Áp dụng kỹ thuật SSCP (single strand conformation polymorphism) để phát hiện đột biến trên gen pbp2b ở các chủng streptococcus pneumoniae kháng penicillin

Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 6* Soá 2* 2002<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> <br /> AÙP DUÏNG KYÕ THUAÄT SSCP (SINGLE STRAND CONFORMATION<br /> POLYMORPHISM) ÑEÅ PHAÙT HIEÄN ÑOÄT BIEÁN TREÂN GEN PBP2B<br /> ÔÛ CAÙC CHUÛNG STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KHAÙNG PENICILLIN<br /> Ñoã Thanh Ngaân1, Hoà Huyønh Thuøy Döông 2, Voõ Thò Chi Mai3<br /> <br /> TOÙM TAÉT<br /> Streptococcus pneumoniae khaùng penicillin laø vaán ñeà lôùn, mang tính toaøn caàu trong lónh vöïc söùc khoûe<br /> con ngöôøi. Cô cheá khaùng chuû yeáu döïa treân söï bieán ñoåi caáu truùc caùc PBP (Penicillin Binding Protein) maø<br /> quan troïng nhaát laø PBP1A, 2B, 2X maõ hoùa bôûi caùc gene pbp töông öùng. Kyõ thuaät SSCP (Single Strand<br /> Conformation Polymorphism – Tính ña hình trong caáu hình maïch ñôn cuûa nucleic acid) laø moät trong nhöõng<br /> kyõ thuaät thoâng duïng cho pheùp phaùt hieän söï toàn taïi cuûa caùc ñoät bieán ñieåm treân moät trình töï nucleic acid khi<br /> so saùnh vôùi trình töï chuaån (khoâng mang ñoät bieán). Ñeà taøi aùp duïng kyõ thuaät SSCP ñeå phaùt hieän ñoät bieán treân<br /> 3 trình töï cuûa gene pbp2b ôû caùc chuûng S. pneumoniae khaùng penicillin.<br /> Tröôùc heát, chuùng toâi xaùc ñònh moät soá chæ tieâu cuûa kyõ thuaät ñeå ñaït ñoä phaân tích toát nhaát cho caùc trình töï<br /> ñaõ neâu. Caùc chæ tieâu naøy bao goàm: taùc nhaân bieán tính, haøm löôïng DNA, noàng ñoä gel polyacrylamide,<br /> phöông phaùp nhuoäm). Sau ñoù aùp duïng quy trình vôùi caùc chæ tieâu ñaõ xaùc ñònh ñöôïc ñeå phaùt hieän ñoät bieán treân<br /> 20 chuûng khaùng penicillin so saùnh vôùi chuûng nhaïy. Keát quaû cho thaáy 18/20 chuûng khaûo saùt coù mang ñoät<br /> bieán ít nhaát treân 1 trong 3 trình töï. Hai chuûng khaùng coøn laïi khoâng cho thaáy coù söï khaùc bieät vôùi chuûng nhaïy,<br /> coù theå do ñoät bieán naèm ngoaøi khu vöïc khaûo saùt hoaëc do ñoä nhaïy cuûa kyõ thuaät.<br /> <br /> SUMMARY<br /> USING SSCP (SINGLE S TRAND CONFORMATION POLYMORPHISM) TECHNIQUE FOR DETECTION<br /> OF MUTATION OF PENICILLIN-RESISTANT STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE PBP2B GENE<br /> Ñoã Thanh Ngaân, Hoà Huyønh Thuøy Döông, Voõ Thò Chi Mai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 6 - No 2 - 2002: 70 - 73<br /> <br /> The spread of penicillin resistant strains of Streptococcus pneumoniae is an important worldwide<br /> health problem. Resistance is essentially based on the modification of PBPs (Penicillin Binding Proteins),<br /> particularly PBP1A, 2B and 2X, encoded by corresponding pbp genes. SSCP (Single Strand Conformation<br /> Polymorphism) electrophoresis analysis is one of well-known techniques used to detect point mutations in<br /> DNA fragments. We used SSCP analysis for the detection of point mutations in 3 amplified fragments from<br /> pbp2b gene of resistant S. pneumoniae strains.<br /> Firstly, we determined some technical conditions of the SSCP protocol, including denaturation agents,<br /> DNA quantity, polyacrylamide gel concentration and staining procedure, to optimize the analysis of<br /> investigated fragments. The protocol set up is used to detect point mutations in 20 penicillin-resistant<br /> strains in comparison with the sensitive one. Results obtained showed the probable presence of point<br /> mutations in at least 1 of the 3 fragments of 18/20 strains studied. The remaining 2 resistant strains showed<br /> <br /> 1<br /> <br /> Cöû nhaân Sinh hoïc, Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân.<br /> Tieán só, boä moân Vi sinh-Sinh hoïc Phaân töû, Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân.<br /> 3<br /> Tieán só, boä moân Vi sinh Khoa Y, khoa Vi sinh beänh vieän Chôï Raãy.<br /> 2<br /> <br /> no difference in the electrophoretic pattern in comparison with the sensitive one, possibly due to the<br /> sensitivity of SSCP technique or to the absence of mutations in investigated region of pbp2b.<br /> <br /> 70<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> MÔÛ ÑAÀU<br /> Söï phaùt trieån vaø lan truyeàn cuûa Streptococcus<br /> pneumoniae khaùng penicillin laø moät vaán ñeà quan<br /> troïng trong lónh vöïc chaêm soùc söùc khoûe treân theá<br /> giôùi. Taïi Vieät Nam, naêm 1999, theo soá lieäu cuûa<br /> chöông trình Giaùm saùt quoác gia veà tính khaùng<br /> thuoác cuûa moät soá vi khuaån thöôøng gaëp, coù 13,7%<br /> chuûng S. pneumoniae ñöôïc xaùc ñònh laø khaùng<br /> penicillin (treân 153 chuûng khaûo saùt). Tyû leä naøy laø<br /> con soá ñaùng baùo ñoäng(4). Tình hình khaùng thuoác<br /> cuûa moät soá vi khuaån ôû ngöôøi khoûe maïnh taïi coäng<br /> ñoàng naêm 1999 (taïi ba ñòa ñieåm ngoaïi thaønh thaønh<br /> phoá Haø Noäi, Hueá vaø TP. Hoà Chí Minh) cho thaáy tæ<br /> leä mang vi khuaån S. pneumoniae coù ñoäc löïc ôû<br /> ngöôøi khoûe maïnh laø 40,1% taïi Haø Noäi, 16,7% taïi<br /> Hueá vaø 30,9% taïi Tp. Hoà Chí Minh. Möùc ñoä nhaïy<br /> caûm vôùi penicillin cuûa 153 chuûng S. pneumoniae ôû<br /> treû khoûe maïnh ñaõ giaûm ñi 19,6% tính chung cho<br /> ba ñòa phöông naøy(4).<br /> Nguyeân nhaân khaùng penicillin ôû S.<br /> pneumoniae laø do söï thay ñoåi cuûa caùc PBP<br /> (penicillin binding protein – phöùc hôïp enzym acyl<br /> serine transferase xuùc taùc taïo caùc caàu peptide<br /> trong hình thaønh thaønh teá baøo)(3). ÔÛ caùc chuûng S.<br /> pneumoniae khaùng penicillin, caùc PBP 1A, 2A, 2B<br /> vaø 2X laø caùc PBP coù khaû naêng thay ñoåi giaûm aùi<br /> löïc vôùi penicillin. Trong ñoù, söï thay ñoåi cuûa PBP<br /> 2B coù vai troø quan troïng. Hôn nöõa, gene pbp2b<br /> maõ hoùa cho PBP 2B coù taàn soá ñoät bieán raát cao vaø<br /> ñoät bieán xaûy ra treân gene pbp2b cuõng raát ña<br /> daïng(1,2,3).<br /> Trong caùc phöông phaùp phaùt hieän söï toàn taïi<br /> caùc ñoät bieán treân moät trình töï DNA nhö: DGGE<br /> (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), CCM<br /> (Chemical Cleavage Method), EMC (Enzyme<br /> Mismatch Cleavage),... thì kyõ thuaät SSCP (Single<br /> Strand Conformation Polymorphism) laø kyõ thuaät<br /> khaù thoâng duïng. Kyõ thuaät naøy cho pheùp phaân tích<br /> tính ña hình cuûa caáu hình sôïi ñôn nucleic). Ñaây laø<br /> moät phöông phaùp ñôn giaûn ñeå xaùc ñònh ñoät bieán<br /> ñieåm treân moät trình töï DNA khi so saùnh vôùi moät<br /> trình töï DNA ñaõ bieát. Nguyeân taéc cuûa kyõ thuaät<br /> naøy laø trong ñieàu kieän ñieän di khoâng bieán tính, caùc<br /> maïch ñôn DNA seõ coù moät caáu hình nhaát ñònh tuøy<br /> <br /> Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 6* Soá 2* 2002<br /> theo trình töï cuûa noù. Caáu hình naøy ñöôïc xaùc ñònh<br /> bôûi caùc lieân keát noäi phaân töû. Caùc caáu hình seõ khaùc<br /> nhau ngay caû khi chæ khaùc bieät 1 nucleotide. Söï<br /> khaùc bieät naøy daãn ñeán söï khaùc bieät veà khaû naêng di<br /> chuyeån trong gel polyacrylamide,<br /> Chuùng toâi khaûo saùt caùc ñieàu kieän phaân taùch toái<br /> öu cho kyõ thuaät SSCP vaø söû duïng quy trình vôùi caùc<br /> ñieàu kieän ñaõ xaùc ñònh ñeå phaân tích caùc sai khaùc<br /> trình töï treân ba ñoaïn DNA nhaân baûn töø gene<br /> pbp2b cuûa S. pneumoniae.<br /> <br /> VAÄT LIEÄU – PHÖÔNG PHAÙP<br /> Saûn phaåm DNA khaûo saùt laø saûn phaåm PCR<br /> cuûa ba ñoaïn trình töï treân gen pbp2b cuûa 20 chuûng<br /> Streptococcus pneumoniae khaùng penicillin vaø 1<br /> chuûng ATCC 49619.<br /> Ñoaïn trình töï<br /> khaûo saùt<br /> 1 (pbp 2B1)<br /> 2 (pbp 2B2)<br /> 3 (pbp 2B3)<br /> <br /> Kích<br /> thöôùc(nucleotide)<br /> 331<br /> 130<br /> 242<br /> <br /> Vò trí treân gen<br /> pbp2b<br /> 346 – 676<br /> 657 – 786<br /> 787 – 1028<br /> <br /> DNA ñöôïc bieán tính baèng nhieät (ñun soâi 10<br /> phuùt, laøm laïnh ñoät ngoät trong nöôùc ñaù ñang tan),<br /> formamide, NaOH 500mM. Caùc saûn phaåm bieán<br /> tính ñöôïc phaân tích treân gel polyacrylamide 8%.<br /> Ñieän di trong 16 giôø ôû hieäu ñieän theá 100V. Phaùt<br /> hieän caùc saûn phaåm treân gel sau ñieän di baèng caùch<br /> nhuoäm vôùi dung dòch baïc 25% hoaëc ethidium<br /> bromide.<br /> <br /> KEÁT QUAÛ – BAØN LUAÄN<br /> Chuùng toâi ñaõ thieát keá ba caëp moài ñeå nhaân baûn<br /> ba trình töï DNA töø gene pbp2b vôùi kích thöôùc laø<br /> 331bp, 130bp, 242bp. Caùc trình töï DNA coù kích<br /> thöôùc khoaûng 300 bp ñöôïc xem laø phuø hôïp cho<br /> phöông phaùp phaân tích SSCP.<br /> Keát quaû khaûo saùt caùc ñieàu kieän cuûa kyõ thuaät<br /> SSCP<br /> Tröôùc tieân, chuùng toâi so saùnh ba taùc nhaân bieán<br /> tính: nhieät (nöôùc ñun soâi), formamide vaø NaOH.<br /> Keát quaû cho thaáy phöông phaùp bieán tính baèng<br /> nhieät cho keát quaû toát nhaát. Ñieàu naøy theå hieän qua<br /> cöôøng ñoä vaø möùc ñoä phaân taùch cuûa caùc vaïch töông<br /> öùng vôùi maïch ñôn DNA.<br /> <br /> 71<br /> <br /> Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 6* Soá 2* 2002<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> <br /> Khi khaûo saùt hai phöông phaùp phaùt hieän DNA<br /> treân gel sau ñieän di: nhuoäm ethidium bromide vaø<br /> nhuoäm baïc. Keát quaû cho thaáy phöông phaùp nhuoäm<br /> baïc coù ñoä nhaïy cao hôn.<br /> <br /> Trình töï<br /> pbp 2B2<br /> <br /> Keát quaû khaûo saùt haøm löôïng maãu DNA söû<br /> duïng cho ñieän di SSCP cho thaáy: haøm löôïng<br /> 2880ng laø thích hôïp cho vieäc phaùt hieän baèng<br /> phöông phaùp nhuoäm baïc. Do ñoù, chuùng toâi söû<br /> duïng noàng ñoä DNA naøy cho caùc khaûo saùt veà sau.<br /> <br /> Trình töï<br /> pbp 2B3<br /> <br /> Chæ tieâu cuoái cuøng ñöôïc khaûo saùt laø tiû leä<br /> bisacrylamide : acrylamide duøng ñeå taïo gel. Keát<br /> quaû khaûo saùt caùc tæ leä 1: 39, 1: 59, 1: 79, 1: 99,<br /> 1: 149 ñoái vôùi gel 8 cho thaáy tiû leä 1: 39 cho keát<br /> quaû phaân taùch hai maïch ñôn DNA toát nhaát ñoái vôùi<br /> caùc trình töï DNA nghieân cöùu.<br /> Keát quaû khaûo saùt caùc trình töï DNA cuûa gene<br /> pbp2b töø 20 chuûng S. pneumoniae khaùng<br /> penicillin vaø 1 chuûng nhaïy<br /> Chuùng toâi söû duïng quy trình SSCP vôùi caùc<br /> ñieàu kieän ñaõ choïn ñeå phaùt hieän ñoät bieán ñieåm treân<br /> ba trình töï DNA thuoäc gen pbp2b cuûa 21 chuûng S.<br /> pneumoniae goàm 1 chuûng nhaïy vaø 20 chuûng<br /> khaùng.<br /> Trong phöông phaùp SSCP, ngöôøi ta coù theå<br /> phaùt hieän ñoät bieán ñieåm treân moät trình töï DNA<br /> chöa bieát khi so saùnh daïng ñieän di cuûa trình töï aáy<br /> (döôùi daïng maïch ñôn) vôùi moät trình töï chöùng ñaõ<br /> bieát. Trong khaûo saùt cuûa chuùng toâi, caùc trình töï<br /> chöùng ñöôïc nhaân baûn töø gen pbp2b cuûa chuûng S.<br /> pneumoniae nhaïy vôùi penicillin (ATCC 49619).<br /> Sau ñaây laø baûng toång keát keát quaû ñieän di<br /> SSCP treân 3 trình töï khaûo saùt:<br /> Trình töï<br /> DNA<br /> <br /> Nhoùm ñoàng daïng treân keát quaû ñieän di SSCP<br /> <br /> - nhoùm 1: Chuûng ATCC, chuûng khaùng 25, 26, 27,<br /> 28, 29, 33, 34<br /> - Nhoùm 2: Chuûng khaùng 17, 19, 21, 32<br /> Trình töï - Nhoùm 3: Chuûng khaùng 15, 18, 22, 23, 24<br /> pbp 2B1 - nhoùm 4: Chuûng khaùng 16<br /> - nhoùm 5: Chuûng khaùng 20<br /> - nhoùm 6: Chuûng khaùng 30<br /> - nhoùm 7: Chuûng khaùng 31.<br /> <br /> - nhoùm 1: Chuûng ATCC, chuûng khaùng 15, 22, 23,<br /> 24, 26, 29, 32, 33, 34<br /> - nhoùm 2: Chuûng khaùng 16, 17, 18, 19, 20, 21<br /> - nhoùm 3: Chuûng khaùng 25, 27, 28, 31<br /> - nhoùm 4: Chuûng khaùng 30<br /> - nhoùm 1: Chuûng ATCC, chuûng khaùng 15, 18, 20,<br /> 22, 23, 24, 25, 27, 28, 33, 34<br /> - nhoùm 2: Chuûng khaùng 16, 17, 19, 21<br /> - nhoùm 3: Chuûng khaùng 26, 29, 31<br /> - nhoùm 4: Chuûng khaùng 30<br /> - nhoùm 5: Chuûng khaùng 32<br /> <br /> Moät soá coâng trình nghieân cöùu cho thaáy<br /> nhieàu ñoät bieán treân gen pbp2b coù aûnh höôûng raát<br /> lôùn ñeán tính khaùng penicillin ôû Streptococcus<br /> pneumoniae. Möùc ñoä khaùng penicillin cuûa 20<br /> chuûng S. pneumoniae khaùng penicillin maø chuùng<br /> toâi khaûo saùt coù MIC ñoái vôùi penicillin > 4g/ml.<br /> Noàng ñoä naøy töông öùng vôùi möùc ñoä khaùng cao.<br /> Keát quaû ñieän di SSCP phuø hôïp vôùi keát quaû treân:<br /> coù 18/20 chuûng khaùng coù daïng ñieän di khaùc vôùi<br /> chuûng nhaïy ATCC, nghóa laø coù khaû naêng mang<br /> nhöõng sai khaùc treân trình töï nucleotide so vôùi<br /> chuûng nhaïy. Hai chuûng khaùng coøn laïi (33, 34) coù<br /> daïng SSCP gioáng heät chuûng nhaïy. Coù theå ñoät<br /> bieán daãn ñeán tính khaùng penicillin ôû hai chuûng<br /> naøy xaûy ra beân ngoaøi khu vöïc trình töï khaûo saùt.<br /> Ngoaøi ra, ñoä nhaïy cuûa phöông phaùp SSCP cuõng<br /> khoâng cho pheùp phaùt hieän quaù 70-80% soá ñoät<br /> bieán toàn taïi.<br /> Keát quaû ñieän di SSCP cho thaáy 18/20 chuûng<br /> khaûo saùt ñeàu coù mang ñoät bieán treân ít nhaát 1 trong<br /> ba trình töï 1, 2, 3 cuûa gen pbp2b. Caû ba trình töï<br /> naøy naèm trong vuøng töông öùng vôùi vuøng maõ hoùa<br /> cho hoaït tính transpeptidase (TER: transpeptidase<br /> encoding region) cuûa gen pbp2b laø vuøng coù bieán<br /> ñoäng raát lôùn veà maët di truyeàn(1,2,4). Theo moät soá<br /> coâng trình nghieân cöùu, thì nhöõng thay ñoåi treân gen<br /> pbp2b quan troïng chuû yeáu taäp trung ôû khu vöïc<br /> naøy. Nhö vaäy, keát quaû chuùng toâi nhaän ñöôïc phuø<br /> hôïp vôùi nhaän ñònh treân. Do vuøng gen khaûo saùt<br /> trong ñeà taøi naøy chæ chieám hôn 1/3 vuøng TER neân<br /> coù khaû naêng 2 chuûng khaùng 33, 34 coù mang ñoät<br /> bieán naèm ngoaøi khu vöïc khaûo saùt nhö ñaõ noùi ôû<br /> treân.<br /> Nhö vaäy, quy trình SSCP hình thaønh ñaõ cho<br /> <br /> 72<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> pheùp phaùt hieän ñöôïc caùc sai khaùc treân trình töï<br /> nucleotide naèm trong gen pbp2b. Caùc sai khaùc<br /> naøy coù theå coù lieân quan ñeán tính khaùng penicillin<br /> ôû S. pneumoniae.<br /> <br /> KEÁT LUAÄN<br /> Quy trình SSCP vôùi caùc ñieàu kieän ñöôïc xaùc<br /> ñònh bao goàm: bieán tính DNA baèng nhieät, phaùt<br /> hieän sau ñieän di baèng phöông phaùp nhuoäm baïc,<br /> haøm löôïng DNA söû duïng laø 2880ng, tæ leä<br /> bisacrylamide : acrylamide trong gel 8% laø 1 : 39<br /> .<br /> Söû duïng quy trình naøy ñeå phaùt hieän söï toàn taïi<br /> cuûa caùc ñoät bieán ñieåm treân 3 trình töï DNA nhaân<br /> baûn töø gene pbp2b ôû 20 chuûng S. pneumoniae<br /> khaùng penicillin vaø 01 chuûng nhaïy ATCC49619,<br /> chuùng toâi nhaän thaáy coù 18/20 chuûng khaùng coù<br /> <br /> Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 6* Soá 2* 2002<br /> mang nhöõng sai khaùc treân ít nhaát 1 trong ba trình<br /> töï khaûo saùt.<br /> <br /> TAØI LIEÄU THAM KHAÛO<br /> 1. ANTHONY M. SMITH & KEITH P. KLUGMAN. 1995.<br /> Alteration in penicillin binding protein 2B from penicillinresistant wild-type strains of Streptococcus pneumoniae.<br /> Antimicrobial agents and chemotherapy. 39: 859-867.<br /> 2. KIMIKO UBUKATA, YASUKO ASAHI, AKIO YAMANE &<br /> MASATOSHI KONNO. 1996. Combination detection of<br /> autolysin and penicillin binding protein 2B gene of<br /> Streptococcus pneumoniae by PCR. Journal of clinical<br /> microbiology. 34: 592-596.<br /> 3. LAWRENCE E. BRYAN, ALLAN J. GODFREY. 1991.<br /> lactam antibiotics: Mode of action and bacterial resistance.<br /> Antibiotics in Laboratory medicine. William & Wilking. 3th ed:<br /> 599-620<br /> 4. LEÂ ÑAËNG HAØ, LEÂ HUY CHÍNH, LEÂ VAÊN PHUÛNG, PHAÏM<br /> VAÊN CA. Moät soá keát quaû cuûa chöông trình giaùm saùt quoác giaveà<br /> tính khaùng thuoác cuûa vi khuaån gaây beänh thöôøng gaëp naêm 1999.<br /> NXB Y hoïc. Thaùng 4/2201. Soá 5.<br /> <br /> 73<br /> <br />