Biểu hiện gen mã hóa IL-2 của người với Chaperone Groesl và Thioredoxin trong tế bào Escherichia coli BL21 (DE3)

J. Sci. & Devel., Vol. 11, No. 6: 777-783 Tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, tập 11, số 6: 777-783<br /> www.hua.edu.vn<br /> <br /> <br /> <br /> BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA IL-2 CỦA NGƯỜI VỚI CHAPERONE GROESL<br /> VÀ THIOREDOXIN TRONG TẾ BÀO Escherichia coli BL21 (DE3)<br /> Lê Thị Lan Anh1*, Lê Phương Hoàng Anh1, Đào Trọng Khoa1, Lê Thị Thu Hồng1,<br /> Phùng Thu Nguyệt1, Nguyễn Hữu Đức2, Nguyễn Thị Hằng2, Trương Nam Hải1<br /> 1<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam;<br /> 2<br /> Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội<br /> Email*: leanhbio@gmail.com<br /> Ngày gửi bài: 26.04.2013 Ngày chấp nhận: 25.09.2013<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> <br /> Interleukin-2 (IL-2) là một trong các cytokine đóng vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch. IL-2 thúc đẩy sự hoạt<br /> hóa của các tế bào T, vì vậy thường được sử dụng trong điều trị ung thư bằng các liệu pháp miễn dịch như ung thư<br /> biểu mô thận ác tính và ung thư hắc tố. Gen mã hóa il-2 cải biến thay thế Cys125 bằng Ser đã được đưa vào vector<br /> biểu hiện pET22b(+) có gắn trình tự tiết pelB (pelB signal sequence) để biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3). Để tăng<br /> hiệu quả biểu hiện protein đúng cấu trúc và tính tan của protein, IL-2 được biểu hiện cùng với chaperone GroESL và<br /> thioredoxin (Trx). Kết quả cho thấy các protein IL-2 biểu hiện cùng GroESL và Trx có kích thước khoảng 20 kDa vẫn<br /> tồn tại ở dạng không tan trong tế bào chất và gắn với tín hiệu tiết pelB.<br /> Từ khóa: Biểu hiện, chaperone, interleukin-2, thioredoxin, tín hiệu tiết pelB.<br /> <br /> <br /> Co-expression of Human Interleukin-2 Gene with Chaperone GroESL<br /> and Thioredoxin in Escherichia coli BL21 (DE3)<br /> <br /> ABSTRACT<br /> <br /> Interleukin 2 (IL-2), one of the cytokines plays an important role for the immune response. IL-2 promotes the<br /> activation of T cells and so often used in immunotherapy such as kidney epithelial malignant and melanoma cancer.<br /> Gene encoding il-2 modified Cys125 to Ser was inserted into pET22b(+) harboring pelB secrete signal for expression<br /> in E. coli BL21(DE3) cells. To enhance the correct protein folding and solubility, IL-2 was simultaneously expressed<br /> with chaperone GroESL and thioredoxin (Trx). The results indicated that IL-2 proteins co-expressed with GroESL and<br /> Trx of 20 kDa were still existed in insoluble form and consisted of the pelB secret signal.<br /> Keywords: Chaperone, expression, interleukin-2, thioredoxin, pelB secret signal.<br /> <br /> <br /> et al., 2005). Các sản phẩm IL-2 tái tổ hợp<br /> 1. ĐẶT VẤN ĐỀ thương mại hiện nay được FDA cấp phép sử<br /> Gen mã hóa il-2 người lần đầu tiên được dụng hỗ trợ điều trị ung thư chủ yếu sản xuất<br /> tách dòng vào năm 1983 và cấu trúc của protein trong E. coli và đã được sử dụng trong nhiều<br /> này đã được mô phỏng vào năm 1992. Cho đến thập kỷ qua.<br /> nay, gen il-2 của người đã được biểu hiện trong IL-2 của người có trọng lượng phân tử<br /> nhiều sinh vật chủ khác nhau như Escherichia khoảng 15 kDa gồm 133 axit amin. Trong trình<br /> coli (E. coli), Pichia pastoris và trong tế bào tự này chứa 3 gốc Cys tại các vị trí 58, 105, 125,<br /> động vật (Hyung et al., 2005). Tuy nhiên kết trong đó hai gốc Cys58 và Cys105 tạo cầu<br /> quả biểu hiện IL-2 cao nhất là trong tế bào E. disulfide. Việc hình thành chính xác cầu<br /> coli và sản phẩm IL-2 tái tổ hợp có hoạt tính disulfide này sẽ quyết định đến hoạt tính sinh<br /> sinh học tương đương với IL-2 tự nhiên (Liang học của IL-2. Để ngăn cản sự tạo thành cầu<br /> <br /> 777<br /> Biểu hiện gen mã hóa IL-2 của người với chaperone groesl và thioredoxin trong tế bào Escherichia coli BL21 (DE3)<br /> <br /> <br /> <br /> disulfide không mong muốn giữa Cys125 với Acrylamide, TEMED, protein Marker<br /> Cys58 và Cys105, đột biến thay thế Cys125 (Fermentas, Đức), EDTA (Serva, Đức), X- Gal<br /> thành Ser đã được nghiên cứu. Ngoài ra, 3 axit (Sigma, Mỹ), phenol, methanol, isoamyalcohol,<br /> amin đầu tiên tại đầu N của protein IL-2 là EtBr, Glyxerol, IPTG, Ethanol, Chloroform<br /> điểm glycosyl hóa được nhận biết bởi trình tự (Rohde, Đức), agar (Fluka, Đức), ampicillin<br /> Ala-Pro-Thr. IL-2 trong tự nhiên tồn tại ở dạng (Merck, Đức), agarose (Gibco, Mỹ), MgSO4 (Bio-<br /> glycosyl hóa có tính thấm cao với màng tế bào, Labs, Mỹ), cao nấm men (Gibco, Mỹ), peptone,<br /> vì vậy liều lượng lớn IL-2 sẽ gây nên độc tính glucose, NaCl, CaCl2, kháng thể kháng IL-2,<br /> của protein này trong cơ thể. Do đó, IL-2 dạng kháng thể kháng chuột (Sigma, Mỹ).<br /> thương phẩm dùng làm thuốc tiêm cần được<br /> thiết kế mới để loại bỏ alanine ở đầu N và đột 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> biến gốc Cys125 thành Ser.<br /> 2.2.1. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa<br /> Các protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. il-2 có tín hiệu pelB<br /> coli được bắt đầu với formyl-methionine ở đầu N<br /> Trình tự gen il-2 được thiết kế dựa trên<br /> (Marcker and Sanger, 1964) và có thể ảnh<br /> trình tự gen il-2 người trên Ngân hàng Dữ liệu<br /> hưởng đến chức năng của protein (Millan et al.,<br /> Gen Quốc tế NCBI với số đăng kí NP_000577.<br /> 2007). Việc sử dụng peptide tín hiệu (signal<br /> Plasmid tái tổ hợp được thiết kế có trình tự đoạn<br /> peptide) biểu hiện protein trong khoang chu<br /> gen il-2 cải biến Cys125 thành Ser có gắn trình<br /> chất giúp protein tiết loại bỏ được methionin<br /> tự tín hiệu tiết pelB ở đầu N và được tổng hợp<br /> (Met) và cuộn xoắn đúng cấu trúc. Trong thí<br /> bởi hãng Gen Script (Mỹ).<br /> nghiệm này, đoạn tín hiệu tiết pelB được thiết<br /> kế phía trước trình tự protein IL-2 và biểu hiện Plasmid tái tổ hợp pET22_IL-2_pelB được<br /> kèm với chaperone GroESL và thioredoxin để biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10B<br /> tăng tính tan và hiệu quả cắt tín hiệu tiết pelB. bằng sốc nhiệt. Chủng tái tổ hợp được sàng lọc<br /> Trình tự tín hiệu tiết pelB dự đoán sẽ bị cắt bỏ trên môi trường LB chứa kháng sinh ampicillin<br /> cùng với alanin (Ala) và Met ở đầu N trong quá (Amp) nồng độ cuối cùng 100 µg/ml và được nuôi<br /> trình chuyển từ tế bào chất ra khoang chu chất cấy trong môi trường lỏng cho tách chiết DNA<br /> để tạo protein IL-2 trưởng thành. plasmid. Các plasmid tái tổ hợp này được cắt<br /> kiểm tra bằng cặp enzyme hạn chế Not I và Nde<br /> I đồng thời được tinh sạch để kiểm tra trình tự<br /> 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP gen bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới<br /> 2.1. Vật liệu và hóa chất (New Generation sequencing).<br /> <br /> * Chủng vi sinh vật 2.2.2. Thiết kế chủng biểu hiện E. coli BL21<br /> Chủng E. coli DH10B được sử dụng làm mang plasmid tái tổ hợp pET22_IL-2_pelB<br /> chủng tách dòng gen; chủng E. coli BL21 (DE3) và chaperone GroESL<br /> được sử dụng làm chủng biểu hiện gen. Để tạo được chủng E. coli BL21 biểu hiện<br /> protein IL-2 và chaperone GroESL, trước hết<br /> * Plasmid<br /> chúng tôi biến nạp plasmid pKY106 mang<br /> Plasmid pJET1/blunt được sử dụng làm chaperone GroESL vào tế bào E. coli BL21 và<br /> vector tách dòng; plasmid pET22b(+) được sử chọn lọc trên môi trường LB có tetracyline nồng<br /> dụng làm vector biểu hiện; plasmid pKY106 độ 12,5 µg/ml để tạo chủng E. coli BL21 mang<br /> mang chaperon GroESL được biểu hiện kèm với chaperone GroESL. Chủng E. coli tái tổ hợp này<br /> IL-2; plasmid pET22-thio được sử dụng làm được sử dụng làm tế bào khả biến và biến nạp<br /> vector biểu hiện kèm với IL-2. plasmid tái tổ hợp pET22IL-2 vào, và chọn lọc<br /> * Hóa chất và enzyme dùng trong sinh học trên môi trường LB chứa 2 loại kháng sinh là<br /> phân tử: SDS, tris HCl, Acrylamide/Bis- ampicillin nồng độ 50 µg/ml và tetracyline nồng<br /> <br /> <br /> 778<br />  Lê Thị Lan Anh, Lê Phương Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hồng,<br /> Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Hằng, Trương Nam Hải<br /> <br /> <br /> độ 12,5 µg/ml. Chủng E. coli BL21 chứa cả 2 30 phút. Tiếp đến, tiến hành siêu âm 3 lần mối<br /> plasmid pKY106 và pET22IL-2 sẽ phát triển trên lần 20 giây. Mẫu sau khi siêu âm được ly tâm ở<br /> môi trường chứa cả hai loại kháng sinh trên. 13000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển pha tan<br /> (phần dịch phía trên) sang ống eppendorf mới.<br /> 2.2.3. Thiết kế chủng biểu hiện E. coli BL21 Còn phần cặn tế bào (pha không tan) được hòa<br /> mang plasmid tái tổ hợp pET22_IL-2_pelB lại trong 100µl đệm TE. Tiếp đó, bổ sung 20µl<br /> và thioredoxin đệm xử lý protein vào cả pha tan và pha không<br /> Để tạo được chủng E. coli BL21 biểu hiện tan. Biến tính ở 100ºC trong 15 phút. Cuối cùng,<br /> protein IL-2 và thioredoxin, quá trình thực hiện thu toàn bộ mẫu và chạy điện di protein.<br /> cũng giống với thiết kế chủng E. coli BL21 biểu<br /> 2.2.6. Kỹ thuật Western blot<br /> hiện protein IL-2 và chaperone GroESL. Trước<br /> hết chúng tôi biến nạp plasmid pET22thio mang Chạy điện di biến tính protein bằng SDS-<br /> Trx vào tế bào E. coli BL21 và chọn lọc trên môi PAGE với các mẫu tương ứng. Sau đó chuyển<br /> trường LB có kanamycin nồng độ 25 µg/ml để protein sang màng PVDF trong dung dịch đệm<br /> tạo chủng E. coli BL21 mang Trx. Chủng E. coli (Tris-HCl 48mM, Glycine 39mM, ethanol 20%)<br /> tái tổ hợp này được sử dụng làm tế bào khả biến để lạnh trong 15 phút ở 15 V. Màng sau khi<br /> và biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22IL-2 vào chuyển được phủ trong dung dịch sữa đã tách bơ<br /> và chọn lọc trên môi trường LB chứa 2 loại (skim milk) 5% trong dung dịch TBS1x (Tris-<br /> kháng sinh là ampicillin nồng độ 50 µg/ml và HCl 1M, pH = 7.5, NaCl 5M ), ở 4ºC qua đêm.<br /> kanamycin nồng độ 25 µg/ml. Chủng E. coli Sau đó, tiến hành rửa màng bằng dung dịch<br /> BL21 chứa cả 2 plasmid pET22thio và TTBS 1x (TBS 1x bổ sung 0,1% Tween-20) 3<br /> pET22IL-2 sẽ phát triển trên môi trường chứa lần, mỗi lần 10 phút. Tiếp đó, rửa màng bằng<br /> cả hai loại kháng sinh trên. dung dịch TBS 1x, rửa 3 lần mỗi lần 5 phút.<br /> Phủ kháng thể 1 (kháng thể kháng IL-2 của<br /> 2.2.4. Cảm ứng để biểu hiện protein tái tổ hợp<br /> chuột) pha loãng 5000 - 10000 lần trong sữa<br /> Nuôi cấy qua đêm một khuẩn lạc (sản phẩm skim milk 5%. Lắc ở nhiệt độ phòng (25ºC) trong<br /> biến nạp) trong môi trường LB lỏng có bổ sung<br /> 1 giờ. Rửa màng một lần nữa lần lượt trong<br /> Amp đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml (môi<br /> dung dịch TTBS 1x và TBS 1x. Phủ kháng thể 2<br /> trường LBAmp) lắc 200 vòng/phút ở 37ºC qua<br /> (kháng thể kháng chuột) trong 1 giờ. Rửa màng<br /> đêm. Dịch nuôi cấy được chuyển sang môi<br /> lần cuối và hiện màu bằng dung dịch hiện màu<br /> trường LBAmp để đạt OD600 ban đầu là 0,1nm<br /> TMB (Tetramethylbenzidine (TMB) liquid<br /> nuôi trong 2 giờ ở 37ºC cho đến khi OD600 đạt<br /> substrate system for membranes).<br /> 0,6 – 0,7nm, lấy mẫu ra tiến hành cảm ứng<br /> bằng 1mM IPTG. Mẫu được thu sau cảm ứng 4<br /> giờ. Protein tổng hợp được kiểm tra bằng điện di 3. KẾT QUẢ<br /> protein trên gel polyacrylamide SDS-PAGE và<br /> 3.1. Biểu hiện protein IL-2 gắn tín hiệu tiết<br /> kiểm tra tính bắt cặp đặc hiệu với kháng thể<br /> pelB tái tổ hợp<br /> kháng IL-2 bằng western blot.<br /> Đoạn gen il-2 được gắn thêm trình tự tín<br /> 2.2.5. Phương pháp thu protein tan và hiệu tiết pelB để giúp cho protein IL-2 sau khi<br /> không tan tổng hợp được chuyển từ nhân qua màng và ra<br /> Dịch tế bào được li tâm 5000 vòng/phút khoang chu chất. Trong quá trình vận chuyển,<br /> trong 5 phút loại dịch nổi. Tủa tế bào được hòa tín hiệu tiết pelB sẽ được cắt bởi các peptidase<br /> lại trong dung dịch đệm TE (Tris 20mM, EDTA trên màng tế bào chất để tạo protein IL-2 dạng<br /> 10mM, PMSF 0,05mM). Mẫu được để tủ lạnh - đơn không có methionine ở đầu N với kích thước<br /> 80°C trong 1 giờ. Sau đó làm tan ở 50°C trong khoảng 15 kDa.<br /> <br /> <br /> <br /> 779<br /> Biểu hiện gen mã hóa IL-2 của người với chaperone groesl và thioredoxin trong tế bào Escherichia coli BL21 (DE3)<br /> <br /> <br /> <br /> kDa M 1 2 3 4 5 6 7 1 2 M 3 4 5 6<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> IL-2 pelB<br /> IL-2 TQ<br /> <br /> <br /> (a) (b)<br /> <br /> <br /> kDa M 1 2 3 4 5 6 7 1 2 M 3 4 5 6<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> IL-2 pelB<br /> IL-2 TQ<br /> <br /> <br /> (a) (b)<br /> <br /> <br /> Hình 1. Điện di đồ kiểm tra protein tái tổ hợp IL-2 trên SDS-PAGE (a)<br /> và bằng kỹ thuật Western blot (b)<br /> Ghi chú: a) M: Thang chuẩn protein (Fermentas); 1-4: Các dòng tế bào E. coli BL21 (DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET22_IL-<br /> 2_pelB; 5: Dòng tế bào E. coli BL21 không mang plasmid tái tổ hợp; 6: Đối chứng âm (không cảm ứng bởi IPTG); 7: Đối chứng<br /> dương (IL-2 Trung Quốc).<br /> b) M: Thang chuẩn protein (Fermentas); 1-4, 6: Các dòng tế bào E. coli BL21 (DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET22IL-2;<br /> 5: Đối chứng dương (IL-2 Trung Quốc).<br /> <br /> <br /> Quan sát kết quả điện di trên hình 1a cho kết quả kiểm tra bằng kỹ thuật Western blot<br /> thấy, các protein IL-2 được tổng hợp đều có cũng đã khẳng định protein IL-2 biểu hiện có<br /> kích thước khoảng gần 20 kDa (đường chạy 1- khả năng liên kết đặc hiệu với kháng thể<br /> 4), cao hơn protein chuẩn Trung Quốc có kích kháng IL-2 của chuột. Một số dòng tế bào có<br /> thước khoảng 15 kDa (đường chạy số 7). Kết hai băng protein biểu hiện (đường chạy 2, 8;<br /> quả này cho thấy protein IL-2 được biểu hiện hình 1b) có thể do protein IL-2 bị phân cắt<br /> vẫn còn gắn với tín hiệu tiết pelB. Ngoài ra trong quá trình biểu hiện.<br /> <br /> 780<br />  Lê Thị Lan Anh, Lê Phương Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hồng,<br /> Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Hằng, Trương Nam Hải<br /> <br /> <br /> 3.2. Khảo sát tính tan của protein tái tổ Sự biểu hiện quá mức của protein trong<br /> hợp IL-2 trong E. coli BL21(DE3) chủng chủ sẽ dẫn đến sự biểu hiện các protein<br /> Protein IL-2 biểu hiện vẫn còn gắn tín hiệu sai cấu trúc và tồn tại dạng không tan.<br /> tiết pelB có thể là do protein được biểu hiện ở Chaperon heat shock GroESL đóng vai trò<br /> dạng không tan (inclusion bodies), vì vậy quan trọng biểu hiện cùng với protein đích làm<br /> protein khó có thể đi qua được màng tế bào chất tăng tính tan của protein biểu hiện dạng không<br /> nơi chứa các enzyme peptidase tham gia vào tan trong E. coli và đã được chứng minh là đạt<br /> quá trình cắt tín hiệu tiết pelB. Do vậy, để kết quả như mong muốn (Martinez et al.,<br /> khẳng định protein IL-2 biểu hiện vẫn còn gắn 2010). Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến<br /> tín hiệu tiết pelB hay không, chúng tôi tiến hành biểu hiện kèm chaperone plasmid<br /> khảo sát tính tan của IL-2. Kết quả kiểm tra pKY106 (chứa 2 protein GroEL và GroES) cùng<br /> được biểu hiện trên hình 2. với plasmid pET22_IL-2_pelB trong dòng tế<br /> Kết quả điện di trên hình 2 cho thấy, toàn bào E. coli BL21. Kết quả biểu hiện được biểu<br /> bộ protein tái tổ hợp được tổng hợp đều tồn tại ở hiện trong hình 3.<br /> dạng không tan (đường chạy số 3 và số 6) và Kết quả điện di trên hình 3 cho thấy, cả<br /> không thấy xuất hiện băng protein IL-2 ở pha hai protein GroEL và GroES đều biểu hiện ở<br /> tan (đường chạy 2, 5). Kết quả này có thể được<br /> mức cao và đúng kích thước khoảng 60 và 14<br /> giải thích là do các protein biểu hiện có thể cuộn<br /> kDa cùng với IL-2 có kích thước khoảng 20<br /> chặt vào nhau, vì vậy rất khó để vận chuyển<br /> kDa (đường chạy 3, 5, 7, 8, 10). Kích thước<br /> qua màng ra khoang chu chất. Để tăng khả<br /> phân tử của protein IL-2 chứng tỏ tín hiệu tiết<br /> năng biểu hiện protein ở dạng tan và giúp<br /> protein cuộn xoắn đúng cấu trúc, chúng tôi đã pelB của protein này vẫn vẫn chưa được cắt.<br /> tiến hành nghiên cứu biểu hiện protein đích Điều này cho thấy mặc dù IL-2 đã được biểu<br /> cùng với chaperone hoặc với Trx (Bazewicz et hiện kèm với chaperon nhưng chưa làm tăng<br /> al., 2012). tính tan của IL-2, protein vẫn bị cuộn xoắn và<br /> chưa được vận chuyển ra ngoài màng tế bào, do<br /> 3.3. Biểu hiện đồng thời plasmid tái tổ hợp vậy mà vẫn protein IL-2 biểu hiện vẫn chứa<br /> pET22_IL-2_pelB và chaperon GroESL tín hiệu tiết pelB.<br /> <br /> <br /> 1 2 3 M 4 5 6 7 8 kDa<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 35<br /> <br /> <br /> 25<br /> <br /> 18,4<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 14,4<br /> IL-2-pelB<br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Điện di SDS-PAGE kiểm tra tính tan của protein tái tổ hợp IL-2<br /> <br /> 1-3: Dòng tế bào E. coli BL21 (DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET_IL-2_pelB dòng số 1 (1: protein tổng số; 2: protein tan; 3:<br /> protein không tan); 4-6: Dòng tế bào E. coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET_IL-2_pelB dòng số 2 (4: protein tổng số;<br /> 5: protein tan; 6: protein không tan); 7: Đối chứng dương (IL-2 Trung Quốc; 8: Dòng tế bào E. coli BL21(DE3) không mang<br /> plasmid tái tổ hợp.<br /> <br /> <br /> <br /> 781<br /> Biểu hiện gen mã hóa IL-2 của người với chaperone groesl và thioredoxin trong tế bào Escherichia coli BL21 (DE3)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 12 13 14 kDa<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> GroEL<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> IL-2-pelB<br /> <br /> <br /> GroES<br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Điện di đồ kiểm tra kết quả đồng biểu hiện protein IL-2<br /> gắn tín hiệu tiết pelB và chaperone GroELS<br /> <br /> 1 – 13: Các dòng tế bào E. coli BL21 (DE3) biểu hiện protein tái tổ hợp IL-2 gắn tín hiệu tiết pelB; 14: Đối chứng dương (IL-2<br /> chuẩn Trung Quốc); M: Thang chuẩn protein.(fermentas).<br /> <br /> <br /> <br /> 3.4. Biểu hiện đồng thời protein tái tổ hợp khuẩn. Để cải thiện tính tan của protein biểu<br /> IL-2 với Trx hiện trong E. coli ngoài các phương pháp tối ưu<br /> Ngoài việc biểu hiện cùng với chaperone điều kiện biểu hiện như nhiệt độ, môi trường<br /> GroESL, chúng tôi tiến hành biểu hiện protein nuôi cấy và nồng độ chất cảm ứng IPTG, một số<br /> đích cùng với Trx để nhằm nâng cao tính tan nghiên cứu đã cho rằng việc biểu hiện protein<br /> của protein khi biểu hiện trong E. coli. Hai kèm với một số chaperone làm tăng lượng<br /> vector pET22_IL-2_pelB và pET22thio- protein biểu hiện đúng cấu trúc trong bộ máy vi<br /> kanamycine chứa trình tự protein Trx được biến khuẩn (Martinez, 2010) như DnaK (DnaK,<br /> nạp đồng thời và biểu hiện trong tế bào E. coli DnaJ và GrpE) và GroESL (GroEL và GroES)<br /> BL21 (DE3). Kết quả phân tích protein trên gel giúp ngăn cản sự hình thành protein dạng<br /> SDS-PAGE trên hình 4a cho thấy, Trx được không tan và giúp protein cuộn xoắn đúng cấu<br /> biểu hiện tốt có kích thước khoảng 25 kDa. Tuy trúc. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng<br /> nhiên, protein IL-2 vẫn được biểu hiện kèm với tôi cho thấy mặc dù protein IL-2 đã biểu hiện<br /> tín hiệu tiết pelB với kích thước khoảng 20 kDa đồng thời cùng với các chaperone GroESL và<br /> (đường chạy 1-6), cao hơn so với đối chứng Trx nhưng tất cả protein IL-2 vẫn đều ở dạng<br /> protein IL-2 IBT. Kết quả Western blot cũng không tan và tín hiệu cắt pelB vẫn chưa được<br /> khẳng định IL-2 đã được biểu hiện cùng với loại bỏ. Kết quả này trái ngược với công bố của<br /> protein Trx trong E. coli (Hình 4b). Takashi Yasukawa et al. (1995) cho rằng biểu<br /> hiện kèm với chaperones GroESL làm tăng tính<br /> 4. THẢO LUẬN tan của 4 trong 8 protein nghiên cứu khi biểu<br /> Các kết quả biểu hiện IL-2 với tín hiệu pelB hiện trong E. coli, trong khi protein thioredoxin<br /> trong E. coli BL21 (DE3) cho thấy protein này giúp làm tăng hiệu quả tính tan của 8 protein<br /> chủ yếu tồn tại ở dạng không tan trong tế bào nghiên cứu. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của<br /> chất. Các protein có nguồn gốc từ Eukaryote chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của<br /> thường bị biểu hiện ở dạng không tan là một Gabrielhea Halfmann et al. (1993) khi biểu hiện<br /> trong những bất lợi khi biểu hiện trong hệ vi IL-2 gắn tín hiệu tiết OmpA hay PhoA đã<br /> <br /> 782<br />  Lê Thị Lan Anh, Lê Phương Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hồng,<br /> Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Hằng, Trương Nam Hải<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Kết quả biểu hiện protein IL-2 đồng thời với Trx (a) và Western blot (b)<br /> <br /> 1,2, 4-7: Các dòng tế bào E. coli BL21 biểu hiện đồng thời hai protein IL-2 và Trx; 3: Mẫu IL-2 chuẩn Trung Quốc; M: Thang<br /> chuẩn protein (Fermentas); 8: Mẫu đối chứng âm không cảm ứng IPTG.<br /> Các đường chạy tương tự như bản điện di (a)<br /> <br /> <br /> không làm tăng tính tan của protein khi biểu hiện của protein IL-2 cùng với chaperone<br /> hiện kèm với chaperone GroESL. Như vậy, kết GroESL và thioredoxin vẫn không làm tăng<br /> quả của chúng tôi có thể được giải thích do tính tan của protein tái tổ hợp và không loại bỏ<br /> protein IL-2 cuộn xoắn quá nhanh sau khi tổng được tín hiệu tiết pelB khỏi cấu trúc của IL-2.<br /> hợp, khiến các trình tự tín hiệu tiết không thể<br /> hướng protein đi vào bộ máy vận chuyển TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> protein, do vậy chaperone và thioredoxin không Hyung JC, H.S., Hye J.L., Hye S.C., Nimish N.D.,<br /> kịp tham gia vào quá trình làm tan và cắt tín Minh Q.P., William E.B. (2005). Comparative<br /> hiệu tiết pelB. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, production of human interleukin-2 fused with<br /> green fluorescent protein in several recombinant<br /> với những protein cso cầu nối disulfide như IL- expression systems. Biochem Engin J., 24: 225-<br /> 2, khi được đồng biểu hiện vời Trx sẽ tạo protein 233.<br /> tan và có hoạt tính sinh học tốt hơn do Trx làm Liang, S.M., et al. (1985). Characterization of human<br /> giảm tính khử trong khoang chu chất và giúp interleukin 2 derived from Escherichia coli.<br /> protein cuộn xoắn được tốt hơn. Tuy nhiên, Biochem J, 229(2): 429-439.<br /> nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng protein IL- Marcker, K. and Sanger F. (1964). N-Formyl-<br /> Methionyl-S-Rna. J Mol Biol, 8: 835-840.<br /> 2 tạo ra vẫn tồn tại dạng không tan và còn gắn<br /> Fernandez-San Millan, A., et al. (2007). Expression of<br /> trình tự tín hiệu tiết pelB. Mặc dù kết quả nghiên recombinant proteins lacking methionine as N-<br /> cứu này chưa làm tăng tính tan của protein IL-2 terminal amino acid in plastids: human serum<br /> nhưng đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về albumin as a case study. J Biotechnol, 127(4): 593-<br /> 604.<br /> việc biểu hiện protein này đồng thời với hai hệ<br /> thống chaperone GroESL và Trx, từ đó giúp cho Bazewicz, C.G., et al. (2012). Expanding the utility of<br /> 4-cyano-L-phenylalanine as a vibrational reporter<br /> việc định hướng và lựa chọn các hệ biểu hiện thích of protein environments. J Phys Chem B, 116(35):<br /> hợp đối với gen mã hóa il-2 ở người. 10824-10831.<br /> Martinez-Alonso, M., et al. (2010). Side effects of<br /> chaperone gene co-expression in recombinant<br /> 5. KẾT LUẬN protein production. Microb Cell Fact, 9: 64.<br /> Protein IL-2 được biểu hiện trong dòng tế Halfmann, G., et al. (1993). Targeting of interleukin-2<br /> bào E. coli BL21 (DE3) có gắn tín hiệu tiết pelB to the periplasm of Escherichia coli. J Gen<br /> ở dạng không tan trong tế bào chất. Sự biểu Microbiol, 139(10): 2465-2473.<br /> <br /> <br /> 783<br />