Bào tử Bacillus subtilis cải thiện hậu quả sốc nhiệt bằng cách giảm tổn thương oxy hoá

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS CẢI THIỆN HẬU QUẢ SỐC NHIỆT<br /> BẰNG CÁCH GIẢM TỔN THƯƠNG OXY HOÁ<br /> Dương Nguyễn Ánh Ngọc*, Nguyễn Thị Linh Giang*, Trần Dương Thảo*, Vũ Thanh Thảo*, Trần Cát Đông*<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Mở đầu: Sốc nhiệt có thể gây tổn thương màng nhầy đường ruột, làm tăng tính thấm và khả năng<br /> khuếch tán của các chất độc vi sinh vào máu, dẫn đến sự gia tăng stress oxy hoá. Các probiotic đã được<br /> chứng minh có khả năng tăng cường chức năng thành ruột, yếu tố quan trọng quyết định khả năng chịu<br /> đựng sốc nhiệt của sinh vật. Do đó, sử dụng probiotic giúp điều hòa hệ vi khuẩn đường ruột hiện đang là<br /> hướng tiếp cận mới giúp cải thiện sức khỏe vật chủ bằng cách phòng ngừa những tác động bất lợi của stress<br /> oxy hóa gây ra trên đường ruột bởi sốc nhiệt.<br /> Mục tiêu: Mục tiêu của đề tài nhằm nghiên cứu những tác động của lợi khuẩn Bacillus subtilis trong<br /> việc cải thiện hậu quả sốc nhiệt qua tác động làm giảm tổn thương do oxy hoá.<br /> Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Động vật thử nghiệm là chuột nhắt trắng giống Swiss albino,<br /> thể trọng 18-20 g. Các lô chuột thử nghiệm lần lượt được cho uống bào tử của Bacillus subtilis BS02,<br /> Bacillus subtilis KP3 và PBS trong 7 ngày. Phân nửa số chuột trong mỗi lô được sốc nhiệt ở 42°C, độ ẩm<br /> tương đối 55% trong 15 phút, nửa số chuột còn lại trong mỗi lô được khảo sát trong điều kiện tương tự<br /> nhưng ở 25°C. Sốc nhiệt được tiến hành ba lần liên tục, với thời gian hồi phục giữa mỗi lần là 4 ngày.<br /> Trong giai đoạn sốc nhiệt, chuột vẫn tiếp tục được cho uống bào tử Bacillus subtilis hay PBS. Sau mỗi lần<br /> sốc nhiệt, 6 con trong lô sẽ được thu nhận gan và não để phân tích các chỉ dấu chống oxy hoá (hàm lượng<br /> MDA, SOD, GSH-Px và hoạt tính catalase). Chuột được theo dõi cân nặng hàng ngày và ghi nhận trong<br /> suốt quá trình thí nghiệm.<br /> Kết quả: Kết quả cho thấy bào tử Bacillus subtilis BS02 cải thiện đáng kể hoạt tính SOD ở não và hoạt<br /> tính catalase ở gan, không tác động đến hàm lượng MDA và hoạt tính GSH-Px. Trong khi đó, bào tử<br /> Bacillus subtilis KP3 làm giảm đáng kể hàm lượng MDA não, tăng hoạt tính SOD, GSH-Px, hoạt tính<br /> catalase gan và hoạt tính SOD não. Do đó, bào tử Bacillus subtilis KP3 cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc<br /> phòng ngừa hậu quả sốc nhiệt bằng cách hạn chế tổn thương oxy hoá.<br /> Kết luận: Chủng Bacillus subtilis KP3 có khả năng phòng ngừa sốc nhiệt liên quan đến tổn thương<br /> oxy hoá ở chuột nhắt Swiss albino.<br /> Từ khoá: Sốc nhiệt, tổn thương oxy hoá, Bacillus subtilis, bào tử.<br /> ABSTRACT<br /> BACILLUS SUBTILIS SPORES IMPROVE OUTCOMES OF HEAT STROKE<br /> BY REDUCING OXYDATIVE DAMAGE<br /> Duong Nguyen Anh Ngoc, Nguyen Thi Linh Giang, Tran Duong Thao, Vu Thanh Thao, Tran Cat Dong<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 40 – 46<br /> <br /> Background: Heat stroke can damage the gastrointestinal mucosa, which leads to increase intestinal<br /> permeability and diffusion of toxic bacterial components into blood, hence induces oxydative stress.<br /> Beneficial probiotic bacteria have shown that it can enhance gastrointestinal barrier functions which<br /> determine the ability of the organism to tolerate heat stroke. Thus, using probiotic to modulate the intestinal<br /> *<br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: KS. Nguyễn Thị Linh Giang ĐT: 02838295641 – 127 Email: nguyentlgiang@ump.edu.vn<br /> DNNnguyentlgiang@ump.edu.vn<br /> 40 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> microbiota, might be a novel therapeutic approach to improve host health by preventing adverse effects of<br /> stress in gut that caused by heat stroke.<br /> Objectives: Study the effects of using probiotic Bacillus subtilis spores to improve outcomes of heat<br /> stroke by reducing oxydative damages.<br /> Method: Swiss albino mice weighing 18-20 g were treated by oral gavage with B. subtilis KP3 or B.<br /> subtilis BS02 spores or PBS twice a day for 7 days. Half of the mice of each group were exposed to heat<br /> stroke at 42°C, relative humidity 55% for 15 min, while the remaining mice were placed at identical<br /> conditions but at 25°C. Heat stroke induction was performed three times consecutively with 4 days recovery<br /> interval while continuing giving oral doses of B. subtilis spores or PBS. After each heat shock, 6 mice of each<br /> group were sacrificed; livers and brains were obtained to analyze oxydative stress biomarkers (MDA level,<br /> SOD, catalase and GSH-Px activity). Weight of mice were monitored daily and be recorded during<br /> experiments time.<br /> Results: Evidences supported that B. subtilis BS02 significantly improved SOD activity in brain as<br /> well as catalase activity in liver; MDA level and GSH-Px activity are not affected after treatment.<br /> Meanwhile, B. subtilis KP3 showed that it significantly reduced MDA level in brain, increased SOD, GSH-<br /> Px and catalase activities in liver and SOD activity in brain. Therefore, B. subtilis KP3 showed markedly<br /> ability in preventing the heat stroke consequences by means of reducing oxydative damage.<br /> Conclusion: Bacillus subtilis KP3 strain can prevents heat stroke-related oxydative damages in Swiss<br /> albino mice.<br /> Key words: Heat stroke, Oxydative damage, Bacillus subtilis, Spore<br /> MỞĐẦU lại các lợi ích về sức khỏe cho vật chủ(15). Kết<br /> quả nghiên cứu cho thấy đáp ứng của hàng<br /> Sốc nhiệt là một dạng tăng thân nhiệt,<br /> rào bảo vệ ruột trong các bệnh lý khác nhau có<br /> biểu hiện bởi nhiệt độ cơ thể cao bất thường<br /> thể là yếu tố quyết định trong liệu pháp<br /> kèm theo các triệu chứng sinh lý bao gồm<br /> probiotic(3). Nghiên cứu trên chuột cống<br /> những thay đổi trong chức năng hệ thần<br /> Brown Norway của Zaresie và cs., chuột bị sốc<br /> kinh. Theo nghiên cứu gần đây, tăng thân<br /> do mất nước, khi được cho uống probiotic<br /> nhiệt làm tăng tính thấm và gây tổn thương<br /> Lactobacillus rhamnosus và Lactobacillus helveticus<br /> biểu mô đường ruột trong cả in vivo và in<br /> sẽ tăng cường chức năng hàng rào bảo vệ ruột,<br /> vitro, sự phá huỷ màng biểu mô do nhiệt<br /> ngăn chặn các vi khuẩn đường ruột bám lên<br /> góp phần làm rối loạn chức năng hàng rào<br /> nhung mao và các tế bào biểu mô, giảm các<br /> bảo vệ của ruột trong việc chịu đựng sốc<br /> biến chứng gây ra do bất thường ở ruột(17).<br /> nhiệt(7). Sự rối loạn chức năng của hàng rào<br /> Moore và cs. đã tiến hành nghiên cứu trên đối<br /> này làm gia tăng stress oxy hóa, có thể dẫn<br /> tượng chuột Spraque-Dawley, chuột được cho<br /> đến rối loạn hoặc suy giảm chức năng đa cơ<br /> uống B. subtilis BSB3 cho hiệu quả trong<br /> quan(1,14). Một số nghiên cứu đã chứng minh<br /> phòng ngừa các biến chứng liên quan đến sốc<br /> rằng phương pháp điều trị bằng các hóa<br /> nhiệt như sự chuyển vị của vi khuẩn, tổn<br /> chất như L-arginin, melatonin có thể làm<br /> thương mô học trong ruột, ảnh hưởng các<br /> giảm tổn thương oxy hóa, do đó làm giảm<br /> cytokin, mức lipopolysaccharid huyết thanh,<br /> hậu quả của sốc nhiệt(2,6).<br /> cũng như sự tiêu huỷ hồng cầu khi so sánh với<br /> Probiotic được định nghĩa là vi sinh vật lô chứng(10). Vi khuẩn Bacillus được biết đến<br /> sống khi được sử dụng với lượng đủ sẽ mang<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 41<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> với khả năng bảo vệ tế bào biểu mô ruột tượng chuột Swiss albino như sau: nhiệt độ<br /> chống lại các chấn thương và duy trì cân bằng sốc nhiệt 42°C, độ ẩm tương đối 55%, thời<br /> đường ruột. Bào tử của vi khuẩn Bacillus có gian sốc nhiệt 15 phút. Nửa số chuột của<br /> thể chịu được nhiệt độ khắc nhiệt, sự khô hạn, mỗi lô được gây sốc nhiệt, nửa số chuột còn<br /> sự phơi nhiễm với các hóa chất độc hại và tia lại không sốc nhiệt. Sốc nhiệt được thực hiện<br /> ba lần liên tiếp ở trong buồng Environmental<br /> cực tím, do đó chúng có thể sống sót ở pH<br /> Chamber Serie S (Binder), thời gian phục hồi<br /> thấp trong dạ dày và muối mật trong ruột<br /> giữa mỗi lần là 4 ngày, trong lúc đó chuột<br /> non(8,11). Nghiên cứu này nhằm xác định hiệu<br /> vẫn được cho uống bào tử Bacillus subtilis<br /> quả của một số chủng Bacillus đã được chứng<br /> hoặc Phosphate Buffered Saline (PBS). Bốn<br /> minh có các đặc tính probiotic trong việc làm giờ sau khi gây sốc nhiệt, chuột được giải<br /> giảm tổn thương oxy hoá gây ra bởi sốc nhiệt phẫu thu nhận não và gan để đánh giá các<br /> trên mô hình chuột. chỉ dấu oxy hóa. Chuột được theo dõi cân<br /> VẬTLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁP nặng hàng ngày và ghi nhận trong suốt quá<br /> trình thí nghiệm.<br /> Đối tượng thí nghiệm<br /> Thử nghiệm chỉ dấu oxy hoá<br /> Đối tượng thử nghiệm<br /> Bào tử của chủng probiotic Bacillus Nồng độ protein trong các mẫu mô được<br /> subtilis BS02 và chủng Bacillus subtilis KP3 xác định bằng phương pháp Bradford.<br /> sản xuất chất chống oxy hóa được thu nhận Các thử nghiệm xác định chỉ dấu oxy hoá:<br /> và làm sạch sau khi nuôi cấy trên môi hàm lượng malondialdehyd (MDA) được xác<br /> trường Difco Sporulation Medium ở 37°C<br /> định bằng phương pháp TBAR (các chất<br /> trong 48 giờ theo phương pháp của<br /> phản ứng với axit thiobarbituric) theo<br /> Nicholson và cs(12). Dịch bào tử thu nhận<br /> được pha loãng trong PBS để đạt nồng độ Ohkawa và cs(13); hoạt tính superoxyd<br /> cần thử nghiệm. dismutase (SOD) được thực hiện theo<br /> Động vật thí nghiệm phương pháp của Li và cs ; hoạt tính (9)<br /> <br /> <br /> Chuột chủng Swiss albino, giới tính đực gluthathion peroxydase (GSH-Px) được đo<br /> và cái, thể trọng 18-25 gam, được cung cấp xác định bằng phương của Flohe và cs(4); hoạt<br /> bởi viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế. Chuột tính catalase (CAT) được thử nghiệm theo<br /> được nuôi ổn định 1 tuần trước khi tiến phương pháp của Goth và cs(5).<br /> hành thử nghiệm.<br /> Xử lý số liệu<br /> Bố trí thí nghiệm<br /> Tất cả số liệu trong nghiên cứu được thể<br /> Chuột được chia ngẫu nhiên thành ba lô,<br /> hiện dưới dạng số trung bình ± SD, được<br /> mỗi lô 36 con: lô chứng (PBS) được cho uống<br /> phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS<br /> 0,2 ml PBS mỗi ngày; các lô bổ sung<br /> probiotic: mỗi lô được cho uống 0,2 ml bào Statistics version 22.0. Sự khác biệt giữa các<br /> tử BS02 hoặc KP3 nồng độ 107 bào tử/ml, 2 lô được so sánh bằng phép kiểm định Anova<br /> lần/ngày cách nhau 6 giờ trong 7 ngày trước và hàm Post Hoc-test, với giá trị p thể hiện<br /> khi gây sốc nhiệt. Sốc nhiệt được thực hiện qua giá trị Sig, giá trị p < 0,05 được cho là<br /> theo mô hình của Moore và cs(10) có thay đổi khác nhau có ý nghĩa thống kê.<br /> về điều kiện sốc nhiệt phù hợp với đối<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 42 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> KẾTQUẢ<br /> Sự thay đổi cân nặng ở chuột<br /> Bảng 1: Theo dõi cân nặng chuột giai đoạn truớc sốc nhiệt<br /> Cân nặng chuột (g)<br /> Lô (n=18) Độ tăng cân (g)<br /> Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7<br /> PBS 23,832,26 24,452,33 25,373,24 25,973,29 2,681,35<br /> BS02 24,643,46 26,093,39 26,603,30 26,843,20 2,611,46<br /> a<br /> KP3 25,633,27 27,063,62 28,213,62 29,33,83 3,671,3<br /> a: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô PBS, p < 0,05.<br /> Cân nặng của các lô chuột thí nghiệm được xấu đến tăng trọng của chuột. Khi so sánh<br /> theo dõi qua 2 giai đoạn: giai đoạn trước sốc giữa các lô chuột sốc nhiệt với nhau, ở cả ba<br /> nhiệt và giai đoạn sốc nhiệt lặp lại. lần sốc nhiệt, độ tăng cân của chuột ở các lô<br /> Khối lượng chuột ở các lô đều tăng trong được uống bào tử vi khuẩn lớn hơn có ý nghĩa<br /> suốt quá trình thử nghiệm (Bảng 1). Ở giai so với lô uống PBS. Điều này chứng tỏ, bào tử<br /> đoạn trước sốc nhiệt, chuột uống bào tử KP3 có tác dụng trong việc làm giảm sự sụt cân của<br /> chuột khi bị sốc nhiệt.<br /> tăng cân nhiều hơn có ý nghĩa so với lô PBS. Ở<br /> chuột uống bào tử BS02 không nhận thấy có Sự thay đổi các chỉ dấu oxy hóa<br /> <br /> sự khác biệt. Như vậy, việc uống các chủng vi<br /> Hàm lượng MDA<br /> <br /> khuẩn thử nghiệm BS02, KP3 không gây ảnh Hàm lượng MDA là chỉ dấu sinh học cho<br /> <br /> hưởng xấu đến sự tăng cân của chuột. quá trình peroxyd hóa lipid màng. Trong mẫu<br /> <br /> Bảng 2: Theo dõi độ tăng cân của chuột trong giai gan và não của chuột không gây sốc nhiệt,<br /> đoạn sốc nhiệt lặp lại hàm lượng MDA khác biệt không có ý nghĩa<br /> Độ tăng cân (g)<br /> thống kê ở tất cả các lô. Hàm lượng MDA ở cả<br /> Lô thí nghiệm Truớc sốc<br /> Truớc sốc nhiệt<br /> nhiệt lần 3 gan và não chuột sau khi sốc nhiệt cao hơn có<br /> lần 2 (n=12)<br /> (n=6)<br /> Không sốc nhiệt<br /> ý nghĩa thống kê so với chuột không sốc nhiệt<br /> 1,310,22 1,240,26<br /> PBS ac ac<br /> Sốc nhiệt 0,890,17 0,880,14 ở hầu hết các lô, ngoại trừ mẫu não của chuột<br /> Không sốc nhiệt 1,350,16 1,320,08<br /> BS02 bc b<br /> trong lô uống bào tử B. subtilis KP3 (Hình 1).<br /> Sốc nhiệt 1,250,18 1,330,20<br /> Không sốc nhiệt 1,551,54 1,600,10 Ở lô chuột uống PBS, hàm lượng MDA trong<br /> KP3 bc bc<br /> Sốc nhiệt 1,310,09 1,350,10 gan, não của chuột sốc nhiệt tăng so với chuột<br /> a: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chuột uống PBS<br /> không sốc nhiệt, và tăng dần trong các lần sốc<br /> không sốc nhiệt, p < 0,05;<br /> b: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chuột uống PBS nhiệt. Ở chuột uống BS02 và KP3, hàm lượng<br /> sốc nhiệt, p < 0,05; MDA của chuột sốc nhiệt ở các lần sốc nhiệt 2,<br /> c: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chuột không sốc 3 hầu như khác biệt không có ý nghĩa so với<br /> nhiệt trong cùng một lô, p < 0,05.<br /> sốc nhiệt lần 1, riêng hàm lượng MDA trong<br /> Trong giai đoạn sốc nhiệt lặp lại, nhìn<br /> não chuột uống KP3 sốc nhiệt giảm về mức<br /> chung độ tăng cân của các lô chuột sốc nhiệt<br /> khác biệt không có ý nghĩa so với chuột không<br /> giảm có ý nghĩa so với lô không sốc nhiệt<br /> (Bảng 2). Như vậy, sốc nhiệt gây ảnh hưởng sốc nhiệt qua 3 lần sốc nhiệt lặp lại.<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 43<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> Sốc nhiệt lần 1 Sốc nhiệt lần 1<br /> Không sốc nhiệt Không sốc nhiệt<br /> Sốc nhiệt lần 2 Sốc nhiệt lần 2<br /> Sốc nhiệt Sốc nhiệt<br /> MDA Gan nmol/mg protein<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> MDA Não nmol/mg protein<br /> Sốc nhiệt lần 3 Sốc nhiệt lần 3<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Hàm lượng MDA trong gan và não chuột. a: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chuột không gây sốc<br /> nhiệt trong cùng một lô, p