Bước đầu khảo sát chimerism trên bệnh nhân dị ghép tế bào gốc tạo máu bằng kỹ thuật multiplex PCR STR

Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013<br /> <br /> BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT CHIMERISM TRÊN BỆNH NHÂN DỊ GHÉP <br /> TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR STR <br /> Cao Sỹ Luân*, Phan Thị Xinh*,** <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Mục tiêu: Xác định tỷ lệ chimerism trên bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) dị ghép tế bào <br /> gốc tạo máu (TBGTM). <br /> Đối  tượng  và  phương  pháp:  20  mẫu  tủy  xương  hoặc  máu  ngoại  vi  của  BN  BCCDT  và  người  cho <br /> TBGTM. Thực hiện phản ứng multiplex PCR Short Tandem Reapeat (STR) để xác định các dấu ấn STR có giá <br /> trị theo dõi điều trị sau ghép và tỷ lệ chimerism trên BN BCCDT dị ghép TBGTM. <br /> Kết quả: Trong 18 STRs, chúng tôi đã xác định được 4 dấu ấn STR có giá trị theo dõi điều trị sau ghép trên <br /> cặp người cho‐người nhận là CMR‐04 và 5 dấu ấn STR đối với các cặp CMR‐01 và CMR‐02, 6 dấu ấn STR đối <br /> với cặp CMR‐03. Đồng thời, xác định được tỷ lệ chimerism của các BN sau ghép tại nhiều thời điểm khác nhau. <br /> Ngoài ra, kết quả chimerism tương đồng với kết quả xác định giới tính bằng kỹ thuật FISH trong trường hợp <br /> người cho‐người nhận khác giới tính. <br /> Kết  luận: Xây dựng thành công quy trình xác định chimerism bằng kỹ thuật multiplex PCR STR, giúp <br /> theo dõi việc mọc mảnh ghép trên BN dị ghép TBGTM tại Bệnh viện truyền máu huyết học. <br /> Từ  khóa:  bạch  cầu  cấp  dòng  tủy  (BCCDT),  short  tandem  repeat  (STR),  chimerism,  tế  bào  gốc  tạo  máu <br /> (TBGTM). <br /> <br /> ABSTRACT <br /> DETECTION OF CHIMERISM IN ALLOGENEIC HEMATOPOIETIC STEM CELL <br /> TRANSPLANTATION USING MULTIPLEX STR‐PCR <br /> Cao Sy Luan, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 169 ‐ 174 <br /> Purpose: To detect chimerism in acute myeloid leukemia (AML) patients after allogeneic hematopoietic <br /> stem cell transplantation (HSCT). <br /> Material and Methods: Twenty bone marrow or peripheral blood samples of AML patients and donors <br /> were collected. Using a commercial multiplex PCR amplification of fluorescent labeled short tandem repeat <br /> (STR) markers to detect informative STRs and analyze chimerism after allogeneic HSTC. <br /> Result: Among 18 STRs,  we found 4 informative STRs in CMR‐04, 5 informative STRs in CMR‐01 <br /> and CMR‐02, 6 informative STRs in CMR‐03. Simultaneously, patient/donor cell chimerism was detected <br /> at  several  times  during  the  post‐transplant  period.  Moreover,  the  result  of  chimerrism  analysis  by  STR‐<br /> PCR‐based is similar to result of FISH‐based in cases sex‐mismatched transplantation. <br /> Conclusion: We successfully established the procedure of chimerism analysis by using multiplex STR‐<br /> PCR  to  help  monitoring  engraftment  in  patient  after  allogeneic  HSTC  in  Blood  Transfusion  and <br /> Hematology hospital.  <br /> Key words: acute myeloid leukemia (AML), short tandem repeat (STR), chimerism, hematopoietic stem <br /> cell transplantation (HSCT). <br />  Bệnh viện Truyền máu‐Huyết học TP.HCM  ** Đại học Y Dược TP.HCM. <br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh  ĐT: 0932728115 <br />  Email: phanthixinh@yahoo.com <br /> <br /> *<br /> <br /> 170<br /> Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  <br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> Trong điều trị các bệnh lý ác tính về máu thì <br /> dị  ghép  tế  bào  gốc  tạo  máu  (TBGTM)  là  một <br /> trong những phương pháp hiệu quả và ưu tiên <br /> được lựa chọn cho bệnh nhân (BN), đặc biệt đối <br /> với  BN  thuộc  nhóm  tiên  lượng  trung  bình  và <br /> xấu  hoặc  BN  tái  phát  sau  điều  trị  hóa  trị  liệu. <br /> Việc xác định tỷ lệ tế bào của người cho trong cơ <br /> thể người nhận hay còn gọi là chimerism để qua <br /> đó đánh giá việc mọc mảnh ghép là thành công <br /> hay thất bại là một trong những bước cần thiết <br /> của  dị  ghép  tủy.  Để  đánh  giá  việc  mọc  mảnh <br /> ghép thì có thể dựa trên cơ sở là sự khác nhau về <br /> giới tính, nhóm máu, HLA hay các dấu ấn phân <br /> tử  như  Short  Tandem  Reapeat  (STR)  và  Single <br /> Nucleotide Polymorphism (SNP). Hiện nay, có 3 <br /> kỹ  thuật  di  truyền  học  phân  tử  để  xác  định <br /> chimerism là kỹ thuật FISH (yêu cầu phải có sự <br /> khác  biệt  về  giới  tính  giữa  người  cho  và  người <br /> nhận),  PCR  khuếch  đại  các  đoạn  STR  và  SNP. <br /> Trong  đó,  kỹ  thuật  PCR  khuếch  đại  các  đoạn <br /> STR để xác định tỷ lệ chimerism được sử dụng <br /> ngày càng phổ biến với ưu điểm là độ nhạy cao, <br /> khả năng ứng dụng rộng và chỉ cần một lượng <br /> mẫu nhỏ để phân tích(8). <br />  STR  là  những  trình  tự  ngắn  DNA  trên <br /> nhiễm sắc thể với chiều dài thường từ 2‐6 bp và <br /> có  tính  lặp  lại.  Có  nhiều  loại  STR  khác  nhau: <br /> dinucleotide,  trinucleotide,  tetranucleotide, <br /> pentanucleotide  và  hexanucleotide.  Có  hơn <br /> 20.000  tetranucleotide  STR  được  xác  định  ở <br /> người(2).  STR  chiếm  khoảng  3%  trong  tổng  bộ <br /> gen người(5). Có nhiều kiểu sắp xếp các STR với <br /> nhau,  hoặc  là  lặp  lại  nhiều  STR  của  cùng  một <br /> kiểu  hoặc  là  lặp  lại  của  nhiều  kiểu  STR  khác <br /> nhau.  Sự  khác  nhau  về  kích  thước  của  các  STR <br /> trên mỗi cá nhân khác nhau là do khác nhau về <br /> số  đơn  vị  lặp  lại.  Do  đó,  các  STR  có  thể  được <br /> xem như là dấu ấn để phân biệt giữa các cá thể <br /> với nhau. Vì vậy, với những ưu điểm là tính đa <br /> hình  cao,  kích  thước  nhỏ  nên  các  STR  thường <br /> được  sử  dụng  để  xác  định  chimerism  bằng  kỹ <br /> thuật  PCR(6).  Có  nhiều  nhóm  nghiên  cứu  sử <br /> dụng multiplex PCR khuếch đại các STR có gắn <br /> <br /> 170<br /> Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013<br /> huỳnh quang để xác định nhanh các STR mang <br /> thông tin, tức là các STR có sự khác nhau về kích <br /> thước  giữa  người  cho  và  người  nhận(9).  Hiện <br /> nay,  PCR  khuếch  đại  các  STR  có  gắn  huỳnh <br /> quang được xem như là tiêu chuẩn vàng để xác <br /> định  chimerism  sau  ghép  và  kết  quả  đánh  giá <br /> việc mọc mảnh ghép rất khả quan(1). <br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> Đối tượng nghiên cứu <br /> 20  mẫu  tủy  xương  hoặc  máu  ngoại  vi  của <br /> BN  bạch  cầu  cấp  dòng  tủy  (BCCDT)  và  người <br /> cho TBGTM tương ứng được thu thập tại Bệnh <br /> viện  Truyền  máu  Huyết  học  (BVTMHH)  TP. <br /> HCM  từ  tháng  5/2013  đến  tháng  7/2013.  Trong <br /> đó,  có  4  mẫu  máu  ngoại  vi  của  4  BN  BCCDT <br /> trước  ghép  và  4  mẫu  máu  của  4  người  cho <br /> TBGTM  tương  ứng,  12  mẫu  tủy  xương  hoặc <br /> máu  ngoại  vi  của  người  bệnh  sau  ghép  tại  các <br /> thời  điểm  khác  nhau.  Các  cặp  ghép  này  được <br /> đặt  tên  mã  nghiên  cứu  là  CMR‐01,  CMR‐02, <br /> CMR‐03 và CMR‐04. <br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu <br /> Thiết kế nghiên cứu <br /> Mô tả loạt ca, triển khai kỹ thuật mới. <br /> Phương pháp tiến hành <br /> Ly trích DNA từ mẫu tủy xương hoặc  máu <br /> ngoại vi bằng GenElute blood genomic DNA kit <br /> (Sigma, Mỹ).  Sản phẩm DNA sau ly trích được <br /> kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy đo <br /> quang phổ ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm. <br /> Thực  hiện  phản  ứng  multiplex  PCR  với  18 <br /> cặp mồi (bảng 1) bằng PowerPlex 18D system kit <br /> (Promega,  Mỹ).  Lượng  DNA  dùng  cho  phản <br /> ứng multiplex PCR là 10ng và chương trình luân <br /> nhiệt gồm 96oC trong 2 phút, 26 chu kỳ của 94oC <br /> trong 10 giây và 60oC trong 1 phút, hoàn thành ở <br /> 60oC  trong  20  phút  trên  máy  GeneAmp  PCR <br /> System 2720 (Applied Biosystems, Mỹ). <br /> Bảng 1: Danh sách 18 kiểu dấu ấn STR của kit <br /> PowerPlex 18D system <br /> Màu<br /> Loại STR huỳnh<br /> quang<br /> <br /> Kích thước<br /> sản phẩm<br /> PCR<br /> <br /> Số kiểu đơn vị<br /> lặp lại<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 <br /> Màu<br /> Loại STR huỳnh<br /> quang<br /> <br /> Kích thước<br /> sản phẩm<br /> PCR<br /> <br /> Số kiểu đơn vị<br /> lặp lại<br /> 5-24.<br /> <br /> Penta E<br /> <br /> FL<br /> <br /> 379-474<br /> <br /> D18S51<br /> <br /> FL<br /> <br /> 286-366<br /> <br /> D21S11<br /> <br /> FL<br /> <br /> 203-259<br /> <br /> 7-10, 10.2, 11-13, 13.2,<br /> 14-27<br /> 24, 24.2, 25, 25.2, 2628, 28.2, 29, 29.2,30,<br /> 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2,<br /> 33, 33.2, 34, 34.2, 35,<br /> 35.2, 36-38<br /> <br /> TH01<br /> <br /> FL<br /> <br /> 152-195<br /> <br /> 3-9, 9.3, 10-11,13.3<br /> <br /> D3S1358<br /> <br /> FL<br /> <br /> 103-147<br /> <br /> 9-20<br /> <br /> FGA<br /> <br /> TMR-ET<br /> <br /> 314-460<br /> <br /> 14-18, 18.2, 19, 19.2,<br /> 20, 20.2, 21, 21.2, 22,<br /> 22.2, 23, 23.2, 24, 24.2,<br /> 25, 25.2, 26-30, 31.2,<br /> 32.2, 33.2, 42.2, 43.2,<br /> 44.2, 45.2, 46.2, 48.2,<br /> 50.2<br /> <br /> TPOX<br /> <br /> TMR-ET<br /> <br /> 265-293<br /> <br /> 6-13<br /> <br /> D8S1179 TMR-ET<br /> <br /> 203-251<br /> <br /> 7-19<br /> <br /> TMR-ET<br /> <br /> 127-183<br /> <br /> 10-24<br /> <br /> Amelogeni<br /> TMR-ET<br /> n<br /> <br /> 109, 115<br /> <br /> X, Y<br /> <br /> vWA<br /> <br /> Penta D<br /> <br /> JOE<br /> <br /> 376-449<br /> <br /> 2.2, 3.2, 5-17<br /> <br /> CSF1PO<br /> <br /> JOE<br /> <br /> 321-357<br /> <br /> 6-15<br /> <br /> D16S539<br /> <br /> JOE<br /> <br /> 264-304<br /> <br /> 5, 8-15<br /> <br /> D7S820<br /> <br /> JOE<br /> <br /> 218-250<br /> <br /> 6-14<br /> <br /> D13S317<br /> <br /> JOE<br /> <br /> 176-208<br /> <br /> 7-15<br /> <br /> D5S818<br /> <br /> JOE<br /> <br /> 122-158<br /> <br /> 7-16<br /> <br /> 223-295<br /> <br /> 10, 12, 14-28<br /> <br /> 163-215<br /> <br /> 5.2, 6.2, 8-12, 12.2, 13,<br /> 13.2, 14, 14.2, 15, 15.2,<br /> 16, 16.2, 17, 17.2, 18,<br /> 18.2<br /> <br /> D2S1138 CXR-ET<br /> D19S443 CXR-ET<br /> <br /> Hỗn hợp dung dịch điện di gồm 10μl Hi‐Di, <br /> 1μl ILS500 và 1μl sản phẩm PCR được biến tính <br /> ở  960C  trong  3  phút  và  sốc  nhiệt  ở  00C  trong  3 <br /> phút trước khi tiến hành điện di mao quản bằng <br /> máy  ABI  3130  Genetic  Analyzer,  với  POP‐4 <br /> polymer  và  capillary  36  cm  (Applied <br /> Biosystems).  Kết  quả  điện  di  được  phân  tích <br /> bằng phần mềm GeneMapper. <br /> Kết  quả  điện  di  mẫu  DNA  của  người  cho <br /> TBGTM và BN trước ghép sẽ được phân tích để <br /> chọn ra các kiểu dấu ấn STR mang thông tin, có <br /> giá trị theo dõi điều trị sau ghép, còn đối với kết <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> quả điện di mẫu DNA của BN  sau  ghép  thì  sử <br /> dụng  diện  tích  vùng  đỉnh  của  các  dấu  ấn  STR <br /> này  để  xác  định  tỷ  lệ  chimerism.  Mỗi  một  dấu <br /> ấn STR mang thông tin sẽ được sử dụng để tính <br /> một tỷ lệ chimerism tương ứng. Tỷ lệ chimerism <br /> của BN sau ghép là trung bình tỷ lệ  chimerism <br /> từng dấu ấn STR. <br /> Các dấu ấn STR được sử dụng để phân tích <br /> chimerism phải thỏa mãn các tiêu chuẩn là phải <br /> có  ít  nhất  một  allele  khác  nhau  về  kích  thước <br /> giữa  người  cho  và  người  nhận,  khoảng  cách <br /> giữa 2 allel tối thiểu là hai đơn vị lặp lại. Đồng <br /> thời, chiều cao các đỉnh của các STR khi điện di <br /> phải  >50  RFU  và  không  vượt  quá  thang  đo <br /> RFU(7). <br /> Tỷ  lệ  chimerism  được  tính  theo  công  thức <br /> sau: <br />  <br /> Trong đó: ‐ ∑D: tổng diện tích vùng đỉnh của <br /> các dấu ấn STR mang thông tin ở người cho <br />  ‐ ∑R: tổng diện tích vùng đỉnh của các dấu <br /> ấn STR mang thông tin ở người nhận  <br /> <br /> KẾT QUẢ <br /> Với lượng mẫu DNA sử dụng cho phản ứng <br /> multiplex PCR là 10ng cho kết quả là chiều cao <br /> các  đỉnh  của  người  cho  và  người  nhận  trước <br /> ghép  cũng  như  của  người  nhận  sau  ghép  đều <br /> trong  tiêu  chuẩn  cho  phép,  thỏa  điều  kiện  là <br /> chiều cao tối thiểu >50 RFU và không vượt quá <br /> thang  đo  RFU.  Đối  với  mẫu  trước  ghép  chúng <br /> tôi xác định được 4 dấu ấn STR mang thông tin <br /> trên  cặp  người  cho‐người  nhận  có  mã  số  là <br /> CMR‐04,  5  dấu  ấn  STR  đối  với  cặp  CMR‐01  và <br /> CMR‐02, 6 dấu ấn STR đối với cặp CMR‐03. <br /> Đối  với  mẫu  sau  ghép,  chúng  tôi  xác  định <br /> được tỷ lệ chimerism trên BN BCCDT sau ghép <br /> ở những thời điểm khác nhau (bảng 2). Trong 4 <br /> cặp  người  cho‐người  nhận  thì  cặp  CMR‐02  và <br /> CMR‐04  là  dị  ghép  TBGTM  nửa  thuận  hợp <br /> HLA,  còn  cặp  CMR‐03  và  CMR‐01  là  dị  ghép <br /> TBGTM thuận hợp HLA hoàn toàn. <br /> <br /> 171<br /> Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> Bảng 2: Kết quả chimerism của BN BCCDT sau <br /> ghép TBGTM <br /> Mã BN CMR-02 CMR-04 CMR-03 CMR-01<br /> (%)<br /> (%)<br /> (%)<br /> (%)<br /> Ngày sau ghép<br /> Ngày 7<br /> 58,45 60,43<br /> Ngày 14<br /> 95,50 100,00<br /> Ngày 21<br /> 100,00 98,10<br /> 99,59<br /> Ngày 28<br /> 98,09<br /> 100,00<br /> Ngày 35<br /> 100,00 100,00<br /> 100,00<br /> <br /> Đối  với  BN  CMR‐02  sau  ghép  7  ngày,  dựa <br /> trên diện tích vùng đỉnh của 5 kiểu dấu ấn STR <br /> mang  thông  tin  chúng  tôi  tính  được  tỷ  lệ <br /> chimerism  của  từng  kiểu  dấu  ấn  STR  và  tỷ  lệ <br /> chimerism trung bình là 58,45% (bảng 3). <br /> <br /> Hệ thống STR<br /> <br /> CSF1PO<br /> <br /> Allele (D)<br /> <br /> Penta E<br /> <br /> Allele<br /> (R)<br /> <br /> Diện<br /> tích<br /> peak<br /> <br /> 5<br /> <br /> 3609<br /> <br /> 11<br /> <br /> 3080<br /> <br /> Diện<br /> tích<br /> peak<br /> <br /> Allele<br /> (R)<br /> <br /> 12<br /> <br /> 3792<br /> <br /> 16<br /> <br /> 3283<br /> <br /> 10<br /> <br /> 8777<br /> <br /> 11<br /> <br /> 11<br /> <br /> 14060<br /> <br /> 12<br /> <br /> 5501<br /> <br /> 12<br /> <br /> TPOX<br /> <br /> 14<br /> <br /> 1816<br /> <br /> 15<br /> <br /> 15<br /> <br /> 3575<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> 12094<br /> <br /> 11<br /> <br /> 4467<br /> <br /> 9<br /> <br /> CMR<br /> (%)<br /> <br /> 61.47<br /> <br /> 55.49<br /> <br /> 6430<br /> <br /> 18<br /> FGA<br /> <br /> CMR<br /> (%)<br /> <br /> 2264<br /> <br /> D8S1179<br /> <br /> Bảng 3: Kết quả chimerism của BN CMR‐02 sau <br /> ghép 7 ngày <br /> Hệ thống STR<br /> <br /> Allele (D)<br /> <br /> 59.01<br /> <br /> 4848<br /> <br /> 22<br /> <br /> 22<br /> <br /> 6901<br /> <br /> 23<br /> <br /> 2626<br /> <br /> 64.86<br /> <br /> Tỷ lệ CMR trung bình (%):<br /> <br /> 58.45<br /> <br /> 51.40<br /> <br /> Người cho<br /> <br /> Da1<br /> <br /> Da1<br /> <br /> Người nhận<br /> <br /> Ra1<br /> <br /> Ra1<br /> <br /> Người nhận sau ghép<br /> <br /> Ra1<br /> <br /> D3S1358<br /> <br /> TH01<br /> <br /> D21S11<br /> <br /> D18S51<br /> <br /> Da1<br /> <br /> Ra1<br /> <br /> Da1<br /> <br /> Penta E<br /> <br /> Hình 1: Kết quả diện di một số dấu ấn STR của người cho, người nhận trước và sau ghép ngày 7 trên BN <br /> CMR‐02 <br /> <br /> 172<br /> Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  <br /> <br />  <br /> <br />