32(1): 63-66 T¹p chÝ Sinh häc 3-2010<br />
<br />
<br />
<br />
B−íc ®Çu sö dông lectin ®Ëu dao biÓn (Canavalia maritima,<br />
Aublet) trong ®Þnh l−îng kh¸ng thÓ IgG tõ huyÕt thanh ng−êi<br />
<br />
TrÇn ThÞ Ph−¬ng Liªn, Tr−¬ng V¨n Ch©u<br />
Tr−êng ®¹i häc S− ph¹m Hµ Néi 2<br />
§ç V¨n Phóc, §ç Ngäc Liªn<br />
Tr−êng ®¹i häc Khoa häc tù Nhiªn, §HQG Hµ Néi<br />
<br />
§Ëu dao biÓn (Canavalia maritima, Aublet) 2. Ph−¬ng ph¸p<br />
cã nguån gèc tõ Brazil, th−êng sèng ë c¸c vïng<br />
Tinh chÕ kh¸ng thÓ IgG tõ huyÕt thanh b»ng<br />
nhiÖt ®íi ven biÓn vµ còng ®−îc liÖt kª vµo c¸c<br />
cét s¾c kÝ ¸i lùc Protein A - Sepharose 4B vµ cét<br />
loµi c©y ®Ëu ¨n h¹t ë c¸c vïng §«ng Nam ¸ ConM - Sepharose 4B tù t¹o [3].<br />
[2, 4]. Cïng víi loµi ®Ëu rùa th−êng mäc ë rõng<br />
nói (Canavalia ensiformis D. C.) vµ ®Ëu g−¬m §¸nh gi¸ møc ®é tinh s¹ch cña IgG ®I tinh<br />
(Canavalia gladiata (Jacq) D. C.) ®I ®−îc t×m chÕ b»ng kü thuËt ®iÖn di trªn gel SDS-PAGE<br />
thÊy ë ViÖt Nam [2], c¸c loµi nµy ®Òu chøa mét theo Laemmli, víi nång ®é 12% [3].<br />
lo¹i protein ®−îc gäi chung lµ lectin cã ho¹t tÝnh Sö dông lectin ConM cã ®é tinh s¹ch cao tõ<br />
ng−ng kÕt hång cÇu lµ ConA (tõ C. ensiformis), h¹t ®Ëu dao biÓn ®I ®−îc tinh chÕ b»ng ph−¬ng<br />
conG (tõ C. gladiata) vµ ConM (tõ C. maritima) ph¸p s¾c kÝ ¸i lùc theo Goldstein vµ céng sù<br />
[5, 6]. TÝnh chÊt ®iÓn h×nh cña lectin lµ cã kh¶ (1986) ®Ó b−íc ®Çu ®Þnh l−îng kh¸ng thÓ IgA<br />
n¨ng liªn kÕt víi c¸c gèc ®−êng ®¬n vµ c¸c gèc trong huyÕt thanh b»ng kü thuËt LECTIN-<br />
®−êng n»m trªn bÒ mÆt tÕ bµo [7]. øng dông ELISA [3].<br />
tÝnh chÊt nµy, nh÷ng n¨m cuèi cña thÕ kû XX, C¸c ho¸ chÊt sö dông cña hIng Sigma (Mü),<br />
c¸c nhµ khoa häc ®I sö dông lectin ®Ó nghiªn Merk (§øc), LKB (Thuþ §iÓn): Protein chuÈn;<br />
cøu sù biÓu hiÖn kh¸ng thÓ vµ kh¸ng nguyªn. V× Sepharose-ProteinA; SephadexG-G75; céng hîp<br />
vËy viÖc sö dông lectin ConM tõ h¹t ®Ëu dao kh¸ng IgG; c¬ chÊt OPD, c¸c ho¸ chÊt nµy ®¹t<br />
biÓn (Canavalia maritima, Aublet) ®Ó ®Þnh møc ®é tinh khiÕt cao.<br />
l−îng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh ng−êi lµ ®iÒu<br />
cÇn thiÕt cã ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn y häc. II. KÕt qu¶ nghiªn cøu<br />
<br />
1. Tinh chÕ IgG tõ huyÕt thanh ng−êi kháe<br />
I. ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu<br />
<br />
1. Nguyªn liÖu<br />
H¹t ®Ëu dao biÓn ®−îc thu h¸i t¹i khu vùc<br />
ch©n nói Ngò Hµnh, Qu¶ng Nam §µ N½ng, do<br />
NguyÔn §¨ng Kh«i ®Þnh lo¹i.<br />
Hång cÇu ®−îc viÖn HuyÕt häc vµ truyÒn<br />
m¸u Trung −¬ng cung cÊp gåm c¸c nhãm m¸u<br />
A, B, O ®−îc röa 3 lÇn víi muèi sinh lý<br />
(NaCl 0,9%).<br />
H×nh 1. §iÖn di SDS-PAGE chÕ phÈm IgG tinh s¹ch<br />
C¸c mÉu huyÕt thanh ng−êi kháe b×nh Ghi chó: Cét 1. C¸c protein chuÈn cña hIng SIGMA;<br />
th−êng ®I ®−îc chuÈn ®o¸n l©m sµng ®−îc Cét 2. IgG tinh s¹ch tinh chÕ b»ng cét ConM-<br />
ViÖn HuyÕt häc vµ TruyÒn m¸u Trung −¬ng Sepharose 4B; Cét 3. IgG tinh s¹ch tinh chÕ b»ng cét<br />
cung cÊp. ConM-Sepharose 4B.<br />
<br />
<br />
63<br />
IgG ®−îc tinh chÕ b»ng cét ConM- KÕt qu¶ nµy ®I chøng tá r»ng lectin ConM<br />
Sepharose 4B tù t¹o vµ cét Protein A - Sepharose liªn kÕt ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ IgG mµ kh«ng<br />
4B. ChÕ phÈm IgG tinh s¹ch ®−îc dïng ®Ó x©y hÒ liªn kÕt víi c¸c thµnh phÇn nµo kh¸c trong<br />
dùng ®å thÞ tiªu chuÈn cho kü thuËt xÐt nghiÖm huyÕt thanh ng−êi.<br />
LECTIN-ELISA khi dïng lectin ConM g¾n b¶n. 2. X©y dùng ®å thÞ chuÈn IgG<br />
KÕt qu¶ chÕ phÈm IgG thu ®−îc hoµn toµn Kh¸ng thÓ IgG tinh s¹ch sau khi tinh chÕ<br />
tinh s¹ch, chØ biÓu hiÖn 2 b¨ng duy nhÊt lµ chuçi ®−îc sö dông ®Ó x©y dùng ®å thÞ chuÈn cho kü<br />
nÆng (53 kDa) vµ chuçi nhÑ (25 kDa) khi kiÓm thuËt xÐt nghiÖm ELISA. KÕt qu¶ thu ®−îc ë<br />
tra b»ng kü thuËt SDS-PAGE (h×nh 1). h×nh 2.<br />
1.2<br />
OD 490nm<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
1<br />
<br />
0.8<br />
<br />
0.6<br />
<br />
0.4<br />
<br />
0.2<br />
<br />
0<br />
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500<br />
Hµm l−îng IgG (ng/ml)<br />
<br />
<br />
H×nh 2. §å thÞ chuÈn IgG<br />
<br />
Qua ®å thÞ chuÈn (h×nh 2) cho thÊy khi mËt HuyÕt thanh ng−êi b×nh th−êng ®−îc pha<br />
®é quang n»m trong kho¶ng tõ 0,196 ®Õn 0,698 loIng 150, 200, 250 lÇn trong ®Öm blocking pH<br />
th× kÕt qu¶ thùc nghiÖm thu ®−îc t−¬ng ®−¬ng 7,6-7,8; ConM ®−îc g¾n b¶n víi c¸c nång ®é 1, 3,<br />
víi kÕt qu¶ lÝ thuyÕt. V× vËy, trong qu¸ tr×nh lµm 5, 8, 10, 15 µg/1 giÕng ®Ó b¾t gi÷ IgG trong kü<br />
thùc nghiÖm cÇn l−u ý ®é pha loIng huyÕt thanh thuËt Lectin-Elisa (h×nh 3).<br />
sao cho kÕt qu¶ ®o mËt ®é quang n»m trong KÕt qu¶ h×nh 3 cho thÊy, ®Ó thÝch hîp cho<br />
kho¶ng tõ 0,196 ®Õn 0,698. viÖc ®Þnh l−îng IgG th× huyÕt thanh ®−îc pha<br />
3. Th¨m dß nång ®é g¾n b¶n cña ConM vµ loIng 200 lÇn vµ nång ®é g¾n b¶n cña ConM lµ<br />
®é pha lo·ng cña huyÕt thanh 5 µg/giÕng.<br />
OD492nm<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
0.9<br />
0.8<br />
0.7<br />
0.6<br />
0.5<br />
0.4<br />
0.3<br />
0.2<br />
0.1<br />
0<br />
1 5 8 10 15<br />
Nång ®é ConM g¾n b¶n (mg/giÕng)<br />
<br />
200 lÇn 250 lÇn 250 lÇn<br />
<br />
H×nh 3. KÕt qu¶ th¨m dß ®é pha loIng cña huyÕt thanh vµ nång ®é g¾n b¶n cña ConM<br />
<br />
<br />
<br />
64<br />
4. B−íc ®Çu sö dông lectin ConM ®Þnh l−îng víi nh÷ng kÕt qu¶ xÐt nghiÖm cña V¨n §×nh<br />
kh¸ng thÓ IgG trong huyÕt thanh ng−êi b×nh Hoa [1] khi hä sö dông bé xÐt nghiÖm sinh<br />
th−êng phÈm cña n−íc ngoµi.<br />
KÕt qu¶ x¸c ®Þnh hµm l−îng kh¸ng thÓ IgG Tµi liÖu tham kh¶o<br />
trung b×nh trong huyÕt thanh ng−êi b×nh th−êng<br />
khi sö dông ph−¬ng ph¸p LECTIN-ELISA lµ 1. V¨n §×nh Hoa, TrÇn ThÞ ChÝnh, 1996:<br />
12,7 mg/ml. KÕt qu¶ nµy hoµn toµn phï hîp víi Hµm l−îng globulin miÔn dÞch IgG, IgA,<br />
nh÷ng th«ng sè cña ng−êi ViÖt Nam khoÎ b×nh IgM, IgE trong huyÕt thanh cña ng−êi ViÖt<br />
th−êng vµ phï hîp víi nh÷ng kÕt qu¶ xÐt Nam cã søc kháe b×nh th−êng, Kû yÕu<br />
nghiÖm cña V¨n §×nh Hoa [1] khi hä sö dông ch−¬ng tr×nh Héi nghÞ vÒ c¸c chØ tiªu Sinh<br />
bé xÐt nghiÖm sinh phÈm cña n−íc ngoµi. §iÒu häc ng−êi ViÖt Nam, Nxb. Y häc Hµ Néi.<br />
®ã ®I chøng minh r»ng chÕ phÈm lectin tõ h¹t 2. NguyÔn §¨ng Kh«i, 1979: Nghiªn cøu vÒ<br />
®Ëu dao biÓn hoµn toµn ®¸p øng ®−îc yªu cÇu c©y thøc ¨n cho gia sóc ë ViÖt Nam, tËp 1,<br />
cho ®iÒu chÕ bé sinh phÈm xÐt nghiÖm kh¸ng Nxb. Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi.<br />
thÓ IgG b»ng kü thuËt LECTIN-ELISA.<br />
3. §ç Ngäc Liªn, 2004: Thùc hµnh Ho¸ sinh<br />
III. KÕt luËn miÔn dÞch, Nxb. §¹i häc Quèc gia, Hµ Néi.<br />
4. Van der Macsen J. G. & Somantmadja S.<br />
1. Lectin ConM ®−îc tinh s¹ch tõ h¹t ®Ëu dao<br />
biÓn (C. maritima Aublet) ®I ®−îc chøng minh lµ (D−¬ng §øc HuyÕn dÞch), 1996: Tµi nguyªn<br />
cã tÝnh ®Æc hiÖu liªn kÕt víi IgG cña ng−êi. thùc vËt §«ng Nam ¸, C¸c c©y ®Ëu ¨n h¹t,<br />
Nxb. Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi.<br />
2. Hµm l−îng lectin ConM ®−îc lùa chän tèi<br />
−u cho g¾n b¶n nhùa microtiter plate trong kü 5. Decastle B. R. and Homer B. B., 1973:<br />
thuËt ConM-ELISA ®Ó x¸c ®Þnh hµm l−îng IgG Acta., 322:141-144.<br />
tõ huyÕt thanh lµ 5 µg/giÕng. 6. Goldstein I. J. and Poretz R. D., 1986:<br />
3. HuyÕt thanh gèc ®−îc pha loIng 200 lÇn Isolation, Physicochemical Characterization<br />
lµ ®iÒu kiÖn thÝch hîp cho xÐt nghiÖm x¸c ®Þnh and Carbohydrate-Binding Specificity of<br />
hµm l−îng IgG tõ huyÕt thanh b»ng kü thuËt Lectins: 185-188. Academic Press, Inc.<br />
ConM-ELISA. 7. Strosberg A. D., Dominique B., Mark L.<br />
4. Hµm l−îng kh¸ng thÓ IgG trung b×nh and Andrew F., 1986: Legume lectins: A<br />
trong huyÕt thanh ng−êi kháe b×nh th−êng khi large family of homologous protein: 251-<br />
®Þnh l−îng b»ng ph−¬ng ph¸p ELISA-ConM lµ 262. The lectin: properties, functions and<br />
12,7 mg/ml. KÕt qu¶ nµy hoµn toµn phï hîp víi applications in biology and medicine,<br />
nh÷ng th«ng sè cña ng−êi ViÖt Nam vµ phï hîp Academic Press, INC.<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
Preliminary Using the lectin from maritima jackbean seeds<br />
(Canavalia maritima Aublet) for analysis of IgG<br />
from human serum by LECTIN-ELISA technique<br />
<br />
Tran Thi Phuong Lien, Truong Van Chau,<br />
do Van Phuc, do Ngoc Lien<br />
<br />
SUMMARY<br />
<br />
In recent investigation, we proved specific interaction between lectin ConM from Canavalia maritima of<br />
Vietnam and IgG from human serum. In order to using the lectin for analysis IgG from human serum, we<br />
carried out the purification of IgG from healthy human serum by Protein A - Sepharose 4B and ConM-<br />
<br />
<br />
65<br />
Sepharose 4B column chromatography followed to prepare the ConM-ELISA biokit for analyzing IgG from<br />
human serum.<br />
Results obtained showed that average concentration of IgG from healthy human serum was determined to<br />
be 12.7 mg/ml. Using suitable concentration of ConM to be 5 µg/well by ConM-ELISA technique with human<br />
serum diluted 200 times.<br />
Ngµy nhËn bµi: 30-11-2007<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
66<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
