Chƣơng 5

NHỮNG VẤN ĐỀ KỸ THUẬT

VÀ PHƢƠNG PHÁP TẠO

GIỐNG VI SINH VẬT

I. YÊU CẦU CHẤT LƢỢNG GIỐNG

- Sản lƣợng cao, thuần khiết, dễ tách

- Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền, dễ tìm

- Thuần chủng

- Khỏe, phát triển nhanh

- Có khả năng chống tạp nhiễm

- Dễ bảo quản, ổn định

- Có khả năng cải tạo

I. YÊU CẦU CHẤT LƢỢNG GIỐNG

Các trung tâm giữ giống vi sinh vật

• ABBOTT: Abbott Laboratories, North Chicago, III.60064, USA.

• ATCC: American Type Cultur Collection, 12301, Parklawn Drive Rockvill Md

20852, USA.

• CANAD – 212: Division Obioscience, National Research Council, Ottawa,

Canada.

• CC: CRISO Division of Plant Industry, Canberra City, A.C.T. Australia.

• FERM: Fermentation Reseach institute, Agency of IndustrialScience and

Technology, Ministry of Industrial Trade and industry, Chiba, Japan.

• HIR: Food and Fermentation Division, Hokkaido Profectural Industrial Research

Institute, Sapporo, Japan.

• IMASP: Museum of Culture, Institute of Microbiology, Academy of Science of

Republic of China Peking, China.

II. PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG

 Phân lập

 Đột biến nhân tạo

 Lai tạo gen

II. PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP

II. PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP

Tính lượng VSV sau khi pha lõang

1. Chọn hộp petri chứa: 45 colonies (thuộc ống nghiệm thứ 2).

2. Tổng độ pha lõang của ồng nghiệm thứ 2 là

1/102 (99+1) (ống nghiệm 1)x 1/10 (= 10/(10+90) (ống nghiệm 2) = 1/103

3. Lượng mẫu dùng để đổ đĩa là = 0.1ml = 1/10.

Vậy lượng VSV có trong mẫu là:

II. PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP

Bài tập

II. PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP

Đổ đĩa

II. PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP

Cấy ria

II. PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – ÐỘT BIẾN

Loại đột biến

Bản chất các thay đổi

Dấu hiệu phát hiện đột biến

Mất tiên mao, hoặc tiên mao

Các khuẩn lạc mọc dính vào

Không di động

không hoạt động

nhau.

Không

tạo nha

Mất hoặc thay đổi bề mặt

Khuẩn lạc bé, xù xì thay vì lớn,

bào

màng nhầy

tròn, bóng.

Mất hoặc thay đổi lớp bên

Khuẩn lạc nhiều hạt nhỏ, không

Khuẩn lạc xù xì

ngoài lipopolysaccharide

đều

Mất một hoặc nhiều enzym

Không mọc trên môi trường tổng

Dinh dưỡng

trên con đường sinh tỏng hợp

hợp tối thiểu

Không tạo ra sự biến đổi màu

Mất enzym phân giải các loại

Lên men đường

trên môi trường đặc trưng với chỉ

đường

thị màu đặc trưng.

II. PHƢƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – ÐỘT BIẾN

Loại đột biến

Bản chất các thay đổi

Dấu hiệu phát hiện đột biến

Thay đổi khả năng thẩm thầu, ngăn

Mọc trên môi trường có thuốc ở

Kháng thuốc

cản sự xâm nhập vào tế bào của các

nồng độ mà bình thường có thể gây

loại thuốc, hoặc phá hủy các thuốc.

ức chế phát triển của vi sinh vật.

Phát triển trên môi trường nuôi cấy

Kháng virút

Mất điểm tiếp nhân virút

khi có mặt virút ở nồng độ cao.

Nhạy cảm với

Có khả năng phát triển ở nhiệt độ

Thay đổi một protein thiết yếu làm

nhiệt độ bình

thấp. Nhưng ở nhiệt độ bình thường

tăng sự nhạy cảm với nhiệt độ

thường

không phát triển.

Mất các enzym có khả năng tham

Khuẩn lạc có màu khác hoặc mất

Mất sắc tố

gia tổng hợp sắc tố

màu

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp cấy truyền định kỳ trên môi trƣờng mới:

 Sử dụng thạch nghiêng.

 Nấm mốc: cấy truyền sau 3 – 6 tháng

 Nấm men, vi khuẩn: cấy truyền sau 1 – 2 tháng

 Ưu điểm: đơn giản, dễ làm.

 Nhược điểm: tốn công sức, môi trường, thời gian. Không ổn định

Coccidioides immitis

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp cấy truyền định kỳ trên môi trƣờng mới:

 Phương pháp làm:

 Thuần khiết lại chủng vi sinh vật trên thạch đĩa.

 Cấy vi sinh vật điển hình lên thạch nghiêng.

Actinomycetes

 Nuôi trong tủ ấm.

 Lấy ống giống ra và cho vào tủ lạnh bảo quản ở 40C.

 Định kỳ cấy truyền lại.

 Có thể cho thêm 1% dầu thực vật vào để tránh mất nước

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch có lớp dầu khoáng:

 Sử dụng dầu khoáng như vaselin, parafin..

 Ưu điểm:

 Đơn giản, hiệu quả cao.

 Môi trường không bị mất nước.

Campylobacter jejuni

 Vi sinh vật sẽ được bảo quản lâu hơn so với

phương pháp 01.

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch có lớp dầu khoáng:

 Cách bảo quản:

 Khử trùng dầu khoáng (1210C, 2h).

 Sấy khô (1700C, 1 – 2h)

 Để nguội.

Serratia  Đổ lên môi trường thạch nghiêng có VSV phát triển tốt khỏang

1cm. Đậy nút bông lại.

 Trét parafin đặc lên miệng

 Giữ ở điều kiện lạnh hoặc điều kiện thường.

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp giữ giống trên đất, cát:

 Bảo quản các vi sinh vật tạo bào tử.

 Thời gian bảo quản từ 1 - nhiều năm.

 Trước khi dùng phải:

 Cấy ria lên môi trường agar

 Chọn các khuẩn lạc điển hình...

Aspergillus

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp giữ giống trên đất, cát: Cách làm:

 Đất hoặc cát đem rây kỹ, lấy hạt cùng cỡ.

 Ngâm trong HCl hoặc H2SO4 đậm đặc 8 – 12h

Clostridium

 Rửa đến pH trung tính.

 Sấy khô, thanh trùng và giữ vô trùng.

 Với đất chua thì trung hòa bằng CaCO3 1 – 2%.

 Đổ cát vào ống nghiệm chứa VSV trên thạch (nhiều bào tử), lắc đều.

 Rót cát lẫn vi sinh vật và bào tử sang ống nghiệm vô trùng khác.

 Hàn kín ống nghiệm bằng paraffin.

 Đậy nút bông giữ ở 400C trong 2 – 3 ngày.

 Để trong phòng mát hoặc ở 40C.

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp giữ giống trên hạt

 Bảo quản các vi sinh vật có dạng hình sợi sinh bào tử hoặc không.

 Thời gian bảo quản có thể lên tới 1 năm..

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp giữ giống trên hạt

 Phương pháp làm:

 Cho vào các ống nghiệm.

 Hạt ngũ cốc được rửa sạch bằng nước nóng.

 Phủ trên các hạt này một lớp bông thấm nước

 Thanh trùng hạt ở 1210C trong 40 phút.

 Nấu hạt ngũ cốc.

 Cấy giống vi sinh vật trên lớp bông cho mọc thật dầy.

 Hằng ngày lắc nhẹ.

 Thanh trùng 3 lần, mỗi lần cách nhau 24h.

 Gắn paraffin.

 Giữ ở nhiệt độ 15 – 200C.

 Sau 8 – 10 ngày kiểm tra lại.

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Giữ giống trên giấy lọc:

 Bảo quản các vi sinh vật có bào tử.

Thời gian bảo quản nhiều năm.

Clostridium

 Giấy lọc cắt miếng 1-3 cm. Cho vào ống nghiệm.

Cách làm

 Đậy nút bông, thanh trùng ở 1210C, 1 giờ.

 Sấy ở 1000C, 3 giờ.

 Cho vào mỗi miếng giấy lọc 1 giọt vi khuẩn. Nuôi thêm 2 – 3 ngày.

 Vi sinh vật nuôi trong 3 – 5 ngày để có bào tử.

 Phủ paraffin đặc đun chảy lên nút bông.

 Để tủ lạnh hoặc nơi mát.

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Giữ giống trên các miếng gelatin:

• Môi trường gelatin:

Yersina

 nước thịt + 10% gelatin + 5% inosit

 nước thịt + 10% gelatin + 0,25% acid ascorbic.

• Nhỏ môi trường chứa vi sinh vật lên giấy nến trong hộp petri.

• Sấy khô trong tủ hút chân không, dùng P2O5 hấp thụ nước.

• Cho vi sinh vật vào môi trường. Nuôi một thời gian.

• Bỏ trong ống nghiệm.

• Giữ ở 50C.

• Khi sử dụng nuôi trong broth thích hợp. Cấy vào agar, chọn khuẩn lạc.

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp lạnh đông:

 Phương pháp làm đơn giản

 Cách làm:

 Vi sinh vật giữ được lâu

Sarcina

 Trộn vi sinh vật và các chất bảo vệ vào lẫn với nhau

 Chất bảo vệ:

 Cho vào ống nghiệm, làm lạnh từ từ.

 glycerin 10% + geletin 1% + pH trung tính

 saccharose 10% + geletin 1% + pH trung tính

 dung dịch glucose 10%,

 huyết thanh ngựa + geletin 1% + pH trung tính

 dung dịch lactose 10%).

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

 Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 150C – (-) 200C : 6 tháng cấy truyền một lần.

 Nếu nhiệt độ trữ lạnh là (-) 300C : 9 tháng cấy truyền một lần.

 Nếu nhiệt độ trữ lạnh là (-) 400C : 1 năm cấy truyền một lần

 Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 500C – (-) 600C : 3 năm cấy truyền một lần

Phƣơng pháp lạnh đông:

E. coli

 Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 700C – (-) 600C : 10 năm cấy truyền một lần

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp đông khô:

 Làm cho tế bào mất nước theo phương pháp thăng hoa ở áp suất thấp.

 VSV không bị biến đổi về các đặc tính di truyền

 Thời gian lưu giữ lâu lên tới vài chục năm.

 Đuợc dùng nhiều trong sản xuất.

Nấm men

 Làm giảm hoặc làm ngừng hẳn quá trình phân chia của vi sinh vật.

II. PHƢƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT

Phƣơng pháp đông khô:

 Sau khi nuôi cấy, vi sinh vật được trộn với chất bảo vệ,

 Phân vào ống nghiệm

 Cho vào chậu lạnh ở nhiệt độ (-)70 – (-)800C, trong 1 – 5 phút.

 Đưa vào thiết bị đông khô (p= 10-4Hg, 8 – 14 giờ ).

 Sau khi làm khô, độ ẩm còn 1 – 4%.

 Hàn kín ống nghiệm khô.

 Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Vibrio

 Kiểm tra lại hàm lượng ẩm bằng giấy tẩm CoCl2 3%.