Biểu hiện của gen NOX4 trên tế bào dây chằng nha chu người dưới tác động của hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> BIỂU HIỆN CỦA GEN NOX4 TRÊN TẾ BÀO DÂY CHẰNG<br /> NHA CHU NGƯỜI DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA HỢP CHẤT<br /> DUNG GIẢI TẾ BÀO PORPHYROMONAS GINGIVALIS<br /> Nguyễn Thu Thuỷ*, Sujiwan Seubbuk**, Rudee Surarit**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Porphyromonas gingivalis là vi khuẩn thường được xem là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với<br /> viêm nha chu. Gen NOX4 liên quan đến sự sản xuất gốc oxy tự do (ROS) trên tế bào người.<br /> Mục tiêu: Đánh giá biểu hiện gen NOX4 trên tế bào dây chằng nha chu người dưới tác động của hợp chất<br /> dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis.<br /> Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Tế bào dây chằng nha chu người (TBDCNCN) của Đơn vị cung<br /> cấp tế bào nuôi cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection, ATCC), được nuôi trong môi trường Dulbecco<br /> biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum, DMEM). Sau đó tế bào được cấy vào giếng chứa các nồng độ hợp<br /> chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis 20 μM và 50 μM. Thu lại dung dịch tế bào sau 2 giờ và 24 giờ để<br /> thực hiện real-time PCR đánh giá biểu hiện gen NOX4.<br /> Kết quả: Biểu hiện của NOX4 tăng lên theo thời gian tiếp xúc với P. gingivalis dù ở nồng độ thấp, sự khác<br /> biệt có ý nghĩa thống kê (p0,05).<br /> Kết luận: Dưới tác dụng của hợp chất dung giải tế bào P. gingivalis, biểu hiện gen NOX4 trên tế bào dây<br /> chằng nha chu người tăng lên, tác động này thay đổi theo thời gian và phụ thuộc vào nồng độ P. gingivalis.<br /> Từ khoá: NOX4, stress oxy hóa, Porphyromonas gingivalis, tế bào dây chằng nha chu người.<br /> ABSTRACT<br /> EXPRESSION OF NOX4 IN HUMAN PERIODONTAL LIGAMENT CELLS UNDER EFFECT OF<br /> PORPHYROMONAS GINGIVALIS LYSATE<br /> Nguyen Thu Thuy, Sujiwan Seubbuk, Rudee Surarit<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 2- 2018: 1 - 4<br /> <br /> Background: Porphyromonas gingivalis is an important etiologic factor of periodontal diseases. NOX4 gene<br /> is related to the production of reative oxygen species (ROS).<br /> Objectives: The aim of this study was to investigate the expression of NOX4 in human periodontal ligament<br /> cells under the effect of Porphyromonas gingivalis lysate.<br /> Materials and methods: Primary human periodontal ligament cells (HPDLF) was cultured in growth<br /> media under P. gingivalis lysate treatment in different concentrations for 2 and 24 hours. Following incubation,<br /> the expression of NOX4 was evaluated by using Real-time PCR.<br /> Results: The expression of NOX4 increased with time of exposure to P. gingivalis, even at low<br /> concentrations significantly (p0.05).<br /> <br /> <br /> *Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> **Bộ môn Sinh học miệng, Khoa Nha, Đại học Mahidol, Thái Lan<br /> Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Thu Thuỷ ĐT: 01208505265 Email: ngthuthuy20@yahoo.com<br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 1<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018<br /> <br /> Conclusion: Under the effect of P. gingivalis lysate, NOX4 gene expression in HPDLF was increased, which<br /> depended on time and P. gingivalis lysate concentration.<br /> Key words: NOX4, oxidative stress, Porphyromonas gingivalis, human periodontal ligament cells.<br /> MỞ ĐẦU biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum,<br /> DMEM) chứa 90% DMEM, 10% huyết thanh<br /> Bệnh nha chu ảnh hưởng đến 10-15% dân số<br /> phôi thai bò (Fetal Bovine Sreum, FBS), 1%<br /> thế giới và là một trong những lý do hàng đầu kháng sinh. Cấy chuyển khi mật độ tế bào dày<br /> gây mất răng(1). Viêm nha chu về cơ bản là một đặc, các tế bào kết dính với nhau.<br /> bệnh viêm, bắt đầu bằng màng sinh học dưới<br /> nướu và thay đổi do phản ứng viêm/miễn dịch Chuẩn bị<br /> cá nhân bất thường(4). Các bạch cầu đa nhân TBDCNCN được gieo vào bảng mẫu siêu<br /> (BCĐN) là những tế bào viêm nguyên phát trong nhỏ 96 giếng với mật độ 3x10 tế bào/giếng.<br /> 3<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> nướu và mô nha chu(11,12). Trong viêm nha chu, Các bảng mẫu sau đó được ủ ấm trong máy ủ<br /> BCĐN tự nhiên có khả năng sản xuất các gốc oxy CO2 (37o C, 5% CO2, độ ẩm 100%) trong 24 giờ<br /> tự do (ROS) được cho là kích hoạt chức năng và để đạt 80% mức bão hoà, sau đó đổi môi<br /> do đó làm tăng sản xuất ROS(5). Nhiều nghiên trường nuôi cấy sang DMEM không có huyết<br /> cứu gần đây đã chỉ ra rằng các bệnh nha chu thanh chứa các nồng độ hợp chất dung giải tế<br /> mạn tính có liên quan với bạch cầu trung tính bào Porphyromonas gingivalis 20 µM và 50 µM.<br /> phóng thích với sản xuất ROS gia tăng để đáp H2O2 50 µM dùng làm nhóm chứng dương và<br /> ứng kích thích thụ thể Fc-gamma(2,7,3,9,10). môi trường nuôi cấy không huyết thanh dùng<br /> Porphyromonas gingivalis là vi khuẩn thường làm nhóm chứng âm. Thu lại dung dịch tế bào<br /> được xem là tác nhân gây bệnh quan trọng đối sau 2 giờ và 24 giờ để thực hiện các thí nghiệm<br /> với viêm nha chu(11). tiếp theo.<br /> Nghiên cứu này nhằm đánh giá biểu hiện Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA<br /> gen NOX4 liên quan đến sự sản xuất ROS trên tế RNA tổng số được tách chiết bằng Trizol<br /> bào dây chằng nha chu người dưới tác động của (Invitrogen, Hoa Kỳ) và bộ tách chiết RNA (PureLink<br /> hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas RNA Mini Kit, Invitrogen, Hoa Kỳ), với sự loại bỏ<br /> gingivalis ở các nồng độ khác nhau. DNA bằng DNaseI (On-column PureLink DNase,<br /> ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Invitrogen, Hoa Kỳ). Các mẫu RNA được kiểm tra<br /> nồng độ bằng máy đo quang phổ (Biotek, Hoa Kỳ)<br /> Đối tượng nghiên cứu trước khi 1 µg RNA tổng được dùng để tổng hợp<br /> Tế bào dây chằng nha chu người cDNA bằng bộ tổng hợp cDNA (Invitrogen, Hoa Kỳ).<br /> (TBDCNCN) của Đơn vị cung cấp tế bào nuôi Quy trình thao tác được thực hiện theo hướng dẫn<br /> cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection, của nhà sản xuất.<br /> ATCC), được nuôi trong môi trường Dulbecco<br /> Real-time PCR định lượng và phân tích kết<br /> biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum,<br /> quả<br /> DMEM) chứa 90% DMEM, 10% huyết thanh<br /> Tổng thể tích của mỗi phản ứng Real-time PCR<br /> phôi thai bò (Fetal Bovine Sreum, FBS), 1%<br /> định lượng là 22 µl, bao gồm SYBR Green PCR<br /> kháng sinh.<br /> Master Mix (Thermo Scientific, Hoa Kỳ), khuôn<br /> Phương pháp nghiên cứu cDNA và một cặp primer thiết kế đặc hiệu cho<br /> Nuôi cấy tế bào NOX4. Các phản ứng (lặp lại 3 mẫu cho mỗi thiết kế<br /> TBDCNCN của Đơn vị cung cấp tế bào nuôi thí nghiệm) được thực hiện bằng máy Realplex<br /> cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection, Eppendorf (Đức). Chu trình chạy phản ứng bao gồm<br /> ATCC), được nuôi trong môi trường Dulbecco 2 phút ở 50°C, 15 phút ở 95°C tiếp theo là 40 chu kỳ<br /> <br /> <br /> 2 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> của 90°C (15 giây) và 60°C (1 phút). Để kiểm tra số Nghiên cứu này cho thấy biểu hiện của<br /> sản phẩm được khuếch đại ở mỗi phản ứng, phân NOX4 tăng lên theo thời gian tiếp xúc với P.<br /> tích đường cong nóng chảy DNA (dissociation gingivalis dù ở nồng độ thấp, sự khác biệt có ý<br /> melting curves) được thực hiện bằng cách giữ ở nhiệt nghĩa thống kê (p