Bảo tồn và nhân giống một số loại lan rừng quý hiếm của tỉnh Gia Lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 15<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> SỐ 06 NĂM 2019<br /> Bảo tồn và nhân giống một số loại lan rừng quý hiếm của<br /> tỉnh Gia Lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật<br /> KS.TRẦN THỊ THÚY, KS.NGÔ LÊ HỒNG DUYÊN<br /> Trung tâm Ứng dụng tiến bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Gia Lai<br /> <br /> <br /> 1. Đặt vấn đề Gia Lai). Các cụm lan được lựa chọn làm vật liệu<br /> ban đầu phải chứa nhiều chồi (giả hành), các chồi<br /> Lan rừng ở Gia Lai rất phong phú và nhiều<br /> khỏe mạnh, lá dày, không có dấu hiệu sâu bệnh.<br /> chủng loại. Trong đó Hoàng thảo (Dendrobium)<br /> là chi phổ biến và có giá trị về nhiều mặt. Tam 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> bảo sắc, Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch là - Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời<br /> ba loài lan rừng đẹp và quý hiếm thuộc chi gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và<br /> Dendrobium, nằm trong Sách đỏ Việt Nam. Ngày thể chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch,<br /> nay, do nạn phá rừng và khai thác quá mức, ba Tam bảo sắc: các chồi lan được rửa sạch dưới<br /> loại lan này đang mất dần trong tự nhiên. Vì thế vòi nước chảy, tách bỏ lá và vảy, sau đó rửa lại<br /> nếu không có những biện pháp bảo vệ và nhân với xà phòng loãng trong khoảng 5-10 phút để<br /> giống kịp thời, những loài lan này có nguy cơ loại bỏ các chất bẩn bám trên bề mặt. Cắt thành<br /> tuyệt chủng. các đoạn có chứa mắt ngủ dài từ 1,5-2cm và<br /> Hạt của hoa lan nói chung và của ba loại đưa vào tủ cấy vô trùng. Tiếp theo các mẫu cấy<br /> lan này nói riêng không có nội nhũ nên chỉ có được khử trùng bằng cồn (ethanol) 70o trong<br /> thể nảy mầm nếu có nấm cộng sinh thích hợp 60 giây, rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng.<br /> nên việc nhân giống trong tự nhiên hết sức khó Bố trí thí nghiệm khảo sát điều kiện vô mẫu sử<br /> khăn, nhân giống bằng keiky là phương pháp dụng NaOCl 5% để tiếp tục khử trùng ở các thời<br /> đang được sử dụng phổ biến hiện nay để nhân gian 10, 15 và 20 phút hoặc HgCl2 0,1% ở 5, 7 và<br /> giống các loại lan rừng nhưng hệ số nhân thấp. 10 phút. Tráng lại mẫu 3 lần bằng nước cất vô<br /> Nuôi cấy mô tế bào thực vật từ lâu đã được lựa trùng. Các mẫu sau khi khử trùng được cấy vào<br /> chọn là phương pháp hàng đầu để nhân giống môi trường nuôi cấy khởi đầu để đánh giá hiệu<br /> các loại cây quý hiếm, khó nhân giống ngoài tự quả khử trùng. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu<br /> nhiên nhưng vẫn cho số lượng cây giống lớn hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại. Mỗi lần<br /> trong thời gian ngắn và giữ nguyên được những lặp lại 5 mẫu/loài/công thức.<br /> đặc tính quý của các cây bố mẹ. Việc nhân giống Các chỉ tiêu theo dõi:<br /> thành công các loại lan rừng quý hiếm bằng (số mẫu sạch)<br /> phương pháp nuôi cấy mô sẽ góp phần bảo tồn Tỷ lệ mẫu sạch (%) = ——————— x 100<br /> các loại lan rừng quý hiếm, đáp ứng nhu cầu thị (tổng số mẫu)<br /> trường đồng thời giảm áp lực khai thác quá mức (số mẫu tái sinh)<br /> các loại lan này trong tự nhiên. Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = ——————— x 100<br /> (tổng số mẫu)<br /> 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> - Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa<br /> 2.1. Vật liệu sinh trưởng BA và Kinetin đến khả năng tạo<br /> Các chồi lan rừng được thu hái tại Vườn cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch<br /> quốc gia Kon Ka Kinh (huyện Mang Yang, tỉnh và Tam bảo sắc: các chồi lan 4 tuần tuổi ở môi<br /> 16 KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT<br /> trường nuôi cấy khởi động được chuyển sang Tất cả các môi trường nuôi cây được sử<br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> các môi trường nhân nhanh chồi. Thí nghiệm dụng môi trường cơ bản là Knuds, bổ sung<br /> được bố trí 2 yếu tố theo kiểu hoàn toàn ngẫu 20g/l saccarose + 100ml/l nước dừa + 0,5g/l<br /> nhiên với 4 lần lặp lại (yếu tố A gồm 3 nồng độ than hoạt tính + 7g/l agar và các chất kích thích<br /> BA ký hiệu như sau: B1: 0 mg/L, B2: 0,1 mg/L, B3: sinh trưởng khác nhau tùy thuộc vào từng giai<br /> 0,3 mg/L; yếu tố B gồm 3 nồng độ Kinetin được đoạn nuôi cấy, riêng đối với môi trường tạo cum<br /> ký hiệu như sau: K1: 0 mg/L, K2: 0,1 mg/L, K3: chồi bổ sung 0,2 mg/l NAA. Môi trường được<br /> 0,3 mg/L).Mỗi lần lặp lại 5 mẫu/loài/công thức. điều chỉnh pH=5,8, khử trùng ở 121oC, áp suất<br /> Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của 1atm trong 20 phút. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt<br /> chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA kết hợp độ 25oC, cường độ ánh sáng 2000 lux; thời gian<br /> với Kinetin lên khả năng tạo cụm chồi lan Hạc chiếu sáng: 10 giờ/ngày.<br /> vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc 3. Kết quả và thảo luận<br /> BA (mg/L) 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời<br /> 0 0,1 0,3 gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và<br /> Kinetin (mg/L)<br /> tái sinh của lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch<br /> 0 B1K1 B2K1 B3K1<br /> và Tam bảo sắc<br /> 0,1 B1K2 B2K2 B3K2<br /> Các đoạn chồi lan sau khi được khử trùng<br /> 0,3 B1K3 B2K3 B3K3<br /> bằng dung dịch HgCl2 0,1% và NaClO 5% ở các<br /> thời gian khác nhau được cấy vào môi trường<br /> Các chỉ tiêu theo dõi: nuôi cấy khởi động. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết<br /> (Số chồi hình thành) quả quá trình thực nghiệm được trình bày tại<br /> HSN chồi (%) = —————————— x 100 bảng 3.1.<br /> (Số chồi ban đầu)<br /> Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng<br /> Hình thái chồi và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu<br /> - Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sạch và tái sinh của lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc<br /> sinh trưởng NAA đến khả năng tạo cây lan in thạch, Tam bảo sắc<br /> vitro hoàn chỉnh: Các chồi invitro của lan Hạc vỹ, CTTN<br /> Chất khử<br /> Thời gian Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu tái sinh (%)<br /> khử trùng Hạc Hoàng thảo Tam bảo Hạc Hoàng thảo Tam bảo<br /> trùng<br /> Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc đủ 2-3 lá NaClO 5%<br /> (phút) vỹ ngọc thạch sắc vỹ ngọc thạch sắc<br /> KT1 10 16,67 13,33 10 16,67 13,33 10<br /> thật, cao 2-3cm được chuyển sang môi trường KT2 15 63,33 60 60 60 56,67 60<br /> <br /> tạo rễ với nồng độ NAA theo thí nghiệm (Bảng KT3<br /> KT4 HgCl2 0,1%<br /> 20<br /> 5<br /> 66,67<br /> 33,33<br /> 63,33<br /> 36,66<br /> 60<br /> 30<br /> 46,67<br /> 30<br /> 46,67<br /> 30<br /> 43,33<br /> 30<br /> 2.2). Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn KT5 7 86,67 83,33 80 60 56,67 56,67<br /> KT6 10 93,33 90 90 23,33 23,33 26,67<br /> ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại 10<br /> mẫu/công thức. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm Tỷ lệ mẫu sạch ở tất cả các công thức thí<br /> số rễ trung bình (rễ/ chồi), chất lượng rễ. nghiệm đều tăng khi thời gian khử trùng tăng.<br /> Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng Đối với nhóm công thức khử trùng với HgCl2<br /> của chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA lên 0,1% đạt cao nhất đối với lan Hạc Vỹ 93,33% với<br /> khả năng tạo cây lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thời gian khử trùng 10 phút, đối với nhóm công<br /> thạch, Tam bảo sắc in vitro hoàn chỉnh thức NaClO 5% đạt tỷ lệ cao nhất là 66,67% khi<br /> khử trùng Hạc vỹ. Tuy nhiên khi sử dụng các<br /> Nồng độ NAA<br /> STT Ký hiệu công thức chất khử trùng thời gian càng dài thì tỷ lệ mẫu<br /> (mg/L)<br /> 1 N1 0 tái sinh càng giảm, điều này có thể thấy rõ nhất<br /> 2 N2 0,2 khi sử dụng HgCl2 0,1% để khử trùng trong thời<br /> 3 N3 0,5 gian 10 phút (tỷ lệ mẫu tái sinh ở cả ba loại lan<br /> 4 N4 0,7 đều dưới 30% dù tỷ lệ mẫu sạch trên 90%). Căn<br /> 5 N5 1 cứ vào kết quả trên có thể chọn công thức khử<br />  KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 17<br /> trùng là HgCl2 0,1% trong 7 phút và NaClO 5% năng ra rễ đối với 3 loại lan Hạc vỹ, Hoàng thảo<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> SỐ 06 NĂM 2019<br /> trong 15 phút. ngọc thạch, Tam bảo sắc, chúng tôi nhận thất ở<br /> Ở đây cũng có thể thấy sự chênh lệch về công thức N3 có bổ sung 0,5mg/l NAA cho số<br /> tỷ lệ mẫu sạch của ba loại lan khi sử dụng cùng rễ nhiều nhất là từ 3,95 - 4,08 rễ/ chồi, và chiều<br /> một chất khử trùng ở thời gian giống nhau. dài rễ trung bình lớn nhất từ 3,2 - 3,25cm. Tuy<br /> Hạc vỹ là loại lan thu được tỷ lệ mẫu sạch lớn nhiên ở các công thức thí nghiệm bổ sung NAA<br /> nhất, lý do là do cấu tạo hình thái của chồi (giả nhiều hơn hoặc ít hơn thì cây có số lượng rễ ít<br /> hành) khác nhau của ba loại lan, dẫn đến hiệu hơn và chiều dài rễ cũng ngắn hơn.<br /> quả khử trùng khác nhau. Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa<br /> 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh sinh trưởng thực vật NAA lên khả năng tạo cây<br /> trưởng thực vật BA kết hợp với Kinetin lên khả lan in vitro hoàn chỉnh<br /> năng tạo cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo Số rễ trung bình (rễ/chồi) Chiều dài rễ (cm)<br /> ngọc thạch, Tam bảo sắc CTTN Hạc Hoàng thảo Tam bảo Hạc Hoàng thảo Tam bảo<br /> vỹ ngọc thạch sắc vỹ ngọc thạch sắc<br /> Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa N1 1,58 1,75 1,58 1,8 1,68 1,7<br /> sinh trưởng thực vật BA kết hợp với Kinetin lên N2 3 3,03 3,05 2,76 2,59 2,65<br /> N3 3,95 3,98 4,08 3,23 3,2 3,25<br /> khả năng tạo cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo<br /> N4 3,63 3,55 3,55 3,01 2,9 3,1<br /> ngọc thạch, Tam bảo sắc N4 3,45 3,43 3,4 2,72 2,79 2,81<br /> Hệ số nhân của cụm chồi (%) Hình thái chồi<br /> CTTN Hạc Hoàng thảo Tam bảo Hạc Hoàng thảo Tam bảo<br /> 4. Kết luận<br /> vỹ ngọc thạch sắc vỹ ngọc thạch sắc - Khử trùng chồi (giả hành) lan Hạc vỹ, Tam<br /> B1K1 0,9 0,8 0,95 + + +<br /> bảo sắc, Hoàng thảo ngọc thạch bằng HgCl2<br /> B1K2 2,85 2,9 2,85 + + +<br /> B1K3 3,8 3,65 3,75 + + +<br /> 0,1% trong 7 phút và khử trùng bằng NaClO<br /> B2K1 3,35 3,15 3,15 + + + 5% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và mẫu<br /> B2K2 3,3 3,2 3, ++ ++ ++ tái sinh cao nhất (mẫu tái sinh đạt trên 55%).<br /> B2K3 3,85 3,7 3,7 ++ ++ ++<br /> - Môi trường Knuds bổ sung 20g/l saccarose<br /> B3K1 4,65 4,3 4,45 +++ +++ +++<br /> + 100ml nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 7g/l<br /> B3K2 4,8 4,7 4,7 +++ +++ +++<br /> B3K3 5,55 5,3 5,45 +++ +++ +++<br /> agar + 0,3 mg/l BA + 0,3 mg/l Kinetin cho hệ số<br /> nhân nhanh chồi đạt cao nhất (từ 5,3-5,55%),<br /> Ghi chú: (+): chồi nhỏ, ngắn màu xanh nhạt, (++): chồi<br /> trung bình, kích thước không đồng đều, (+++): chồi mập, màu chất lượng chồi tốt, chồi to, mập.<br /> xanh đậm, kích thước đồng đều<br /> - Môi trường Knuds bổ sung 20g/l saccarose<br /> Kết quả thực nghiệm sau 3 tuần cho thấy: + 100ml nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 7g/l<br /> hệ số nhân nhanh chồi có sự khác biệt rõ ràng agar + 0,5mg/l NAA cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt cao<br /> ở các công thức thí nghiệm (đạt từ 0,9 đến 5,55 nhất (từ 3,95 - 4,08 rễ/ chồi), chiều dài rễ lớn<br /> %). Nhìn chung khi bổ sung riêng rẽ Kinetin và nhất (từ 3,2 - 3,25cm)./.<br /> BA hệ số nhân chồi thấp hơn so với khi phối hợp<br /> chúng với nhau. Ở môi trường sử dụng tổ hợp<br /> 0,3mg/l Kinetin + 0,3 mg/l BA cho hệ số nhân TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001).Vi nhân giống<br /> nhanh chồi cao nhất ở cả 3 loại lan (từ 5,3 đến phong lan Dendrobium trên quy mô công nghiệp. Tạp chí Khoa<br /> 5,55 %), chất lượng thể chồi tốt, chồi to, mập, học và Công nghệ, 1,1-9.<br /> 2. Nguyễn Thị Quỳnh Trang, Vũ Thị Kim Huệ, Khuất Thị<br /> đồng đều. Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013). Nhân giống in vitro lan Phi<br /> điệp tím (Dendrobium anosmum). Tạp chí Khoa học và Công<br /> 3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh nghệ Lâm nghiệp,3,16-21.<br /> trưởng thực vật NAA kết lên khả năng tạo cây 3. Asghar S, Ahmad T, Ahmad Hafiz I et al (2011). In vitro<br /> propagation of orchid (Dendrobium nobile) var. Emma white.<br /> lan in vitro hoàn chỉnh African journal of Biotechnology, 10(16), 3097-3103.<br /> <br /> Khi khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả<br />