Biến đổi hình thái noãn và kết quả thụ tinh trong ống nghiệm của noãn sau đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> <br /> BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI NOÃN VÀ KẾT QUẢ THỤ TINH<br /> TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA NOÃN SAU ĐÔNG LẠNH<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA<br /> Lê Thanh Huyền*; Quản Hoàng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng* và CS<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá biến đổi hình thái noãn và khả năng phát triển của noãn sau rã đông<br /> (tỷ lệ sống, khả năng thụ tinh, chất lượng phôi trước chuyển phôi, tỷ lệ có thai, tỷ lệ làm tổ)<br /> bằng phương pháp thuỷ tinh hoá. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 211 noãn trưởng<br /> thành được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa đã rã đông (tương ứng với 34 chu kỳ<br /> có noãn đông lạnh và 34 chu kỳ rã đông - chuyển phôi) tại Viện Mô phôi Lâm sàng Quân đội,<br /> Học viện Quân y. Kết quả: hình thái noãn về đường kính bào tương và độ dày màng trong<br /> suốt sau rã đông không thay đổi so với trước đông lạnh. Thoi vô sắc quan sát thấy ở 100%<br /> noãn rã đông sau 3 giờ nuôi cấy. Tỷ lệ noãn sống sau rã đông 89,09%, tỷ lệ thụ tinh 71,28%, tỷ lệ<br /> phôi tốt ngày 3 là 38,71%, tỷ lệ có thai lâm sàng 29,41%, tỷ lệ làm tổ 12,94%. Kết luận: đông lạnh<br /> thủy tinh hóa giúp bảo quản tốt noãn người, noãn sau rã đông có tiềm năng phát triển cao.<br /> * Từ khóa: Thụ tinh trong ống nghiệm; Đông lạnh thủy tinh hóa.<br /> <br /> Morphological Changes and Outcomes of IVF of Human Oocytes<br /> Cryopreserved by Vitrification<br /> Summary<br /> Objectives: To evaluate morphological changes and developmental competence of oocyte<br /> after vitrification (i.e. survival rate, fertilization ability, embryo quality, clinical pregnancy rate,<br /> implantation rate) by using vitrification method. Subjects and methods: 211 mature oocytes had<br /> vitrified and thawed in Military Morphological Institute of Vietnam Military Medical University.<br /> Results: Vitrified oocyte did not change in terms of morphology, repolymerization of the meiotic<br /> spindle occurs in 100% of the oocytes surviving cryopreservation after 3 hours. Observed<br /> survival rate was 89.09%, fertilization rate of vitrified oocyte was 71.28%, good quality embryo<br /> on day 3 was 38.71%, clinical pregnancy rate was 29.41% and implantation rate was 12.94%.<br /> Conclusion: Vitrification is an efficient method for human oocyte cryopreservation, vitrified - thawed<br /> oocytes have good quality and highly developmental competence.<br /> * Keywords: In vitro vitrification; Fertification.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ngày nay, trữ lạnh được xem là kỹ thuật<br /> không thể thiếu trong điều trị vô sinh bằng<br /> <br /> tụ tinh trong ống nghiệm (TTTON). Trong khi<br /> trữ lạnh phôi giúp tăng tính an toàn và hiệu<br /> quả của một chu kỳ kích thích buồng trứng<br /> làm TTTON thì trữ lạnh giao tử có vai trò<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Lê Thanh Huyền (lethanhhuyenk53@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 26/04/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 13/06/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 21/06/2018<br /> <br /> 30<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> quan trọng trong vấn đề bảo tồn khả năng<br /> sinh sản của con người cũng như có<br /> nhiều tiềm năng ứng dụng rộng rãi khác.<br /> Trữ lạnh noãn được xem là giải pháp hữu<br /> hiệu để bảo tồn khả năng sinh sản cho<br /> phụ nữ độc thân hoặc phụ nữ mắc các<br /> bệnh lý ác tính, là cơ sở để thành lập<br /> ngân hàng noãn của người cho. Trong<br /> một số trường hợp đặc biệt, khi người<br /> chồng không lấy được tinh trùng hoặc<br /> mẫu tinh trùng không đạt tiêu chuẩn sau<br /> khi noãn đã được chọc hút, đông lạnh<br /> noãn là lựa chọn duy nhất để không bỏ<br /> noãn. Ngoài ra, trữ lạnh noãn còn giúp<br /> giảm tình trạng số lượng phôi dư thừa<br /> ngày càng gia tăng [2, 8]. Trên thế giới,<br /> trường hợp mang thai thành công đầu<br /> tiên từ noãn người trữ lạnh được Chen C<br /> và CS công bố năm 1986 [5], chỉ sau<br /> thành công của trữ lạnh phôi người một<br /> thời gian ngắn. Tuy nhiên, cho đến nay,<br /> so với đông lạnh phôi, hiệu quả của đông<br /> lạnh noãn vẫn còn gây nhiều tranh cãi.<br /> Việc trữ lạnh và rã đông noãn gặp nhiều<br /> khó khăn hơn so với tinh trùng và phôi.<br /> Đặc điểm cấu trúc khác biệt của noãn<br /> như kích thước tế bào và thể tích nước<br /> trong tế bào lớn, tốc độ khử nước chậm<br /> là những nguyên nhân chính khiến cho<br /> noãn rất dễ bị tổn thương trong quá trình<br /> làm lạnh và rã đông. Các tổn thương này<br /> sẽ ảnh hưởng đến khả năng sống, khả<br /> năng thụ tinh và năng lực phát triển của<br /> phôi được tạo thành. Vì vậy, chúng tôi<br /> thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu:<br /> Mô tả biến đổi hình thái cấu trúc noãn<br /> người sau đông lạnh và đánh giá kết quả<br /> TTTON của noãn sau rã đông bằng phương<br /> pháp thủy tinh hóa.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> 211 noãn trưởng thành được đông lạnh<br /> bằng phương pháp thủy tinh hóa đã rã<br /> đông (tương ứng với 34 chu kỳ có noãn<br /> đông lạnh và 34 chu kỳ rã đông - chuyển<br /> phôi của bệnh nhân (BN)) tại Viện Mô phôi<br /> Lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y,<br /> thời gian từ tháng 8 - 2015 đến 12 - 2017.<br /> - Tiêu chuẩn lựa chọn:<br /> + Noãn được lấy vào thời điểm 34 36 giờ sau tiêm hCG.<br /> + Noãn ở giai đoạn MII có hình thái<br /> bình thường (theo Đồng thuận đánh giá<br /> và phân loại noãn, phôi VINAGOFPA,<br /> 2012) [1].<br /> - Tiêu chuẩn loại trừ: noãn ở các giai<br /> đoạn GV, MI và noãn bất thường.<br /> * Vật liệu, hóa chất:<br /> Sử dụng bộ môi trường đông lạnh và<br /> rã đông noãn/phôi (Hãng Kitazato, Nhật Bản).<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Đông lạnh và rã đông noãn:<br /> Áp dụng quy trình đông lạnh thủy tinh<br /> hóa theo phương pháp Cryotop của<br /> Masashige Kuwayama (2005):<br /> + Trước khi đông lạnh, tất cả noãn đều<br /> được xử lý bằng enzym hyaluronidase<br /> (Hyase, Vitrolife) để loại bỏ hết tế bào<br /> nang bao xung quanh.<br /> + Sau khi rã đông, nuôi cấy noãn trong<br /> môi trường IVF trong thời gian 3 giờ trước<br /> khi tiến hành kỹ thuật ICSI.<br /> 31<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> * Xác định noãn sống:<br /> Sau khi rã đông, các noãn sống có màng<br /> trong suốt, màng tế bào còn nguyên vẹn,<br /> bào tương sáng màu, về hình thái không<br /> thấy có thay đổi so với trước khi đông lạnh.<br /> * Phân tích thoi vô sắc:<br /> Áp dụng theo phương pháp của Markus<br /> Montag (2006), sử dụng hệ thống Module<br /> polaraide - octax laser system của kính<br /> hiển vi Nikon TE2000: sau khi rã đông, tất<br /> cả noãn được theo dõi đánh giá xuất hiện<br /> thoi vô sắc trong bào tương noãn tại các<br /> thời điểm 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ sau<br /> rã đông.<br /> * Phương pháp đánh giá hình thái phôi:<br /> Quan sát hình thái phôi bằng kính hiển<br /> vi đảo ngược Olympus IX 70, độ phóng<br /> đại 200 lần. Phôi ngày 3 (ngày chuyển phôi)<br /> được phân loại theo tiêu chuẩn Đồng<br /> thuận ALPHA (2011) và Đồng thuận đánh<br /> giá và phân loại noãn, phôi VINAGOFPA<br /> (2012) [1], chia phôi thành 3 loại dựa vào<br /> đặc điểm số lượng phôi bào, độ đồng đều<br /> giữa các phôi bào và tỷ lệ mảnh vỡ bào<br /> tương so với thể tích toàn bộ phôi:<br /> - Phôi tốt: phôi có 7 - 8 phôi bào, kích<br /> thước phôi bào đồng đều (lệch nhau ≤ 20%),<br /> tỷ lệ mảnh vỡ bào tương < 10% thể tích<br /> phôi, không có phôi bào đa nhân.<br /> - Phôi trung bình: phôi có < 8 phôi bào,<br /> đa số phôi bào có kích thước đồng đều,<br /> tỷ lệ mảnh vỡ bào tương 10 - 25% thể<br /> tích của phôi, không có phôi bào đa nhân.<br /> - Phôi xấu: các phôi bào có kích thước<br /> không đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào<br /> tương > 25% thể tích phôi, có phôi bào<br /> đa nhân.<br /> 32<br /> <br /> * Xác định tỷ lệ có thai và tỷ lệ làm<br /> tổ ở các chu kỳ chuyển phôi từ noãn<br /> đông lạnh:<br /> BN sau khi chuyển phôi 14 ngày được<br /> hẹn đến Viện để thử lượng ß-hCG trong<br /> máu:<br /> + Có thai sinh hoá: sau chuyển phôi<br /> 14 ngày có nồng độ ß-hCG > 25 ng/ml.<br /> + Có thai lâm sàng: sau 4 - 5 tuần<br /> chuyển phôi, siêu âm thấy túi ối trong buồng<br /> tử cung.<br /> + Tỷ lệ làm tổ của phôi được tính bằng<br /> tổng số phôi làm tổ trên tổng số phôi chuyển<br /> vào tử cung.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Một số đặc điểm của các chu kỳ<br /> rã đông noãn (n = 34).<br /> Tuổi trung bình của BN 34,1 ± 5,9,<br /> nhiều nhất 47 tuổi, ít nhất 25 tuổi. Số năm<br /> vô sinh trung bình 5,9 ± 2,8, thời gian vô<br /> sinh ngắn nhất 2 năm, dài nhất 14 năm.<br /> Số noãn được rã đông trung bình tính<br /> trên mỗi BN là 6,2 ± 2,2, người có noãn<br /> được rã đông ít nhất là 4, trường hợp<br /> nhiều nhất là 14 noãn. Thời gian đông lạnh<br /> từ 3 - 15 tháng, trung bình 6,6 ± 3,5 tháng.<br /> 2. Tỷ lệ sống của noãn sau rã đông.<br /> Tổng số 211 noãn được rã đông, sau<br /> rã đông 188 noãn (89,09%) không thấy<br /> thay đổi hình thái so với trước khi đông<br /> lạnh; 23 noãn còn lại (10,91%) bị thoái<br /> hóa, bào tương có màu sẫm, có nhiều hạt<br /> thô, màng tế bào bị ly giải, không định rõ<br /> được ranh giới màng bào tương bên trong<br /> màng trong suốt.<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> <br /> Ảnh 1: Noãn bào II của người<br /> trước khi đông lạnh.<br /> <br /> Ảnh 2: Noãn bào II của người<br /> sau khi rã đông còn sống.<br /> <br /> 3. So sánh thay đổi hình thái noãn trước và sau rã đông.<br /> Bảng 1:<br /> Thời điểm nghiên cứu<br /> Chỉ tiêu<br /> <br /> Trước đông<br /> (n = 188)<br /> <br /> Sau rã đông<br /> (n = 188)<br /> <br /> p<br /> <br /> Độ dày màng trong suốt trung bình (µm)<br /> <br /> 18,14 ± 3,06<br /> <br /> 18,20 ± 2,66<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Đường kính noãn trung bình (µm)<br /> <br /> 116,58 ± 4,95<br /> <br /> 116,18 ± 5,36<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Tất cả noãn đều được chụp ảnh trước khi đông lạnh và sau rã đông, sau đó đo độ<br /> dày màng trong suốt, đo đường kính bào tương noãn của 188 noãn sống sau rã đông.<br /> Kết quả cho thấy đường kính bào tương noãn và độ dày màng trong suốt của noãn<br /> trước đông lạnh và sau rã đông thay đổi không có ý nghĩa thống kê. Hình thái noãn<br /> hầu như không biến đổi sau khi đông lạnh.<br /> Trong số 211 noãn nghiên cứu, 182 noãn (86,2%) quan sát thấy thoi vô sắc trước<br /> đông lạnh; 29 noãn còn lại không quan sát thấy thoi vô sắc tại thời điểm đông lạnh.<br /> Sau rã đông, toàn bộ số noãn có thoi vô sắc (182 noãn), chỉ 6/29 noãn không có thoi<br /> vô sắc còn sống sau rã đông.<br /> 4. Sự xuất hiện thoi vô sắc của noãn còn sống sau rã đông (n = 188).<br /> Bảng 2:<br /> Nhóm nghiên cứu<br /> <br /> Noãn nhìn thấy thoi vô sắc<br /> <br /> Noãn không nhìn thấy thoi vô sắc<br /> <br /> Sau rã đông 0 giờ<br /> <br /> 0/182 (0%)<br /> <br /> 188<br /> <br /> Sau rã đông 1 giờ<br /> <br /> 45/182 (24.7%)<br /> <br /> 143<br /> <br /> Sau rã đông 2 giờ<br /> <br /> 164/182 (90,1%)<br /> <br /> 24<br /> <br /> Sau rã đông 3 giờ<br /> <br /> 182/182 (100%)<br /> <br /> 6<br /> <br /> Thời gian<br /> <br /> Tại thời điểm ngay sau rã đông, không quan sát thấy thoi vô sắc ở tất cả các noãn<br /> còn sống.<br /> 33<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> 5. So sánh vị trí thoi vô sắc của noãn trước đông lạnh và noãn sau rã đông.<br /> Bảng 3:<br /> Thời điểm nghiên cứu<br /> Góc giữa thể cực và thoi vô sắc<br /> 0 - 30<br /> <br /> Trước đông lạnh (n = 182)<br /> <br /> Sau rã đông (n = 182)<br /> <br /> 138/182 (75,8%)<br /> <br /> 130/182 (71,4%)<br /> <br /> 28/182 (15,3%)<br /> <br /> 33/182 (18,1%)<br /> <br /> 12/182 (6,6%)<br /> <br /> 15/182 (8,2%)<br /> <br /> 4/182 (2,3%)<br /> <br /> 4/182 (2,3%)<br /> <br /> 0<br /> 0<br /> <br /> 30 - 60<br /> <br /> 60 - 120<br /> > 120<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> Phân tích vị trí giữa thể cực và thoi vô sắc của noãn sau rã đông so với trước đông<br /> lạnh cho thấy một tỷ lệ nhỏ noãn có thay đổi vị trí thể cực. Trước đông lạnh, 138 noãn<br /> có thoi vô sắc nằm ngay dưới và sát thể cực 1, 28 noãn có thoi vô sắc lệch so với thể<br /> cực 1 từ 30 - 600; 12 noãn có thoi vô sắc ở vị trí 60 - 1200 so với thể cực 1, 4 noãn có<br /> thoi vô sắc ở vị trí 120 - 1800. Tuy nhiên, sau rã đông, chỉ 130 noãn có thoi vô sắc ở<br /> vị trí 0 - 300. Tỷ lệ thoi ở vị trí 30 - 1200 tăng từ 21,9% lên 26,3%.<br /> 6. Kết quả thực hiện TTTON của noãn sau rã đông.<br /> Noãn thụ tinh bình thường: 134/188 (71,28%); noãn thụ tinh bất thường: 3/188 (1,6%);<br /> số phôi phân chia: 124/134 (92,5%); số phôi tốt ngày 3: 48/124 (38,71%); số phôi<br /> chuyển trung bình: 2,5, ít nhất 1 phôi, nhiều nhất 3 phôi; trong 34 kỳ chuyển phôi,<br /> 12 chu kỳ có thai sinh hóa 35,29%, 10 chu kỳ có thai lâm sàng (29,41%), trong đó<br /> 9 trường hợp một thai, 1 trường hợp hai thai và 1 trường hợp sảy thai (8,3%) ở tuần<br /> thứ 12; tỷ lệ làm tổ: 11/85 (12,94%).<br /> BÀN LUẬN<br /> Hiện nay, việc bảo quản lạnh noãn<br /> người chủ yếu thực hiện theo hai phương<br /> pháp đông lạnh hạ nhiệt độ chậm và thủy<br /> tinh hóa. Với phương pháp đông lạnh hạ<br /> nhiệt độ chậm, cố gắng giảm thiểu những<br /> tác động bất lợi đến tế bào bằng cách<br /> kiểm soát đặc tính lý sinh của quá trình<br /> đông lạnh như tốc độ làm lạnh và làm ấm,<br /> kết hợp với sử dụng chất bảo vệ đông<br /> lạnh thích hợp. Với quy trình đông lạnh<br /> hạ nhiệt độ chậm, tế bào bị khử nước<br /> thông qua quá trình cân bằng thẩm thấu<br /> khi hình thành đá ngoại bào. Trong khi đó,<br /> thủy tinh hóa được coi là “phương pháp<br /> 34<br /> <br /> đông lạnh không cân bằng”, phương pháp<br /> này sử dụng các chất bảo vệ đông lạnh<br /> có nồng độ rất cao, kết hợp với tốc độ<br /> làm lạnh cực nhanh khiến dung dịch có<br /> thể rắn hóa mà không trải qua hình thành<br /> tinh thể đá, giảm thiểu tổn thương đông<br /> lạnh cho tế bào. Một số báo cáo gần đây<br /> cho thấy tỷ lệ sống của noãn người đông<br /> lạnh ngày càng được nâng cao khi sử dụng<br /> phương pháp thủy tinh hóa. Bo và CS (2015)<br /> thủy tinh hóa 466 noãn người cho tỷ lệ<br /> sống sau rã đông đạt 86,69% [4]. Đặc biệt,<br /> Antinori M và CS (2007) công bố tỷ lệ<br /> sống lên đến 99,4% khi nghiên cứu trên<br /> 330 noãn đông lạnh bằng phương pháp<br /> <br />