báo cáo y học: "Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm elisa phát hiện nọc của bốn loài rắn độc thường gặp ở việt nam và ứng dụng chẩn đoán rắn độc cắn trên mô hình thực nghiệm"

Chia sẻ: Nguyễn Lê | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

120
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Lần đầu tiên tại Việt Nam chúng tôi đã chế tạo thành công bộ kít ELISA phát hiện được nọc của bốn loài rắn độc thường gây tai nạn rắn cắn tại Việt Nam: Lục xanh (Trimeresurus albolabris), Chàm quạp (Calloselasma rhodostoma), Hổ đất (Naja kaouthia) và Hổ chúa (Ophiophagus hannah). Xét nghiệm có khả năng phát hiện nọc độc trong các loại dịch sinh học khác nhau bao gồm máu toàn phần, huyết thanh, huyến tương, nước tiểu và dung dịch đệm với độ nhạy đạt mức nanogram. Trên mô hình gây nhiễm độc nọc rắn thực nghiệm, xét...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: báo cáo y học: "Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm elisa phát hiện nọc của bốn loài rắn độc thường gặp ở việt nam và ứng dụng chẩn đoán rắn độc cắn trên mô hình thực nghiệm"

Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm elisa phát hiện nọc của bốn loài rắn độc thường gặp ở việt nam và ứng dụng chẩn đoán rắn độc cắn trên mô hình thực nghiệm Đỗ Khắc Đại* Đỗ Minh Trung* Nguyễn Đặng Dũng* Lê Văn Đông Tóm tắt Lần đầu tiên tại Việt Nam chúng tôi đã chế tạo thành công bộ kít ELISA phát hiện được nọc của bốn loài rắn độc thường gây tai nạn rắn cắn tại Việt Nam: Lục xanh (Trimeresurus albolabris), Chàm quạp (Calloselasma rhodostoma), Hổ đất (Naja kaouthia) và Hổ chúa (Ophiophagus hannah). Xét
nghiệm có khả năng phát hiện nọc độc trong các loại dịch sinh học khác nhau bao gồm máu toàn phần, huyết thanh, huyến tương, nước tiểu và dung dịch đệm với độ nhạy đạt mức nanogram. Trên mô hình gây nhiễm độc nọc rắn thực nghiệm, xét nghiệm có khả năng phát hiện nọc độc trong 20/20 (100%) số mẫu máu chuột gây độc với liều 2 LD50 và 15/20 (75%) số mẫu máu chuột gây độc với liều 0,5 LD50 nọc độc của các loài rắn nghiên cứu. Không thấy có phản ứng dương tính giả xuất hiện ở cả 5/5 mẫu chứng âm. Kết quả cho thấy bộ xét nghiệm có khả năng phát hiện nọc độc ở các đối tượng có nhiễm nọc độc toàn thân và tại chỗ, có thể đem ra ứng dụng thử nghiệm với các mẫu bệnh phẩm lấy từ người bị rắn cắn. * Từ khoá: Rắn độc cắn; Xét nghiệm ELISA; Kít phát hiện nọc rắn.
Development of ELISA for detection of venoms of the four common venomous snakes in vietnam and application in experimental snakebite diagnosis Do Khac Dai Do Minh Trung Nguyen Dang Dung Le Van Dong SUMMARY We have successfully, for the first time in Vietnam, developed a snake venom detection kit for the identification of venoms of the four common venomous snakes in Vietnam viz. Green pit Viver (Trimeresurus albolabris), Malayan pit Viper
(Calloselasma rhodostoma), common Cobra (Naja kaouthia) and king Cobra (Ophiophagus hannah). The kit can detect snake venom in different sample types including whole blood, serum, plasma, urine and sample buffer with the sensitivity of nanogram levels. In the experimental envenoming model, the kit can detect venom in 20/20 blood samples taken from animal injected with 2 LD50 of the venoms; 15/20 blood samples taken from animal injected with 0.5 LD50 of the venoms; none of 5 negative control show fault positive results. These data show that this venom detection kit can detect venoms in systemically as well as locally envenomed animals, and can be potential in testing with snakebite human samples. * Key words: Snakebite; ELISA; Snake venom detection kit.
* Học viện Quân y Phản biện khoa học: TS. Hoàng Công Minh vừa để ngăn ngừa các tổn Đặt Vấn đề Rắn cắn là một tai nạn thương do nọc độc làm thường gặp ở các nước ảnh hưởng đến chức vùng nhiệt đới, tập trung năng lao động và thẩm ở các đối tượng bắt và mỹ của nạn nhân sống nuôi rắn, nông dân, công sót sau tai nạn [2, 10]. nhân lâm trường, bộ đội ở nước ta, theo thống thực hành huấn luyện và kê của Bệnh viện Chợ tác chiến trong điều kiện Rẫy, Thành phố Hồ Chí dã ngoại... Đây là một Minh, năm hàng có cấp cứu cần phải được khoảng 600 - 1000 nạn xử trí kịp thời, vừa để nhân bị rắn cắn đến cấp cứu tính mạng nạn nhân, cứu và điều trị, trong đó
hay gặp nhất là: Lục xanh tại Bệnh viện Bạch Mai, (Trimeresurus albolabris), Bệnh viện Chợ Rẫy, quạp Bệnh viện Nhi đồng 1 Chàm Thành phố Hồ Chí Minh, (Calloselasma Hổ đất Khoa Cấp cứu rắn độc rhodostoma), (Naja kaouthia) và Hổ cắn thuộc Trại rắn Đồng chúa (Ophiophagus Tâm, Quân khu 9. Tuy hannah) [3, 4]. Hiện nay, nhiên, điều quan trọng các cơ sở trong nước như trong cấp cứu và điều trị Trung tâm chống độc cho những bệnh nhân bị Quốc gia và Viện Vắcxin rắn độc cắn, đặc biệt là Nha Trang, đã và đang khi dùng huyết thanh tiến hành chế tạo các loại kháng nọc rắn đơn giá, là huyết thanh kháng nọc cần xác định chính xác rắn đơn giá chống lại nọc loài rắn đã cắn bệnh nhân độc của từng loài rắn độc để xử trí cấp cứu đúng kể trên và đang áp dụng cách và sử dụng đúng vào điều trị trên lâm sàng loại kháng huyết thanh.
Xuất phát từ những vấn 1. Đối tượng và vật đề nêu trên, chúng tôi liệu nghiên cứu. tiến hành nghiên cứu này Bốn loại huyết thanh nhằm mục tiêu: kháng nọc rắn đơn giá - Nghiên cứu chế tạo của bốn loài rắn độc bộ xét nghiệm ELISA gồm: Lục xanh, Chàm phát hiện nọc của bốn quạp, Hổ đất và Hổ chúa loài rắn độc thường gặp được chế tạo và xác định ở Việt Nam. hiệu giá trong nghiên cứu - Đánh giá khả năng trước [1]. phát hiện nọc rắn độc ở Các hóa chất, sinh mô hình gây độc thực phẩm bao gồm: kít tách nghiệm trên động vật. chiết IgG bằng phương pháp sắc ký ái lực với protein A và kít định Đối tượng và phương lượng bằng protein nghiên cứu pháp phương pháp đo màu
(Bio-Rad, Hoa Kỳ); hạt phối chính thức cung sepharose 4B hoạt hóa cấp. bằng CNBr của hãng Chuột nhắt trắng (45 (Thụy con) khoẻ mạnh, trọng Armersham Điển); hóa chất lượng từ 18 - 22 gam do các DSMO, biotin-N- Ban cung cấp động vật hydroxy- succinimide thí nghiệm, Học viện ester, phức hợp avidin- Quân y cung cấp. enzym peroxidase, cơ Phương 2. pháp chất o- nghiên cứu. phenylenediamine * Tinh chế kháng thể: cơ chất (OPD), Kháng thể đặc hiệu với tetramethylbenzidine nọc rắn của từng loài rắn (TMB) của hãng Sigma được tách chiết và tinh (Hoa Kỳ). Các hóa chất sạch từ huyết thanh thỏ thông thường còn lại đến gây miễn dịch theo qui đạt tiêu chuẩn chất lượng trình tinh chế 3 bước phân tích do nhà phân
phối hợp sắc ký ái lực phân tử kháng thể phản với sắc ký miễn dịch: 1) ứng chéo giữa các loài tách chiết IgG từ huyết rắn bằng phương pháp thanh thỏ bằng sắc ký ái hấp phụ miễn dịch: lực với cột protein A; 2) kháng thể kháng nọc rắn tách chiết IgG đặc hiệu thu được ở bước 2 cho nọc rắn từ chế phẩm IgG chạy lần lượt qua các cột tổng số bằng sắc ký miễn chứa kháng nguyên nọc dịch với cột kháng rắn của 3 loài còn lại. nguyên protein nọc rắn: Sản phẩm thu được sau dung dịch kháng thể IgG hấp phụ miễn dịch được thu được từ huyết thanh coi là kháng thể đặc hiệu thỏ (gây miễn dịch với loài rắn. Kiểm tra hoạt từng kháng nguyên nọc tính của kháng thể thu rắn) cho chạy qua cột sắc được sau tinh chế và khả ký miễn dịch chứa kháng năng phản ứng chéo của nguyên nọc rắn tương chế phẩm kháng thể đặc ứng; và 3) loại bỏ các
hiệu loài bằng phương biotin được bảo quản ở - pháp ELISA gián tiếp 200C đến khi sử dụng. [1]. * Xét nghiệm ELISA * Gắn biotin vào kháng phát hiện nọc rắn: thể: Xây dựng xét nghiệm Trộn dung dịch biotin theo nguyên tắc phản ứng kiểu (biotin-N-hydroxy- ELISA succinimide ester, 2 sandwich (hình 1a). mg/ml trong DMSO) với Giếng gắn kháng thể dung dịch kháng thể (1,0 được dùng ngay để xét NaHCO3 nghiệm phát hiện nọc rắn mg/ml trong 0,1M, pH = 8,3) theo tỷ hoặc bảo quản ở 4°C lệ 1:8 về thể tích và ủ ở trong túi nilon gắn kín nhiệt độ phòng 4 giờ. cho đến khi sử dụng. Loại bỏ biotin còn dư * Kít ELISA chẩn đoán bằng phương pháp sắc ký rắn độc cắn: lọc gel. Kháng thể gắn
Sử dụng phiến ELISA loại 6 giếng gắn trên các giá đỡ để tiến hành chế tạo bộ xét nghiệm. Trong (a) đó, một giếng B làm chứng dương, 1 giếng C làm chứng âm và 4 giếng còn lại dùng để chẩn đoán phân biệt 4 loại nọc độc rắn (hình 1b). Kháng thể đặc hiệu loài rắn gắn (b) lên các giếng tương ứng. Qui trình xét nghiệm như Hình 1: Nguyên lý sau: phản ứng ELISA (a) và sơ đồ kit phát hiện nọc rắn (b).
Bước 1: chuẩn bị bộ các giếng. ủ 37oC trong - ELISA làm xét nghiệm 15 phút. gắn trên giá đỡ. Bước 5: rửa như - Bước 2: cho 100 ml bước 3. - mẫu thử (máu toàn phần Bước 6: thêm phức - có chống đông, huyết hợp enzym avidin-HRP tương, huyết thanh, nước vào mối giếng. ủ 37oC tiểu...) vào mỗi giếng từ trong 5 phút. D đến G, hai giếng đối Bước 7: rửa như - chứng cho dung dịch bước 3. kháng nguyên chuẩn. ủ - Bước 8: thêm cơ o 37 C trong 15 phút. chất màu. Mỗi giếng 100 - Bước 3: rửa 5 lần ml cơ chất OPD nồng độ bằng dung dịch rửa PBS- 0,5 mg/ml có bổ sung Tween. thêm 0,006% H2O2. Đọc - Bước 4: đưa kháng kết quả sau 5 phút. Cơ thể gắn biotin vào tất cả chất từ không màu
chuyển sang màu vàng. chứa nọc rắn tương ứng Hoặc đo cường độ quang với kháng thể đặc hiệu học ở bước sóng 450 nm loài rắn đã gắn trên giếng và phân tích kết quả. đó. Nhận định kết quả: xét - Có nhiều hơn 1 giếng nghiệm được coi là có trong 4 giếng (từ D đến giá trị khi giếng đối G) cho màu vàng hoặc chứng dương cho màu xanh: giếng nào cho màu vàng rõ, giếng đối chứng rõ nhất chứa nọc rắn âm không lên màu hoặc tương ứng với kháng thể có màu vàng nhạt. Kết đặc hiệu loài đã gắn trên quả nhận định như sau: giếng đó. - Chỉ 1 trong 4 giếng - Không có giếng nào (D đến G) cho màu vàng (từ giếng D đến giếng G) rõ rệt, còn các giếng khác lên mầu: có 2 khả năng. không màu hoặc màu + Mẫu xét nghiệm có nhạt: mẫu xét nghiệm đó nọc độc của 1 trong 4
loài rắn, nhưng nồng độ rắn Lục xanh, Chàm quá thấp dưới ngưỡng quạp, Hổ đất và Hổ chúa hiện của xét với nồng độ nọc tương phát nghiệm. đương với 0,5 LD50 của + Mẫu xét nghiệm có mỗi nọc rắn. Từ lô thứ chứa nọc độc của loài rắn năm đến lô thứ tám tiêm nào đó, không thuộc 1 nọc độc tương ứng của trong 4 loài rắn đang các loài rắn Lục xanh, Chàm quạp, Hổ đất và nghiên cứu. Hổ chúa với nồng độ nọc * Gây độc thực nghiệm tương đương với 2 LD50 chuột nhắt trắng với nọc của mỗi nọc rắn. Lô thứ rắn: chín là chứng âm, tiêm Chuột nhắt trắng được dung dịch NaCl 0,9%. chia thành 9 lô, mỗi lô 5 Pha nọc rắn trong NaCl con. Từ lô thứ nhất đến 0,9% và tiêm vào mặt lô thứ tư tiêm nọc độc ngoài đùi sau bên phải tương ứng của các loài của chuột. 30 phút sau
khi tiêm, lấy máu chuột, định sự có mặt của nọc sử dụng máu toàn phần độc. hoặc huyết tương để xác Kết quả nghiên cứu và bàn luận 1. Tinh chế kháng thể kháng nọc rắn đặc hiệu loài rắn. Kiểm tra tính đặc hiệu của mỗi chế phẩm kháng thể đặc hiệu với từng loài rắn bằng phương pháp ELISA. ủ các chế phẩm kháng thể đặc hiệu loài ở các nồng độ khác nhau với nọc độc của loài rắn đã dùng gây miễn dịch và nọc độc của các loài rắn còn lại.
Hình 2: Kết quả đánh giá tính đặc hiệu loài rắn của các chế phẩm kháng thể.
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009 Các chế phẩm kháng thể đặc hiệu loài rắn thu được phản ứng rất mạnh với nọc độc tương ứng. Tại nồng độ kháng thể cao trên 100 ng/ml vẫn có hiện tượng phản ứng chéo cho kết quả dương tính. Tuy nhiên, với các nồng độ này độ tương phản về mật độ quang học giữa cặp phản ứng đặc hiệu với phản ứng chéo rất lớn, cho phép coi các chế phẩm kháng thể thu được là kháng thể đặc hiệu loài rắn. 2. Độ nhạy của xét nghiệm ELISA và khả năng phát hiện nọc rắn trong các loại mẫu thử khác nhau trên in vitro. Độ nhạy của phản ứng ELISA nhận biết nọc độc rắn đã được xác định với từng loại dịch cơ thể là máu toàn phần, huyết tương, huyết thanh, nước tiểu và dung dịch đệm PBS. Nọc độc với nồng độ được pha loãng bậc hai trong các mẫu dịch sinh học kể trên của người khỏe mạnh không bị rắn cắn hoặc pha trong dung dịch đệm. Mỗi mẫu xét nghiệm tiến hành 3 17
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009 giếng song song (triplicate), sử dụng PBS làm đối chứng âm. Xác định giá trị giới hạn bằng giá trị trung bình cộng với 3 lần độ lệch chuẩn (mean + 3SD) của độ hấp phụ quang từ các mẫu chứng âm. Hình 3: Đường chuẩn biểu thị tương quan giữa mật độ quang học của xét nghiệm ELISA nhận biết nọc độc rắn ở các nồng độ khác nhau pha trong dung dịch PBS 1%. Bảng 1: Độ nhạy của phản ứng ELISA phát hiện nọc của bốn loài rắn trộn trong các loại dịch sinh học và dung dịch đệm khác nhau. 18
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009 Độ nhạy (ng/ml) Loại mẫu LCHH ục hà ổ ổ xa m đấ ch nh qu t úa ạp Máu 3,2 3, 1, 1, toàn 1,6 2 6 6 phần 0,8 0, 0, 0, Huyết 888 1,6 tương 0, 0, 0, 0, Huyết 848 8 thanh 1, 1, 3, Nước 6 6 2 19
t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 4-2009 tiểu 0, 0, 0, 8 4 4 Dung dịch đệm Kết quả trên cho thấy xét nghiệm có thể phát hiện nọc độc trong tất cả các mẫu thử và độ nhạy của phản ứng khác nhau ở mỗi loại dịch thể và loài rắn. Tuy nhiên xét nghiệm này có thể phát hiện nọc độc ở mức nanogram. Selvanayagam và CS (1999) thông báo lượng nọc độc của bốn loài rắn phổ biến ở ấn Độ trong các dịch sinh học dao động từ 0 - 479 ng/ml và trung bình 200 ng/ml [6]. Nồng độ nọc độc trong máu bệnh nhân phụ thuộc vào một số yếu tố, cả về lượng nọc rắn được tiêm vào cơ thể nạn nhân cũng như các yếu tố thuộc về bản thân người bệnh và các yếu tố cấp cứu, điều trị, thời gian lấy và loại mẫu xét nghiệm [6, 7, 9, 10]. Trong nghiên cứu này, độ nhạy của xét nghiệm đạt mức nanogram đối với các mẫu 20