Nguyễn Hà Thu và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
184(08): 35 - 40<br />
<br />
BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH AMIDASE ALIPHATIC<br />
TỪ Rhodococcus erythropolis PR4<br />
Nguyễn Hà Thu1*, Nguyễn Xuân Vũ1, Phạm Bằng Phương1,2<br />
1<br />
<br />
Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên<br />
2<br />
Viện Khoa học Sự sống – ĐH Thái Nguyên<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Để phục vụ mục đích nghiên cứu mức độ biểu hiện trong vi khuẩn E. coli BL21 DE3 của gen mã<br />
hóa amidase khuếch đại từ DNA hệ gen của vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4, chúng tôi đã<br />
tiến hành biểu hiện và tinh sạch amidase tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli chủng BL21 DE3.<br />
Protein - enzyme amidase ở vi khuẩn này được mã hóa nhờ đoạn gen có kích thước 1038 bp đã<br />
được giải trình tự và công bố trên ngân hàng gen với số hiệu ACNO01000111. Sau khi thiết kế<br />
mồi và khuếch đại thành công đoạn gen, chúng tôi tiến hành tách dòng trên E. coli DH5α và biểu<br />
hiện trên E. coli BL21 DE3 thông qua 2 loại vector tương ứng là pGEM-T và pET28a. Enzyme<br />
amidase có kích thước xấp xỉ 38 kDa được biểu hiện tối ưu ở điều kiện nuôi cấy 37 oC, nồng độ<br />
chất cảm ứng IPTG 1 mM trong thời gian 4 h. Sử dụng cột sắc ký trao đổi ion Macro-Prep High Q<br />
(BIO-RAD) và cột superdexTM 200 10/300 (GE Healthcare), chúng tôi đã tinh sạch được amidase<br />
tái tổ hợp từ dịch chiết tế bào.<br />
Từ khóa: Amidase; Escherichia coli; Acrylamide; Enzyme tái tổ hợp; Vector biểu hiện<br />
<br />
MỞ ĐẦU*<br />
Amidase (EC 3.5.1.4) được tìm thấy bởi<br />
Mohamed S. và cộng sự vào năm 1994, có<br />
kích thước xấp xỉ 44,5 kDa (xác định bằng<br />
SDS-PAGE) và điểm đẳng điện được ước<br />
tính là pH 4.0. Trình tự aa N-terminal của<br />
enzyme này được công bố như sau: M R H G<br />
D I T S S P D T V G V A V [7].<br />
Amidase được biết đến là enzyme xúc tác quá<br />
trình thủy phân amit giải phóng các axit và<br />
amoniac tương ứng [6]. Enzyme này có thể<br />
được phân thành hai loại theo đặc tính bề mặt<br />
của chúng [2], loại thứ nhất bao gồm các<br />
amidase chỉ làm thuỷ phân các amit mạch<br />
ngắn, loại thứ hai là các amidase thủy phân<br />
chuỗi amit mạch trung bình, acrylamide và<br />
heterocyclicamide như isobutyramide và<br />
valeroamide [3]. Đến nay, đã có hơn 26 loại<br />
amidase có nguồn gốc từ vi khuẩn được sàng<br />
lọc và xác định [5]. Hầu hết trong đó, amidase<br />
tồn tại ở loại thứ hai.<br />
Amidase được ghi nhận là có mặt thường<br />
xuyên ở chi Rhodococcus. Theo nghiên cứu<br />
gần đây của Z. Xue và cs (2011) [6], amidase<br />
tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn<br />
*<br />
<br />
Tel:01643 326153, Email: thunguyenty43@gmail.com<br />
<br />
Rhodococcus erythropolis, một loài vi khuẩn<br />
đặc trưng thuộc nhóm Actinobacteria có khả<br />
năng biểu hiện đầy đủ hoạt tính của amidase<br />
đặc biệt là khả năng tổng hợp chọn lọc bất đối<br />
xứng hiệu quả với một phổ rộng các amit (nổi<br />
bật là một số chất gây độc cho tế bào như<br />
acetamide, propionamide, acrylamide, và<br />
benzamide). Đồng thời trong vi khuẩn này,<br />
gen mã hóa amidase có kích thước 1038 bp<br />
đã được giải trình tự một cách đầy đủ và<br />
công bố trên ngân hàng gen với số hiệu<br />
ACNO01000111 từ nucleotide số 543918<br />
đến nucleotide 544955 [7].<br />
Amidase là loại enzyme thương mại có nhiều<br />
ứng dụng quan trọng trong các ngành công<br />
nghiệp, cụ thể là trong các quy trình liên quan<br />
đến quản lý và xử lý chất thải có chứa<br />
acrylamide, mặt khác sau khi thủy phân,<br />
amidase tạo ra một số axit cacboxylic và dẫn<br />
xuất amit có nhiều ý nghĩa quan trọng ứng<br />
dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp<br />
dược phẩm [4].<br />
Do có nhiều tiềm năng quan trọng trong các<br />
ngành công nghiệp, amidase đã được đầu tư<br />
nghiên cứu rộng rãi ngay từ khi được phát<br />
hiện. Nhưng khi nhu cầu ứng dụng trong công<br />
nghiệp ngày càng tăng cao thì cần có nhiều<br />
35<br />
<br />
Nguyễn Hà Thu và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
nghiên cứu tập trung và triệt để nhằm nâng<br />
cao năng suất và hoạt tính amidase thông qua<br />
khuếch đại gen và biểu hiện amidase tái tổ<br />
hợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khuếch đại<br />
đoạn gen mã hóa amidase bằng kỹ thuật PCR<br />
từ chủng vi khuẩn Rhodococcus erythropolis<br />
PR4, chọn dòng bằng vector pGEM T-easy,<br />
biểu hiện qua vector pET28a trong vi khuẩn<br />
E.coli và tinh sạch nhờ vào hệ thống sắc ký<br />
ion Macro-Prep High Q (BIO-RAD).<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
Vật liệu:<br />
- Mồi:<br />
Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu để<br />
khuếch đại gen amidase aliphatic (amiE).<br />
Trình tự mồi được thiết kế dựa vào trình tự<br />
gen amiE của Rhodococcus erythropolis PR4<br />
đã công bố trên ngân hàng gen (Genbank) với<br />
với số hiệu ACNO01000111 từ nucleotide số<br />
543918 đến nucleotide 544955, được đặt mua<br />
từ công ty Genotech.<br />
Hai mồi mỗi đoạn dài 27 bp được thiết kế như sau:<br />
Mồi xuôi amiE-F (EcoRI): GAATTC ATG<br />
CGA CAC GGT GAC ATC TCC.<br />
Mồi ngược amiE-R (SalI): GTCGAC TTA<br />
AAC TTC GAT TGT CTT CTC.<br />
- Chủng giống<br />
Vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4<br />
được phân lập từ nước biển Thái Bình Dương<br />
do trung tâm NITE Biological esource Nhật<br />
Bản cung cấp.<br />
Vi khuẩn E. coli DH5α, JM109 dùng cho tách<br />
dòng và E. coli BL21 DE3 PlysS dùng cho<br />
biểu hiện do Viện Khoa học Sự sống – Đại<br />
học Thái Nguyên cung cấp.<br />
Vector tách dòng pGEM-T easy thương mại<br />
được cung cấp bởi Promega; vector biểu hiện<br />
pET28a thương mại được cung cấp bởi<br />
Novagen.<br />
Phương pháp<br />
- Khuếch đại và tinh sạch gen<br />
Sử dụng bộ kit DNA purification của<br />
Promega tách chiết DNA hệ gen của<br />
Rhodococcus erythropolis PR4.<br />
36<br />
<br />
184(08): 35 - 40<br />
<br />
Khuếch đại gen amiE từ hệ gen của<br />
Rhodococcus erythropolis PR4 theo quy trình<br />
ExTaq DNA polymerase của Takara Biotech<br />
Co. Ltd., Dalian, Trung Quốc.<br />
Sản phẩm PCR được tinh sạch qua bộ kit<br />
QAEX II gel extraction (Qiagen).<br />
- Tách dòng và biểu hiện<br />
Gắn nối đoạn gen đã được tinh sạch vào<br />
vector tách dòng pGEM T-easy vector nhờ<br />
enzyme T4 ligase (ủ trong 22oC trong 1 h).<br />
Sản phẩm gắn nối được biến nạp vào E.coli<br />
DH5α (JM109) và được cấy trải trên đĩa thạch<br />
LB-Amp qua đêm (hoặc trong 16 h). Nuôi<br />
lỏng khuẩn lạc và tách chiết plasmid từ dịch<br />
nuôi (16 h hoặc qua đêm) bởi bộ kit<br />
FavorPrepTM Plasmid extraction mini kit<br />
(Favorgen). Sử dụng enzyme giới hạn EcoRI<br />
và SalI cắt đoạn gen đã được tách dòng thành<br />
công trên vector pGEM T-easy, gắn nối vào<br />
vector biểu hiện pET28a và biến nạp vào<br />
E.coli BL21 DE3PlysS. Cảm ứng biểu hiện<br />
gen trong vi khuẩn E. coli bằng cách bổ sung<br />
vào môi trường nuôi khuẩn isopropyl-βgalactopyranoside (IPTG) với nồng độ 1 mM.<br />
- Tinh sạch enzyme amidase tái tổ hợp<br />
Chọn dòng vi khuẩn đã biểu hiện thành công<br />
gen amiE. Bổ sung 1 mM (IPTG) khi nồng độ<br />
OD600 của môi trường nuôi đạt ~ 0,6 nuôi<br />
37oC trong 4 h để kích hoạt vùng operon của<br />
đoạn gen. Sau đó, li tâm dịch khuẩn ở 6000<br />
vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào. Phân<br />
giải tế bào với Tris buffer (50 mM TrisHCl,<br />
50 mM NaCl, pH 8,0). Sản phẩm sau khi<br />
phân giải được thu lại bằng đặt vào màng lọc<br />
đường kính 0,22 m và ly tâm 14000 vòng/<br />
phút trong 20 phút ở 4C. Cho phần dịch chảy<br />
qua cột sắc ký trao đổi ion Macro-Prep High<br />
Q (BIO-RAD) với đệm đẩy Tris. Sau đó, sản<br />
phẩm sẽ được rửa giải bằng dung dịch đệm<br />
với các gradient nồng độ muối NaCl tăng dần<br />
hoặc với gradient pH (nhờ sự bổ sung axit<br />
lactic pH 4,5). Amidase tiếp tục được tinh<br />
sạch bằng cách đưa vào cột superdexTM 200<br />
10/300 (GE Healthcare). Sau khi qua các bước<br />
ly trích và tinh sạch, sản phẩm đều được kiểm<br />
tra lại độ tinh sạch của protein nhờ kỹ thuật<br />
<br />
Nguyễn Hà Thu và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
điện di trên gel SDS-PAGE 12,5% [1]. Tất cả<br />
các bước đều được thực hiện ở 4°C để bảo vệ<br />
hoạt tính của enzyme.<br />
<br />
184(08): 35 - 40<br />
<br />
hành tinh sạch và điện di kiểm tra độ tinh<br />
sạch (hình 2b).<br />
<br />
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
Tách dòng và biểu hiện PR4 amidase<br />
- Tách chiết DNA hệ gen của Rhodococcus<br />
erythropolis PR4<br />
Rhodococcus erythropolis PR4 được nuôi<br />
trong môi trường NBRC 702. Ly tâm dịch<br />
nuôi ở 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu<br />
cặn tế bào. Sau đó, tách chiết DNA hệ gen<br />
bằng bộ kit do Promega cung cấp.<br />
<br />
Hình 1. Tách chiết DNA hệ gen của Rhodococcus<br />
erythropolis PR4. Giếng M: Lambda HindIII marker;<br />
giếng PR4: DNA hệ gen của Rhodococcus<br />
erythropolis PR4<br />
<br />
Sau khi tách chiết DNA hệ gen, sản phẩm<br />
được kiểm tra bằng cách điện di qua gel<br />
agarose 1%. Kết quả điện di thể hiện trên hình<br />
1 cho thấy, DNA hệ gen không bị đứt gãy, đủ<br />
điều kiện để sử dụng cho các nghiên cứu về<br />
khuếch đại gen.<br />
<br />
2322 bp<br />
2027 bp<br />
<br />
564 bp<br />
<br />
a<br />
b<br />
Hình 2. Khuếch đại đoạn gen amiE. a. Giếng M:<br />
Lambda HindIII marker; giếng PR4: Sản phẩm<br />
PCR khuếch đại amiE. b. Giếng PR4(1,2): Sản<br />
phẩm PCR khuếch đại amiE đã tinh sạch<br />
<br />
- Kết quả tách dòng trên vector pGEM Teasy vector<br />
Sản phẩm PCR đã tinh sạch được gắn nối vào<br />
vector tách dòng pGEM T-easy (3000 bp) ở<br />
25oC trong 1 h. Sản phẩm gắn nối được biến<br />
nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và cấy<br />
trải trên môi trường LB có bổ sung ampicillin,<br />
IPTG và X-gal.<br />
<br />
4361 bp<br />
2322 bp<br />
<br />
- Khuếch đại gen mã hóa amidase<br />
Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi<br />
amiE-F và amiE-R để khuếch đại đoạn gen<br />
mã hóa amidase ở vi khuẩn Rhodococcus<br />
erythropolis PR4. Kết quả điện di trên gel<br />
agarose 0,8% cho thấy, sản phẩm PCR thu<br />
được bằng điện di có kích thước như tính toán<br />
lý thuyết khoảng 1 kb (hình 2a). Do có kết<br />
quả này phù hợp với kích thước đoạn gen do<br />
ngân hàng gen công bố nên sau khi được<br />
khuếch đại thành công, đoạn gen được tiến<br />
<br />
Hình 3. Kết quả tách chiết plasmid.<br />
Giếng M: Lambda HindIII marker;<br />
giếng 1: Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc xanh;<br />
giếng 2-8: Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc trắng<br />
<br />
Sau khi nuôi qua đêm ở 37oC, thu được 23<br />
khuẩn lạc xanh (KLX - gắn nối không thành<br />
công) và 88 khuẩn lạc trắng (KLT - gắn nối<br />
thành công). Chọn các dòng khuẩn lạc trắng<br />
và xanh (đối chứng) nuôi tăng sinh trong LB<br />
lỏng để tách chiết plasmid và kiểm tra kích<br />
thước vector (hình 3).<br />
37<br />
<br />
Nguyễn Hà Thu và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
4361 bp<br />
<br />
184(08): 35 - 40<br />
<br />
dòng thành công và vector pET28 đã cắt mở<br />
vòng bởi EcoRI và SalI.<br />
Kết quả hình 6 cho thấy, tất cả các sản phẩm<br />
gắn nối (5-8) đều có băng ở kích thước trên<br />
6500 bp (kích thước dự kiến khi gắn nối<br />
thành công gen vào vector là 6407 bp).<br />
<br />
2322 bp<br />
<br />
Hình 4. Sản phẩm cắt các dòng có khả năng mang<br />
gen amiE với EcoRI và SalI. Giếng M: Lambda<br />
HindIII marker. Giếng 1: Plasmid tách chiết từ<br />
KLX; giếng 2, 3: Plasmid tách chiết từ KLT số 1<br />
và 2 được cắt bởi EcoRI và SalI; giếng 4: Sản<br />
phẩm PCR khuếch đại amiE đã tinh sạch<br />
<br />
Những dòng khuẩn lạc cho plasmid có kích<br />
thước lớn hơn so với đối chứng tiếp tục được<br />
chọn lọc bằng enzyme giới hạn EcoRI và<br />
SalI. Kết quả được thể hiện ở hình 4 cho thấy,<br />
các dòng khuẩn lạc số 1 và 2 đều cho 2 băng<br />
ứng với kích thước lý thuyết lần lượt xấp xỉ là<br />
3000 bp của pGEM T-easy và 1000 bp của<br />
amiE. Như vậy đã tách dòng thành công đoạn<br />
gen amiE.<br />
<br />
6557 bp<br />
2027 bp<br />
<br />
6557 bp<br />
2027 bp<br />
<br />
Hình 6. Gắn nối amiE vào pET28a. Giếng M:<br />
Lambda HindIII marker; giếng 1,2: Đoạn gen<br />
amiE thu được từ vector pGEM-amiE T-easy;<br />
giếng 3, 4: pET28 được cắt mở vòng bởi EcoRI và<br />
SalI; giếng 5-8: Sản phẩm gắn nối vào vector<br />
pET28a<br />
<br />
Sản phẩm nghi gắn nối thành công được biến<br />
nạp vào tế bào khả biến E.coli XL1 blue và<br />
cấy trải trên đĩa thạch nuôi ở 37oC qua đêm.<br />
Các dòng khuẩn lạc được chọn lọc ngẫu nhiên<br />
nuôi tăng sinh trong môi trường LB ở 37oC<br />
qua đêm, tách chiết plasmid để sàng lọc các<br />
dòng mang đoạn gen mong muốn.<br />
Kết quả sàng lọc cho thấy, giếng 2, 3, 4 đều cho<br />
băng cao hơn so với đối chứng là vector pET28a<br />
không gắn gen (hình 7), do đó các plasmid này<br />
tiếp tục được kiểm tra sự có mặt của đoạn gen<br />
bằng enzyme giới hạn EcoRI và SalI.<br />
<br />
Hình 5. Đoạn gen amiE thu được sau khi thôi gel<br />
và tinh sạch từ vector tách dòng pGEM-amiE.<br />
Giếng M: Lambda HindIII marker; giếng 1 - 4:<br />
Đoạn gen amiE thu được từ vector pGEM-amiE<br />
<br />
Bằng phương pháp thôi gel tinh sạch, thu được<br />
đoạn gen amiE (~1000 bp) từ vector tách dòng<br />
pGEM-amiE (hình 5 - giếng 1, 2, 3) đủ điều<br />
kiện để gắn nối vào vector biểu hiện.<br />
- Gắn nối vào vector biểu hiện pET28a<br />
Gắn nối đoạn gen amiE vào vector biểu hiện<br />
pET28a (5369 bp) ở 16oC trong 16 h (hình 6).<br />
Sản phẩm gắn nối được kiểm tra bằng phương<br />
pháp điện di so sánh với các đoạn gen đã tách<br />
38<br />
<br />
6557 bp<br />
<br />
2027 bp<br />
<br />
Hình 7. Plasmid được tách chiết từ các dòng<br />
khuẩn lạc có khả năng mang gen amiE; giếng M:<br />
Lambda HindIII marker; giếng 1: pET28a; giếng<br />
2, 3, 4: Plasmid nghi ngờ mang gen amiE<br />
<br />
Nguyễn Hà Thu và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
Hình 8 cho thấy, sau khi cắt kiểm tra với 2<br />
enzyme giới hạn, các plasmid nghi ngờ mang<br />
gen đều cho 2 băng ở đúng với kích thước lý<br />
thuyết tương ứng với 5369 bp của pET28a và<br />
1038 bp của gen amiE. Như vậy, đã gắn nối<br />
thành công đoạn gen PR4 amidase vào đúng<br />
vị trí trên vector pET28a.<br />
<br />
184(08): 35 - 40<br />
<br />
Tinh sạch amidase aliphatic PR4<br />
<br />
45 kDa<br />
36 kDa<br />
38 kDa<br />
<br />
45 kDa<br />
36 kDa<br />
38 kDa<br />
<br />
Hình 8. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen ở các<br />
plasmid có khả năng mang gen. Giếng M: Lambda<br />
HindIII marker. Giếng 1: Sản phẩm PCR khuếch<br />
đại amiE đã tinh sạch; giếng 2, 3, 4: Plasmid nghi<br />
ngờ mang gen được cắt với EcoRI và SalI; giếng<br />
5: pET28a; giếng 6: pET28a cắt mở vòng với<br />
EcoRI và SalI<br />
<br />
- Biểu hiện amiE trên E.coli BL21 DE3<br />
Chuyển vector biểu hiện pET28-amiE vào tế<br />
bào khả biến E.coli BL21 DE3PlysS cấy trải<br />
trên đĩa thạch LB nuôi ở 37oC qua đêm và<br />
cảm ứng biểu hiện gen bằng việc bổ sung<br />
IPTG nồng độ 1 mM nuôi trong 4 h. Qua kết<br />
quả điện di SDS-PAGE (hình 9) cho thấy,<br />
phân đoạn protein thu được ở điều kiện thích<br />
hợp có kích thước khoảng 38 kDa, phân đoạn<br />
này không xuất hiện ở mẫu đối chứng không<br />
cảm ứng bằng IPTG.<br />
<br />
Hình 10. Protein amidase đã tinh sạch bằng hệ<br />
thống sắc ký ion Macro-Prep High Q (BIO-RAD).<br />
Giếng M: Protein marker low range M3913 Sigma;<br />
giếng 1: Amidase chưa tinh sạch; giếng 2: Đối<br />
chứng dương; giếng 3,4: Amidase đã tinh sạch<br />
<br />
Amidase sau khi được tinh sạch qua cột sắc<br />
ký ion Macro-Prep High Q (BIO-RAD) và<br />
kiểm tra bằng SDS-PAGE cho kết quả ở<br />
giếng số 3 và 4, một băng duy nhất đúng kích<br />
thước xấp xỉ 38 kDa của enzyme (hình 10).<br />
KẾT LUẬN<br />
Chúng tôi đã thiết kế và khuếch đại thành<br />
công đoạn gen amiE từ chủng Rhodococcus<br />
erythropolis PR4. Đoạn gen amiE đã được<br />
biểu hiện thành công qua vector pET28a<br />
trong E.coli và thu nhận được protein amidase<br />
tái tổ hợp có độ tinh sạch cao với kích thước<br />
tương ứng xấp xỉ 38 kDa.<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
<br />
6557 bp<br />
2027 bp<br />
<br />
Hình 9. Cảm ứng biểu hiện amiE trong tế bào<br />
E.coli BL21 DE3. Giếng M: Protein marker low<br />
range M3913 Sigma; giếng 1: Đối chứng dương PR4amiE E.coli BL21 DE3 không bổ sung IPTG;<br />
giếng 2-9: Cảm ứng biểu hiện amiE ở E.coli BL21<br />
DE3 bằng IPTG<br />
<br />
1. Hames B. D. (1998), Gel electrophoresis of<br />
protein – practical approach, School of<br />
Biochemistry and Molecular Biology University<br />
of Leed LS2 9JT, UK.<br />
2. Fournand D., Arnaud A. (2001), “Aliphatic<br />
and enantioselective amidases: from hydrolysis<br />
to acyl transfer activity”, J. Appl. Microbiol., 91,<br />
pp. 381–393.<br />
3. Ryabchenko L. E., Podchernyaev D. A.,<br />
Kotlova E. K. and Yanenko A. S. (2006),<br />
“Cloning the Amidase Gene from Rhodococcus<br />
rhodochrous M8 and Its Expression in<br />
Escherichia coli”, Russian Journal of Genetics,<br />
Vol. 42, No. 8, pp. 886–892.<br />
<br />
39<br />
<br />