Báo cáo: Microarays

Chia sẻ: Ngô Thị Thảo Ngân | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:31

Thêm vào BST

Báo xấu

61
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Báo cáo: Microarays giới thiệu lịch sử của phương pháp Microarays, khái niệm Microarays, cấu tạo và phân loại Microarays, nguyên lý, quá trình thực hiện DNA Microarays và các tiến hành.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo: Microarays

Kỹ thuật miccroarray TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG Báo cáo seminar: MICROARAYS Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Thị Dung Nhóm sinh viên thực hiện: 1.Phùng Văn Dũng 61303045 2.Nguyễn Võ Kỳ Duyên 61303052 3. Cao Chí Thủy Tiên 61303328 1
Kỹ thuật miccroarray MỤC LỤC 1.I. Đặt vấn đề 1.II. Giới thiệu lịch sử của phương pháp Microarray 1.III. Khái niệm về Microarray 1.IV. Cấu tạo và phân loại Microarray 1.V. Nguyên lý 1.VI. Qúa trình thực hiện DNA Microarray 1.VII. Cách tiến hành 2
Kỹ thuật miccroarray 1.VIII. Ứng dụng 1.IX. Kết luận 1.X. Câu hỏi trắc nghiệm 1.XI. Tài liệu tham khảo I. Đặt vấn đề Trừ một vài ngoại lệ thì mọi tế bào trong cơ thể đều chứa hệ gen đồng nhất và bộ nhiễm sắc thể đầy đủ.Chỉ một phần nhỏ những gen này được bật,tuy nhiên,nó biểu thị những thuộc tính đặc trưng của mỗi loại tế bào.Sự biểu hiện gen là một quá trình chặt chẽ và phức tạp cho phép tế bào trả lời những kích thích của môi trường và những nhu cầu thay đổi của chính mình.Cơ chế này đóng cả hai vai trò bật và tắt của sự chuyển đổi để kiểm soát thông tin của những gen nào được biểu hiện trong một tế bào để có thể tăng cường hoặc giảm bớt sự biểu hiện của các gen.Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của gen trong một thí nghiệm giản đơn và hiệu quả.. 3
Kỹ thuật miccroarray Trong quá khứ, các nhà khoa học chỉ có thể tiến hành các phân tích di truyền của một vài gen cùng một lúc. Với sự phát triển của kỹ thuật microarrays các nhà khoa học giờ đây có thể kiểm tra hàng ngàn gen hoạt động như thế nào, ở bất kỳ thời điểm nào. Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người. II. Giới thiệu lịch sử của phương pháp Microarray Còn quá sớm để nói về lịch sử của DNA microarray vì kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ. Đầu tiên phải kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy DNA có thể bị biến tính, phân tách thành hai mạch đơn khi xử lý bằng nhiệt hoặc dung dịch kiềm. Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai phân tử. Điều này gợi ra cách phân tích mối liên hệ trình tự của axit nucleic và các phương pháp phân tích dựa trên lai phân tử phát triển nhanh chóng. Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson đã tìm ra phương pháp lai in situ có sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang, FISH. Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính (sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò) ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray. Vào thời 4
Kỹ thuật miccroarray gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979. Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một bộ lọc hay màng theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra. Với kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên vật đỡ và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu). Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu. Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991). Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu. Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng hợp in situ. Năm 1994, Hoheisel và cộng sự tăng mật độ chấm (spot) bằng cách dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể. Phương pháp tự động hoá này làm tăng tốc độ quá trình, giảm các sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí, tăng tính đồng hình của các spot mẫu. 5
Kỹ thuật miccroarray Hình 1: Quá trình phát triển của kĩ thuật di truyên Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay. Người ta đánh giá rằng, kỹ thuật này có thể sẽ phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh học hiện nay. III. Khái niệm về Microarray Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của nhiều gen trong một thí nghiệm đơn giản và hiệu quả.Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người. 6
Kỹ thuật miccroarray Nói về microarray, hiện nay đa số ai cũng liên tưởng đến DNA microarray vì kỹ thuật này đã được biết đến từ cuối thập niên 80, do nhóm khoa học dưới sự chủ trì của tiến sĩ Stephen P.A. Fodor phát minh. Sau đó được hãng Affymetrix (Mỹ) phát triển và phổ biến rộng khắp ở Mỹ và thế giới. Protein microarray mới chỉ bắt đầu được để ý trong khoảng vài năm trở lại đây và chưa phổ biến như DNA microarray. Mỗi điểm trên một microarray chứa nhiều sợi giống hệt nhau của DNA.Trình tự DNA trên mỗi điểm là duy nhất.Hàng ngàn điểm được dàn trận trong hàng và cột trật tự trên một bề mặt rắn (thường là thủy tinh). Vị trí chính xác và trình tự của từng vị trí được ghi lại trong một cơ sở dữ liệu máy tín. Mỗi vị trí đại diện cho một gen. IV. Cấu tạo và phân loại Microarray 1. Cấu tạo DNA microarray hay còn gọi là DNA chip, được chế tạo trên bề mặt thủy tinh hoặc nylon hoặc silicone. Trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất . Bằng kĩ thuật tự động tốc độ cao, gồm vô số các probe (đoạn dò) đã biết trước trình tự. Probe để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo mục đích sử dụng, có thể là oligonucleotide ngắn (1525 nucleotide), oligonucleotide dài (50120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 1003000 bp) các chấm trên 7
Kỹ thuật miccroarray microarray thường có đường kính 200 μm và cần thiết bị hiện ảnh đặc biệt như máy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner). Các phương pháp mới đây có thể tạo ra đường kính chấm 100 μm và nếu dùng phương pháp in quang hoạt (photolithography) để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra chấm có đường kính 20 μm. Hình 2: kích thước cDNA 2. Phân loại a. Theo mật độ mẫu dò (mật độ thấp,cao,vừa) b. Theo loại mẫu dò (cell array, glycan array,DNA array,protein array…. 8
Kỹ thuật miccroarray V. Nguyên lý Dựa trên cơ sở kĩ thuật lai axit nucleic. Trong đó một mảnh DNA đã biết được sử dụng làm mẫu dò để tìm kiếm trình tụ bổ sung của nó. Mẫu dò được cố định trên một giá thể rắn (thủy tinh, nylon, silicone). Một hỗn hợp lỏng chứa các DNA và RNA cần dò tìm được cho chạy qua giá thể rắn. Ở điều kiện lý tưởng các axit nucleic có trình tự bổ sung sẽ bắt cặp chính xác với nhau. Trước đó mẫu DNA hay RNA đã được đánh dấu bằng : đồng vị phóng xạ , chất phát huỳnh quang . . .Khi quan sát dưới máy dò tìm đặc hiệu dễ dàng nhận diện cặp mẫu dò nào đã gắn với mẫu DNA hay RNA nào. VI. Qúa trình thực hiện DNA Microarray Hình 3: Sơ đồ thực hiện kỹ thuật microarray Qúa trình thực hiện DNA microarray gồm hai bước chính : 1. Chế tạo mảng Cơ chất dùng để chế tạo mảng cần có các tính chất sau: gắn ổn định với mẫu dò, tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hoá học bề mặt đồng nhất và chất lượng dữ liệu cao . Một số chất đáp ứng được những điều kiện này và thường được sử dụng là thuỷ tinh, 9
Kỹ thuật miccroarray polypropylene, hoặc silicon , trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất . Giá thể thường được biến đổi hoá học để dễ dàng gắn với mẫu dò. Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó polymerase lysine, amino silance hoặc silance có gốc amin hoạt hoá để tăng tính kỵ nước và khả năng bám dính của mẫu dò . Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò. Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo mục đích sử dụng. Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở dữ liệu giúp đơn giản hoá công đoạn này. Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể là oligonucleotide ngắn (1525 nucleotide), oligonucleotide dài (50120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100 3000 bp) . Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên bề mặt mảng bằng hai cách:  cố định (cDNA) Hình 4: Mẫu dò cDNA  tổng hợp in situ (oligonucleotide). Hinh 5: Mãu dò tổng hợp insitu 10
Kỹ thuật miccroarray Cách thứ nhất thường sử dụng robot với các kỹ thuật in kim (contacttip deposition printing), in vi tiếp xúc (microcontact printing (μCP)), in vi kênh (microfluidics networks (μFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã tổng hợp từ trước lên mảng. Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng dụng cách hai. Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing (μWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ. In kim (Contacttip deposition printing):Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA. Đầu tiên người ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó. Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất ,Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc . Hình 6: Sản xuất DNA microarray sử dụng contact tip deposition printing 11
Kỹ thuật miccroarray Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung dịch. Phương pháp này có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000 cDNA khác nhau có kích thước từ 500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6 cm2 . In vi tiếp xúc (μCP Microcontact printing): Phương pháp μCP có nguyên lý tương tự in kim. Trong đó, dùng “con dấu” polydimethysilane (PDMS) để chuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể .Trên thực tế, kỹ thuật này không sản xuất thành công các mảng mật độ cao . Hình 7: Sản xuất DNA array sử dụng microcontact printing In vi kênh ( FN Microfludics network) FN là kĩ thuật CP cải tiến. Trong đó con dấu PDMS có các kênh nhỏ được đặt trên thủy tinh, vàng, polystyrene hoặc bề mặt silicone/silicone dioxide. Dung dịch cơ chất chứa đầy trong những kênh này được gắn lên bề mặt mảng bởi sức hút mao quản. Hình 8: Sản xuất mảng bằng kỹ thuật µFN Giống như CP, tính khả thi của FN để sản xuất các DNA arrray đang được chứng minh. 12
Kỹ thuật miccroarray In mạ (Electro capture) Các aray này giống như một con chíp silicone. Gía thể ở đây là silicone có lớp bề mặt bị oxi hóa bởi nhiệt độ. Những vị trí xác định trên bề mặt này có các điện cực platin dày 500nm. Sau đó tiến hành một loạt các biến đổi hóa học có thứ tự để tạo ra chip gồm nhiều lớp. Toàn bộ chíp trừ phần không gian của bộ cực platin được phủ lớp lưỡng điện (dielectric) Si3N4 dày 2mm, bằng cách này có thể thao tác với điện cực từ trên xuống trong khi xung quanh nó được bảo vệ bởi lớp Si3N4. Trên cùng của chíp là lớp – streptavidinagarose giúp cố định các phân tử axit nucleic đã biotin hóa. Hình 9: In mạ Gắn mẫu dò lên chip bằng cách phủ lên bề mặt dung dịch chứa các oligonucleotide đã biotin hóa. Chúng được vận chuyển đặc hiệu tới các chấm chứa streptavidin bằng cách cho dòng điện lần lượt chạy qua mỗi điện cực. Hiện tại, chíp với trên 400 điện cực đang phát triển trong các phân tích di truyền. In quang hoạt (Photolithography) 13
Kỹ thuật miccroarray Công ty Sffymetrix đã phát triển phương pháp in quang hoạt để tổng hợp oligonucleotide in situ trên giá thể rắn. Qúa trình này dựa trên kỹ thuật công nghiệp bán dẫn. Đầu tiên, gắn các phân tử có nhóm bảo vệ dễ phân hủy bởi tia cực tím trên bề mặt giá thể rắn. Dùng mặt nạ để hoạt hóa chọn lọc các vị trí trên bề mặt bằng tia cực tím nhằm loại trừ nhóm bảo vệ nhạy sáng tại đó. Sau đó ủ với các nucleotide để chúng phản ứng với nhóm OH tự do tại bề mặt những vùng đã hoạt hóa, kết thúc một chu kỳ. Lập lại kỳ trên với mặt nạ và nucleotide khác sẽ tạo ra một “bãi chông” dày đặc các oligonucleotide có trình tự bất kỳ tại những vị trí xác định trên cơ chất. Hiện tại, có thể gắn hơn 500.000 oligonucleotide khác nhau trên diện tích 1,28x1,28cm. Hình 10: Sơ đồ phương pháp in quang hoạt In áp điện (Piezoelectric printing) In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân phối lượng nhỏ dung dịch DNA thay vì mực in bình thường. Đầu áp điện tạo ra các giọt trên đầu phân phối. Hiện tại có thể dùng phương pháp này để tạo ra các mảng có trên 10.000 chấm/cm2. Hình 11: Sơ đồ ống phun áp điện. Đơn vị sử dụng trong hình.|U|: giá trị tuyệt đối của điện áp 14
Kỹ thuật miccroarray Hình 12: Tổng hợp oligonucleotide in situ sử dụng ống phân phối áp điện. Thủ tục nhiều ống phun. DMTr: nhóm phát hiện dimethoxytrityl, DTR: chất khử trityl hoá Cũng có thể dùng kỹ thuật này để chế tạo các mảng oliigonucleotide bằng cách dùng 5 đầu phân phối áp điện khác nhau (mỗi đầu chứa một loại phân tử phosphoramidite nucleotide cần để tổng hợp oligonucleotide, đầu thứ năm chứa chất khử triyn hóa) In vi lỏng ( WP – Micro wet printing) Kỹ thuật này được Emantraut và cộng sự (1998) phát triển, dùng hộp mực in khung silicon để định vị mặt nạ chắn trên bề mặt mảng. Khung silicon kết hợp với đường ống phân phối thủy tinh tạo thành hệ thống kênh. Kênh này sẽ liên kết các đường vào riêng biệt với mặt nạ trong hộp mực. Mặt nạ đóng vai trò giao tuyến của hộp mực và bề mặt mảng đảm bảo chỉ một số vùng nhất định được tiếp xúc với hộp mực chứa chất khử nhóm bảo vệ. Khi dung dịch oligonucleotide và dung dịch rửa đi qua chỗ khử nhóm bảo vệ trên bề mặt, mặt nạ bị tách đi kết thúc một chu 15
Kỹ thuật miccroarray kỳ . Tiếp tục chu kỳ mới ở đó thay đổi các nucleotide thêm vào vị trí mặt nạ, ta sẽ tổng hợp được các oligonucleotide ngắn tại những vị trí xác định trên cơ chất. Hệ thống này cũng có thể được sử dụng để cố định các oligonucleotide và các chất khác như protein hoặc kháng thể. Hình 13: Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật in vi lỏng 2. Tiến hành thí nghiệm 16
Kỹ thuật miccroarray a) Chuẩn bị mẫu Hiệu quả phân tích bằng microarray phụ thuộc đáng kể vào khâu chuẩn bị mẫu. Mẫu để lai có thể là DNA hoặc RNA được đánh dấu nhằm mục đích phát hiện trực tiếp chúng sau khi lai. Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp đánh dấu khác nhau được phát triển nhằm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm. Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của các nhóm hoạt động hóa học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích. Các chất chỉ thị phát hiện có thể là chất phát huỳnh quang (Cy3/Cy5, streptavidin/phycoerythrin), chất phóng xạ (32P, 33P, 35S), chất phát huỳnh quang (Chemiluminescent) như digoxigenein, 17
Kỹ thuật miccroarray biotin và nhuộm vàng/bạc. Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất. Hình 14: Sơ đồ đánh dấu mẫu dò dùng Cy3/Cy5 b) Tiến hành lai Sau khi đánh dấu , tiến hành lai trên mảng. Do sử dụng chất mảng rắn nên phương pháp microarry dễ tiến hành hơn các phương pháp blot. Trong quá trình lai, cho dung dịch đích đã đánh dấu đi qua mảng. Ở đó mẫu dò bắt cặp bổ sung (nếu có) với đích. Nếu dùng chất mảng thủy tinh, có thể úp một phiến kính thủy tinh lên trên sau đó cho dung dịch đích đi qua khe trống giũa chúng bởi lực mao dẫn. Một cách đơn giản khac là đặt trực tiếp mảng trong bể nhỏ chứa dung dịch lai. Các điều kiện lai (như nồng độ mẫu, lực ion, nhiệt độ) phụ thuộc lớn vào kích thước mẫu dò trên mảng và phải được xác định cho từng thí nghiệm. Hiệu quả lai có thể tăng lên nếu dung dịch lai luôn ở trạng thái động so với bề mặt mảng. c) Xác định và phân tích tín hiệu lai Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ đích không bắt cặp hoặc bắt cặp không đặc hiệu với mẫu dò. Tiếp đó dùng thiết bị hiện ảnh xác định tín hiệu lai do chất đánh dấu trên đích phát ra. Cường độ tín hiệu cho phép đánh giá tương đối hiệu quả bắt cặp giữa đích và mẫu dò. Điều đáng nói ở đây là lượng dữ liệu cần phân tích trong 18
Kỹ thuật miccroarray thí nghiệm microarray rất lớn do trên mảng có thể đặt hàng chục ngàn mẫu dò. Tương ứng với nó là hàng chục ngàn tín hiệu, trong đó lại có những tín hiệu nhiễu vì nhiều nguyên nhân. Do đó cần có các phần mềm máy tính để chuẩn hóa dữ liệu, đơn giản hóa quá trình phân tích nhằm đưa ra các kết luận nhanh và chính xác. Các bước chuyng khi tiến hành kỹ thuật microarray là như vậy nhưng vì có hai loại mảng ứng với mẫu dò là cDNA và oligonucleotide nên có đôi chút khác nhau khi sử dụng chúng. Hình 15: Hiệu quả lai khác nhau tạo ra các tín hiệu màu khác nhau trên mảng.  Màng chứa mẫu dò cDNA Trong hầu hết các thí nghiệm microarray thông thường, mảng được tạo ra từ mẫu dò cDNA có kích thước tương đối lớn sẽ lai với mRNA từ hai mẫu khác. Sau khi lai, tỷ lệ tín hiệu phát huỳnh quang của mỗi chấm sẽ phản ánh mức độ chiếm ưu thế của sản phẩm phiên mã, trực tiếp nói lên các đáp ứng liên quan tới điều kiện nghiên cứu. Ưu điểm o Rẻ, có thể tự chế tạo. o Cho kết quả tốt với những gen chưa biết trình tự. 19
Kỹ thuật miccroarray o Độ dài mẫu dò lớn (xấp xỉ 2x103 bp) xuất phát từ mẫu tham khảo thực tế nên tăng tính đặc hiệu. o Tính đặc hiệu cao. Nhược điểm o Tính tái sử dụng kém – mỗi phiến kính là duy nhất, luôn phải có mẫu đối kính cho mỗi phiến kính . o Cấu trúc bậc hai của cDNA làm giảm hiệu quả lai hoặc gây ra hiện tượng lai chéo. o Không phân biệt được các gen liên quan gần va các gen khác nhau một nucleotide. o Sự đan xen giữa hai kênh màu tạo ra nhiễu. Hơn nữa, hai loại chất phát huỳnh quang khác nhau sẽ luôn tạo ra hiệu quả lai khác nhau. Do đó, cần phải chuẩn hóa dữ liệu. o Không có khả năng định lượng. o Cần lượng lớn đích.  Màng chứa mẫu dò oligonucleotide Các con chíp tổng hợp in situ này có thể chứa đến 6.500 gen khác nhau, mỗi gen được đại diện bởi ít nhất một tập hợp của xấp xỉ 20 cặp mẫu dò khác nhau. Do phương pháp này không sử dụng mẫu đối chứng và 20