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

309
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Streptococcus pneumoniae kháng penicillin là vấn đề lớn, mang tính toàn cầu trong lĩnh vực sức khỏe con người. Cơ chế kháng chủ yếu dựa trên sự biến đổi cấu trúc các PBP (Penicillin Binding Protein) mà quan trọng nhất là PBP1A, 2B, 2X mã hóa bởi các gene pbp tương ứng. Kỹ thuật SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism – Tính đa hình trong cấu hình mạch đơn của nucleic acid) là một trong những kỹ thuật thông dụng cho phép phát hiện sự tồn tại của các đột biến điểm trên một trình tự nucleic acid khi so...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: ÁP DỤNG KỸ THUẬT SSCP

ÁP DỤNG KỸ THUẬT SSCP (SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM) ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN TRÊN GEN PBP2B Ở CÁC CHỦNG STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KHÁNG PENICILLIN Tóm tắt Streptococcus pneumoniae kháng penicillin là vấn đề lớn, mang tính toàn cầu trong lĩnh vực sức khỏe con người. Cơ chế kháng chủ yếu dựa trên sự biến đổi cấu trúc các PBP (Penicillin Binding Protein) mà quan trọng nhất là PBP1A, 2B, 2X mã hóa bởi các gene pbp tương ứng. Kỹ thuật SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism – Tính đa hình trong cấu hình mạch đơn của nucleic acid) là một trong những kỹ thuật thông dụng cho phép phát hiện sự tồn tại của các đột biến điểm trên một trình tự nucleic acid khi so sánh với trình tự chuẩn (không mang đột biến). Đề tài áp dụng kỹ thuật SSCP để phát hiện đột biến trên 3 trình tự của gene pbp2b ở các chủng S. pneumoniae kháng penicillin. Trước hết, chúng tôi xác định một số chỉ tiêu của kỹ thuật để đạt độ phân tích tốt nhất cho các trình tự đã nêu. Các chỉ tiêu này bao gồm: tác
nhân biến tính, hàm lượng DNA, nồng độ gel polyacrylamide, phương pháp nhuộm). Sau đó áp dụng quy trình với các chỉ tiêu đã xác định được để phát hiện đột biến trên 20 chủng kháng penicillin so sánh với chủng nhạy. Kết quả cho thấy 18/20 chủng khảo sát có mang đột biến ít nhất trên 1 trong 3 trình tự. Hai chủng kháng còn lại không cho thấy có sự khác biệt với chủng nhạy, có thể do đột biến nằm ngoài khu vực khảo sát hoặc do độ nhạy của kỹ thuật. Summary USING SSCP (SINGLE S TRAND CONFORMATION POLYMORPHISM) TECHNIQUE FOR DETECTION OF MUTATION OF PENICILLIN-RESISTANT STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE PBP2B GENE Đỗ Thanh Ngân, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Võ Thị Chi Mai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 6 - No 2 - 2002: 70 - 73 1 Cử nhân Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên. 2 Tiến sĩ, bộ môn Vi sinh-Sinh học Phân tử, Đại học Khoa học Tự nhiên. 3 Tiến sĩ, bộ môn Vi sinh Khoa Y, khoa Vi sinh bệnh viện Chợ Rẫy.
The spread of penicillin resistant strains of Streptococcus pneumoniae is an important worldwide health problem. Resistance is essentially based on the modification of PBPs (Penicillin Binding Proteins), particularly PBP1A, 2B and 2X, encoded by corresponding pbp genes. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) electrophoresis analysis is one of well-known techniques used to detect point mutations in DNA fragments. We used SSCP analysis for the detection of point mutations in 3 amplified fragments from pbp2b gene of resistant S. pneumoniae strains. Firstly, we determined some technical conditions of the SSCP protocol, including denaturation agents, DNA quantity, polyacrylamide gel concentration and staining procedure, to optimize the analysis of investigated fragments. The protocol set up is used to detect point mutations in 20 penicillin-resistant strains in comparison with the sensitive one. Results obtained showed the probable presence of point mutations in at least
1 of the 3 fragments of 18/20 strains studied. The remaining 2 resistant strains showed no difference in the electrophoretic pattern in comparison with the sensitive one, possibly due to the sensitivity of SSCP technique or to the absence of mutations in investigated region of pbp2b. MỞ ĐẦU Sự phát triển và lan truyền của Streptococcus pneumoniae kháng penicillin là một vấn đề quan trọng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe trên thế giới. Tại Việt Nam, năm 1999, theo số liệu của chương trình Giám sát quốc gia về tính kháng thuốc của một số vi khuẩn thường gặp, có 13,7% chủng S. pneumoniae được xác định là kháng penicillin (trên 153 chủng khảo sát). Tỷ lệ này là con số đáng báo động(4). Tình hình kháng thuốc của một số vi khuẩn ở người khỏe mạnh tại cộng đồng năm 1999 (tại ba địa điểm ngoại thành thành phố Hà Nội, Huế và TP. Hồ Chí Minh) cho thấy tỉ lệ mang vi khuẩn S. pneumoniae có độc lực ở người khỏe mạnh là 40,1% tại Hà Nội, 16,7% tại Huế và 30,9% tại Tp. Hồ Chí Minh. Mức độ nhạy cảm với penicillin của 153 chủng S. pneumoniae ở trẻ khỏe mạnh đã giảm đi 19,6% tính chung cho ba địa phương này(4).
Nguyên nhân kháng penicillin ở S. pneumoniae là do sự thay đổi của các PBP (penicillin binding protein – phức hợp enzym acyl serine transferase xúc tác tạo các cầu peptide trong hình thành thành tế bào)(3). Ở các chủng S. pneumoniae kháng penicillin, các PBP 1A, 2A, 2B và 2X là các PBP có khả năng thay đổi giảm ái lực với penicillin. Trong đó, sự thay đổi của PBP 2B có vai trò quan trọng. Hơn nữa, gene pbp2b mã hóa cho PBP 2B có tần số đột biến rất cao và đột biến xảy ra trên gene pbp2b cũng rất đa dạng(1,2,3). Trong các phương pháp phát hiện sự tồn tại các đột biến trên một trình tự DNA như: DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), CCM (Chemical Cleavage Method), EMC (Enzyme Mismatch Cleavage),... thì kỹ thuật SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) là kỹ thuật khá thông dụng. Kỹ thuật này cho phép phân tích tính đa hình của cấu hình sợi đơn nucleic). Đây là một phương pháp đơn giản để xác định đột biến điểm trên một trình tự DNA khi so sánh với một trình tự DNA đã biết. Nguyên tắc của kỹ thuật này là trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn DNA sẽ có một cấu hình nhất định tùy theo trình tự của nó. Cấu hình này được xác định bởi các liên kết nội phân tử. Các cấu hình sẽ khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt 1 nucleotide. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide,
Chúng tôi khảo sát các điều kiện phân tách tối ưu cho kỹ thuật SSCP và sử dụng quy trình với các điều kiện đã xác định để phân tích các sai khác trình tự trên ba đoạn DNA nhân bản từ gene pbp2b của S. pneumoniae. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Sản phẩm DNA khảo sát là sản phẩm PCR của ba đoạn trình tự trên gen pbp2b của 20 chủng Streptococcus pneumoniae kháng penicillin và 1 chủng ATCC 49619. Vị Đoạn Kích trí trên trình tự thước(nucleotide) gen khảo sát pbp2b 331 346 1 (pbp 2B1) – 676 130 657 2 (pbp 2B2) – 786 242 787 3 (pbp 2B3) – 1028
DNA được biến tính bằng nhiệt (đun sôi 10 phút, làm lạnh đột ngột trong nước đá đang tan), formamide, NaOH 500mM. Các sản phẩm biến tính được phân tích trên gel polyacrylamide 8%. Điện di trong 16 giờ ở hiệu điện thế 100V. Phát hiện các sản phẩm trên gel sau điện di bằng cách nhuộm với dung dịch bạc 25% hoặc ethidium bromide. KẾT QUẢ – bàn luận Chúng tôi đã thiết kế ba cặp mồi để nhân bản ba trình tự DNA từ gene pbp2b với kích thước là 331bp, 130bp, 242bp. Các trình t ự DNA có kích thước khoảng 300 bp được xem là phù hợp cho phương pháp phân tích SSCP. Kết quả khảo sát các điều kiện của kỹ thuật SSCP Trước tiên, chúng tôi so sánh ba tác nhân biến tính: nhiệt (nước đun sôi), formamide và NaOH. Kết quả cho thấy phương pháp biến tính bằng nhiệt cho kết quả tốt nhất. Điều này thể hiện qua cường độ và mức độ phân tách của các vạch tương ứng với mạch đơn DNA. Khi khảo sát hai phương pháp phát hiện DNA trên gel sau điện di: nhuộm ethidium bromide và nhuộm bạc. Kết quả cho thấy phương pháp nhuộm bạc có độ nhạy cao hơn.
Kết quả khảo sát hàm lượng mẫu DNA sử dụng cho điện di SSCP cho thấy: hàm lượng 2880ng là thích hợp cho việc phát hiện bằng phương pháp nhuộm bạc. Do đó, chúng tôi sử dụng nồng độ DNA này cho các khảo sát về sau. Chỉ tiêu cuối cùng được khảo sát là ti lệ bisacrylamide : acrylamide dùng để tạo gel. Kết quả khảo sát các tỉ lệ 1: 39, 1: 59, 1: 79, 1: 99, 1: 149 đối với gel 8 cho thấy ti lệ 1: 39 cho kết quả phân tách hai mạch đơn DNA tốt nhất đối với các trình tự DNA nghiên cứu. Kết quả khảo sát các trình tự DNA của gene pbp2b từ 20 chủng S. pneumoniae kháng penicillin và 1 chủng nhạy Chúng tôi sử dụng quy trình SSCP với các điều kiện đã chọn để phát hiện đột biến điểm trên ba trình tự DNA thuộc gen pbp2b của 21 chủng S. pneumoniae gồm 1 chủng nhạy và 20 chủng kháng. Trong phương pháp SSCP, người ta có thể phát hiện đột biến điểm trên một trình tự DNA chưa biết khi so sánh dạng điện di của trình tự ấy (dưới dạng mạch đơn) với một trình tự chứng đã biết. Trong khảo sát của chúng tôi, các trình tự chứng được nhân bản từ gen pbp2b của chủng S. pneumoniae nhạy với penicillin (ATCC 49619). Sau đây là bảng tổng kết kết quả điện di SSCP trên 3 trình tự khảo sát:
Nhóm đồng dạng Trình trên kết quả điện di tự DNA SSCP - nhóm 1: Chủng ATCC, chủng kháng 25, 26, 27, 28, 29, 33, 34 - Nhóm 2: Chủng kháng 17, 19, 21, 32 - Nhóm 3: Chủng kháng 15, 18, 22, 23, 24 Trình - nhóm 4: Chủng tự pbp 2B1 kháng 16 - nhóm 5: Chủng kháng 20 - nhóm 6: Chủng kháng 30 - nhóm 7: Chủng kháng 31.
- nhóm 1: Chủng ATCC, chủng kháng 15, 22, 23, 24, 26, 29, 32, 33, 34 - nhóm 2: Chủng Trình kháng 16, 17, 18, 19, 20, tự pbp 2B2 21 - nhóm 3: Chủng kháng 25, 27, 28, 31 - nhóm 4: Chủng kháng 30
- nhóm 1: Chủng ATCC, chủng kháng 15, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 33, 34 - nhóm 2: Chủng Trình kháng 16, 17, 19, 21 tự pbp 2B3 - nhóm 3: Chủng kháng 26, 29, 31 - nhóm 4: Chủng kháng 30 - nhóm 5: Chủng kháng 32 Một số công trình nghiên cứu cho thấy nhiều đột biến trên gen pbp2b có ảnh hưởng rất lớn đến tính kháng penicillin ở Streptococcus pneumoniae. Mức độ kháng penicillin của 20 chủng S. pneumoniae kháng penicillin mà chúng tôi khảo sát có MIC đối với penicillin > 4g/ml. Nồng độ này tương ứng với mức độ kháng cao. Kết quả điện di SSCP phù hợp với kết quả trên: có 18/20 chủng kháng có dạng điện di khác với chủng nhạy ATCC, nghĩa là có khả năng mang những sai khác trên trình tự nucleotide
so với chủng nhạy. Hai chủng kháng còn lại (33, 34) có dạng SSCP giống hệt chủng nhạy. Có thể đột biến dẫn đến tính kháng penicillin ở hai chủng này xảy ra bên ngoài khu vực trình tự khảo sát. Ngoài ra, độ nhạy của phương pháp SSCP cũng không cho phép phát hiện quá 70-80% số đột biến tồn tại. Kết quả điện di SSCP cho thấy 18/20 chủng khảo sát đều có mang đột biến trên ít nhất 1 trong ba trình tự 1, 2, 3 của gen pbp2b. Cả ba trình tự này nằm trong vùng tương ứng với vùng mã hóa cho hoạt tính transpeptidase (TER: transpeptidase encoding region) của gen pbp2b là vùng có biến động rất lớn về mặt di truyền(1,2,4). Theo một số công trình nghiên cứu, thì những thay đổi trên gen pbp2b quan trọng chủ yếu tập trung ở khu vực này. Như vậy, kết quả chúng tôi nhận được phù hợp với nhận định trên. Do vùng gen khảo sát trong đề tài này chỉ chiếm hơn 1/3 vùng TER nên có khả năng 2 chủng kháng 33, 34 có mang đột biến nằm ngoài khu vực khảo sát như đã nói ở trên. Như vậy, quy trình SSCP hình thành đã cho phép phát hiện được các sai khác trên trình tự nucleotide nằm trong gen pbp2b. Các sai khác này có thể có liên quan đến tính kháng penicillin ở S. pneumoniae. KẾT LUẬN
Quy trình SSCP với các điều kiện được xác định bao gồm: biến tính DNA bằng nhiệt, phát hiện sau điện di bằng phương pháp nhuộm bạc, hàm lượng DNA sử dụng là 2880ng, tỉ lệ bisacrylamide : acrylamide trong gel 8% là 1 : 39 . Sử dụng quy trình này để phát hiện sự tồn tại của các đột biến điểm trên 3 trình tự DNA nhân bản từ gene pbp2b ở 20 chủng S. pneumoniae kháng penicillin và 01 chủng nhạy ATCC49619, chúng tôi nhận thấy có 18/20 chủng kháng có mang những sai khác trên ít nhất 1 trong ba trình tự khảo sát.