Các hợp chất triterpenoit và steroit từ sợi nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) ở Việt Nam

N. N. Tuấn, N. T. Thành, T. Đ. Thắng / Các hợp chất triterpenoit và steroit từ sợi nấm kí sinh côn trùng…<br /> <br /> CÁC HỢP CHẤT TRITERPENOIT VÀ STEROIT TỪ SỢI NẤM<br /> KÍ SINH CÔN TRÙNG (Isaria japonica Yasuda) Ở VIỆT NAM<br /> Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Tân Thành, Trần Đình Thắng<br /> Viện Công nghệ Hóa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Vinh<br /> Ngày nhận bài 06/12/2016, ngày nhận đăng 15/3/2017<br /> Tóm tắt: Từ dịch chiết metanol của sợi nấm kí sinh trên côn trùng (Isaria<br /> japonica Yasuda) đã phân lập được một hợp chất triterpen (3-O-ferulylcycloartenol),<br /> ba hợp chất sterol [(3,5α,22E)-ergosta-6,8,22-trien-3-ol (fungisterol); 4,4-dimethyl5α-ergosta-8,24(28)-dien-3-ol; (17R)-17-methylincisterol]. Cấu trúc các hợp chất này<br /> được xác định bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Chi Cordyceps thuộc họ Clavicipitaceae ngành nấm túi (Ascomycota), bao gồm<br /> khoảng 400 loài đã được miêu tả, là nấm kí sinh trên côn trùng, chủ yếu là trên côn trùng<br /> cũng như một số dạng động vật chân khớp (Arthropoda) khác, vì thế chúng là nấm gây<br /> bệnh cho côn trùng. Một số ít loài cũng kí sinh trên các loại nấm khác. Loài được biết<br /> đến nhiều nhất là Cordyceps sinensis [1, 2, 3]. Isaria japonica Yasuda là loài nấm ký<br /> sinh trên côn trùng được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền điều trị một số căn bệnh ở<br /> Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc [2, 3, 5]. Myriocin được phân lập từ dịch lọc nuôi<br /> cấy của I. japonica cho thấy có tác dụng ức chế độc lập tế bào miễn dịch T, tăng cường<br /> khả năng kháng tế bào hồng cầu cừu lgM hình thành các tế bào mảng bám bằng con<br /> đường uống ở chuột [5,6].<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập từ dịch chiết metanol của sợi<br /> nấm kí sinh trên côn trùng (Isaria japnonica Yasuda) bằng các phương pháp sắc kí, thu<br /> được năm hợp chất bao gồm hai triterpenoit (11, 22-dihydroxyhopan, 3-Oferulylcycloartenol), ba steroit [fungisterol; 4,4-dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3-ol;<br /> (17R)-17-methylincisterol]. Các hợp chất này được xác định cấu trúc bằng các phương<br /> pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).<br /> 2. THỰC NGHIỆM<br /> 2.1. Thiết bị<br /> Sắc ký lớp mỏng (TLC) được tiến hành trên loại tráng sẵn silica gel 60F245<br /> (Merck), hiện hình bằng đèn UV và hơi iot. Sắc ký cột thường (CC) sử dụng pha tĩnh là<br /> silica gel (Kieselgel 60, cỡ hạt 70-230 mesh và 230-400 mesh). Nhiệt độ nóng chảy đo<br /> trên máy Yanaco MP-S3. Độ quay cực được đo trên máy phân cực kế Jasco DIP -370.<br /> Phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS) được ghi trên máy Agilent 1200 LC-MSD<br /> Trap. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR, được đo trên máy Bruker<br /> Avance III-500 NMR.<br /> 2.2. Nguyên liệu<br /> Mẫu nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) được thu thập từ tháng 11<br /> Email: thangtd@vinhuni.edu.vn (T. Đ. Thắng)<br /> <br /> 60<br /> <br /> Trường Đại học Vinh<br /> <br /> Tạp chí khoa học, Tập 46, Số 3A (2017), tr. 60-65<br /> <br /> năm 2013 tại Vườn Quốc gia Pù Mát, được PGS. TS. Trần Ngọc Lân giám định tên khoa<br /> học và lưu giữ tại khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh. Mẫu được xem xét và<br /> đánh giá dưới kính hiển vi điện tử theo phương pháp Lacey và Brooks [7]. Phân lập sử<br /> dụng theo phương pháp của Goettel và Inglis [8]. Phân lập các bào tử đơn dựa theo<br /> phương pháp của Choi và cộng sự [9]. Cấy chuyển sang môi trường Potato Dextrose<br /> Agar (PDA) theo phương pháp của Samson [10]. Đặc điểm hình thái của bào tử, sợi nấm,<br /> cấu trúc quả thể và một số đặc điểm sinh học khác được đánh giá, nhận dạng các loài<br /> nấm ký sinh côn trùng theo phương pháp của Luangsard và cộng sự [11].<br /> 2.3. Phân lập các hợp chất<br /> Sợi nấm I. japonica được phơi khô, nghiền nhỏ và chiết 3 lần bằng dung môi<br /> metanol ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết sau khi cất thu hồi dung môi thu được cao metanol<br /> (25 g). Cao metanol được hòa trong nước, chiết phân bố với dung môi etyl axetat, cất thu<br /> hồi dung môi thu được cao etyl axetat (15 g) và dịch nước (10 g). Cao etyl axetat được<br /> tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan-axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1,<br /> 7:1, 5:1) và hệ dung môi CHCl3-MeOH (10:1, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1), thu được 6 phân đoạn.<br /> Phân đoạn 2 (2,4 g) được tiến hành sắc ký cột slica gel với hệ dung môi n-hexan-axeton<br /> (7:3), thu được hợp chất 4 (9,5 mg). Phân đoạn 4 (1,4 g) được tiến hành sắc ký cột silica<br /> gel với hệ dung môi rửa giải n-hexan-axeton (9:1-2:1), thu được 4 phân đoạn. Phân đoạn<br /> 4.2 tiếp tục được sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan-axeton (7:3), thu được<br /> hợp chất 1 (7 mg). Phân đoạn 4.3 tiếp tục được sắc ký cột silica gel với hệ dung môi nhexan-axeton (4:1), thu được hợp chất 2 (5,7 mg) và hợp chất 3 (8,0 mg).<br /> Hợp chất 1: tinh thể không màu (CHCl3), đ.n.c. 153-154℃; ESI-MS m/z 449<br /> [M+Na-ferulyl]+ (tương ứng với C30H49ONa); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) ( ppm):<br /> 7,59 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-3′), 7,08 (1H, dd, J = 8,1, 1,8 Hz, H-9′), 7,04 (1H, d, J = 1,8<br /> Hz, H-5′), 6,92 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-8′), 6,30 (1H, d, J = 16,1 Hz, H-2′), 5,85 (1H, br s,<br /> OH-7′), 4,71 (1H, d, J = 8,8 Hz, H-3), 5,10 (1H, br t, J = 6,6 Hz, H-24), 3,94 (3H, s,<br /> OCH3-6′), 1,68 (3H, s, CH3-26), 1,61 (3H, s, CH3-27), 0,98 (3H, s, CH3-29), 0,97 (3H, s,<br /> CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-30), 0,90 (3H, s, CH3-28), 0,89 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-21),<br /> 0,60 (1H, d, J = 4,0 Hz, CH2-19), 0,37 (1H, d, J = 4,4 Hz, CH2-19)<br /> Hợp chất 2: chất bột màu vàng (MeOH), đ.n.c. 145-147 ℃; [α]D25 -12,0 (c 0,08,<br /> CHCl3; 1H-NMR (300MHz, CDCl3) ( ppm): 6,12 (1H, dd, J = 9,6, 2,7 Hz, H-6), 5,125,29 (3H, m, H-7, 22, 23), 3,60-3,73 (1H, m, H-3), 1,10-2,56 (20H, m, steroid), 1,02 (3H,<br /> d, J = 6,6 Hz, H-21), 0,99 (3H, s, H-19), 0,93 (3H, s, H-18), 0,85 (3H, d, J = 6,9 Hz, H28), 0,83 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-27), 0,81 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-26).<br /> Hợp chất 3: chất bột màu vàng nhạt (CHCl3), đ.n.c. 163-164 ℃; [α]D25 +99,6 (c<br /> 0,1, CHCl3); ESI-MS m/z 427 [M+H]+ (tương ứng với C30H51O); 1H-NMR (300MHz,<br /> CDCl3) ( ppm): 4,71 (1H, br s, H-28), 4,66 (1H, br s, H-28), 3,24 (1H, dd, J = 11,4, 4,5<br /> Hz, H-3), 2,22 (1H, m, H-25), 1,40 (1H, m, H-20), 1,04 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27), 1,03<br /> (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26), 1,01 (3H, s, H-30), 0,99 (3H, s, H-19), 0,96 (3H, d, J = 6,5 Hz,<br /> H-21), 0,81 (3H, s, H-29), 0,60 (3H, s, H-18).<br /> Hợp chất 4: chất bột màu trắng (CHCl3), đ.n.c.162-163℃; [α]D25 +66,0 (c 0,07,<br /> CHCl3); 1H-NMR (300MHz, CDCl3) ( ppm): 5,73 (1H, s, H-2), 5,23 (1H, dd, J = 15,3,<br /> 8,0 Hz , H-16), 5,15 (1H, dd, J = 15,3, 8,0 Hz , H-15), 3,10 (3H, s, OCH3), 2,40 (1H, m,<br /> <br /> 61<br /> <br /> N. N. Tuấn, N. T. Thành, T. Đ. Thắng / Các hợp chất triterpenoit và steroit từ sợi nấm kí sinh côn trùng…<br /> <br /> H-8), 2,32 (2H, m, H-5), 2,04 (1H, m, H-13), 1,92 (2H, m, H-6), 1,83 (1H, m, H-17), 1,75<br /> (1H, m, H-5), 1,49 (1H, m, H-18), 1,01 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-14), 0,90 (3H, d, J = 6,9<br /> Hz, H-21), 0,82 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-20), 0,80 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-19), 0,59 (3H, s, H12).<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Từ dịch chiết etylaxetat của sợi nấm kí sinh trên côn trùng (Isaria japonica<br /> Yasuda), đã phân lập được 4 hợp chất 1, 2, 3, 4 và xác định cấu trúc các hợp chất này<br /> bằng các phương pháp phổ.<br /> Hợp chất 1 có dạng tinh thể không màu, tan trong CHCl3. Phổ 1H-NMR của 1 cho<br /> thấy đây là hợp chất triterpenoid có dạng khung cycloartan. Các tín hiệu của<br /> cyclopropan methylen tại δH 0,37 (1H, d, J = 4,4 Hz, CH2-19) và 0,60 (1H, d, J = 4,0 Hz,<br /> CH2-19); bốn nhóm methyl liên kết với carbon bậc 4 tại δH 0,98 (3H, s, CH3-29), 0,97<br /> (3H, s, CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-30), 0,90 (3H, s, CH3-28); một nhóm methyl liên kết<br /> với carbon methin tại δH 0,89 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-21); một nhóm methylen tại δH<br /> 5,10 (1H, br t, J = 6,6 Hz, H-24). Một nhóm feruloyl được xác định dựa trên các tín hiệu<br /> proton tại [δH 7,59 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-3′), 7,08 (1H, dd, J = 8,1, 1,8 Hz, H-9′), 7,04<br /> (1H, d, J = 1,8 Hz, H-5′), 6,92 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-8′), 6,30 (1H, d, J = 16,1 Hz, H-2′),<br /> 5,85 (1H, br s, OH-7′), 3,94 (3H, s, OCH3-6′)] liên kết với C-3 được xác định dựa vào<br /> độ chuyển dịch hóa học ở trường thấp của H-3 (δH 4,71) được so sánh với cycloartanol<br /> (δH-3 4,71 (CDCl3)) trong tài liệu [13]. Nhóm feruloyl được xác định định hướng β dựa<br /> trên hằng số ghép cặp proton-proton giữa H-2ax và H-3ax (J = 8,8 Hz). Dựa trên việc phân<br /> tích số liệu phổ NMR, hợp chất 2 được xác định là cycloartanyl ferulat (oryzanol-A)<br /> [12].<br /> Hợp chất 2 là chất bột màu vàng. Phổ 1H-NMR của 2 cho thấy tín hiệu đặc trưng<br /> của một proton của nhóm hydroxymethin trong khoảng 3,60-3,73 (1H, m, H-3), các tín<br /> hiệu của proton olefinic tại 6,12 (1H, dd, J = 9,6, 2,7 Hz, H-6), 5,12-5,29 (3H, m, H-7,<br /> 22, 23), tín hiệu đặc trưng của 20 proton thuộc khung sterol trong khoảng 1,10-2,56<br /> (20H, m, steroid), proton nhóm methyl liên kết với carbon bậc hai tại 1,02 (3H, d, J = 6,6<br /> Hz, H-21). Ngoài ra, phổ 1H-NMR của 3 còn xuất hiện tín hiệu proton của hai nhóm<br /> methyl liên kết với carbon bậc bốn tại 0,99 (3H, s, H-19) và 0,93 (3H, s, H-18); và proton<br /> của ba nhóm methyl liên kết với carbon methin tại 0,85 (3H, d, J = 6,9 Hz, H-28), 0,83<br /> (3H, d, J = 6,0 Hz, H-27), 0,81 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-26). Việc phân tích số liệu phổ<br /> NMR và so sánh với tài liệu [13], hợp chất 3 được xác định là (3,5α,22E)-ergosta6,8,22-trien-3-ol (fungisterol).<br /> Hợp chất 3 là chất bột màu vàng. Phổ 1H-NMR của 3 cho thấy sự hiện diện của 2<br /> nhóm methyl liên kết với carbon bậc bốn ở vùng trường cao tại δH 0,60 và 0,99 tương<br /> ứng với proton của nhóm methyl liên kết C-18 and C-19 trong khung sterol. Vị trí của<br /> liên kết đôi giữa C-24 và C-28 được xác định dựa trên việc phân tích phổ 1H-NMR bởi<br /> sự tách spin tại δH 2,22 (H-25); hai tín hiệu doublet tại δH 1,03 (H-26) và 1,04 (H-27) bị<br /> suy biến thành hai tín hiệu singlet; hai tín hiệu singlet tù tại 4,71 và 4,66 được quy gán<br /> cho các proton olefinic của C-28. Tín hiệu proton tại δH 1,40 (H-20) và tín hiệu doublet<br /> tại δH 0,96 (H-21) đặc trưng tương ứng với các proton của hai carbon C-20 và C-21. Một<br /> điểm đáng chú ý khác trên phổ 1H-NMR là tín hiệu của hai nhóm methyl liên kết với<br /> <br /> 62<br /> <br /> Trường Đại học Vinh<br /> <br /> Tạp chí khoa học, Tập 46, Số 3A (2017), tr. 60-65<br /> <br /> carbon bậc bốn (δH 0,81 và 1,01) và tín hiệu của một proton của nhóm hydroxymethin tại<br /> δH 3,24 (H-3). Dựa trên sự phân tích dữ liệu phổ NMR và so sánh với tài liệu, hợp chất 3<br /> được xác định là 4,4-dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3β-ol [14].<br /> Hợp chất 4 là chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của 4 cho thấy tín hiệu của bốn<br /> nhóm methyl liên kết với carbon methin tại δH 1,01 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-14), 0,90 (3H,<br /> d, J = 6,9 Hz, H-21), 0,82 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-20) và 0,80 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-19);<br /> một nhóm methyl liên kết với carbon bậc bốn tại δH 0,59 (3H, s, H-12); một nhóm<br /> methoxy tại δH 3,10 (3H, s, OCH3) và một proton olefinic proton tại δH 5,73 (1H, s, H-2)<br /> cùng với tín hiệu liên kết đôi dạng trans tại δH 5,23 (1H, dd, J = 15,3, 8,0 Hz , H-16),<br /> 5,15 (1H, dd, J = 15,3, 8,0 Hz, H-15). Từ số liệu phổ NMR và so sánh với tài liệu có thể<br /> kết luận hợp chất 4 là (17R)-17-methylincisterol [15].<br /> <br /> (1)<br /> <br /> (2)<br /> <br /> (3)<br /> <br /> (5)<br /> <br /> 4. KẾT LUẬN<br /> Thành phần hoá học của sợi nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) ở<br /> Vườn quốc gia Pù Mát - Nghệ An được nghiên cứu bằng các phương pháp ngâm chiết<br /> với dung môi chọn lọc, cất thu hồi dung môi đã thu được các cao tương ứng. Từ cao etyl<br /> axetat của sợi nấm ki sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) bằng các phương pháp sắc<br /> kí đã phân lập được một triterpen là (3-O-ferulylcycloartenol), ba sterol ((3,5α,22E)ergosta-6,8,22-trien-3-ol (fungisterol); 4,4-dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3-ol;<br /> (17R)-17-methylincisterol). Các hợp chất này được xác định cấu trúc bằng các phương<br /> pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1] John H., Matt C., Medicinal value of the caterpillar fungi species of the genus<br /> Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes). A Review, Int. J. Med. Mushrooms, 10(3),<br /> 2008, pp. 219-234.<br /> <br /> 63<br /> <br /> N. N. Tuấn, N. T. Thành, T. Đ. Thắng / Các hợp chất triterpenoit và steroit từ sợi nấm kí sinh côn trùng…<br /> <br /> [2] Zhu J. S., Halpern G. M., Jones K., The scientific rediscovery of an ancient Chinese<br /> herbal medicine: Cordyceps sinensis: Part I., J. Altern. Complement Med., 4, 1998,<br /> pp. 289-303.<br /> [3] Zhu J.S., Halpern G.M., Jones K., The scientific rediscovery of a precious ancient<br /> Chinese herbal regimen: Cordyceps sinensis: Part II, J. Altern. Complement Med., 4,<br /> 1998, pp. 429-457.<br /> [4] Takano F., Kikuchi Y., Fushiya S., Hojo N., Nozoe S., Yahagi N., The culture fluid<br /> of Isaria japonica Yasuda augments anti-sheep red blood cell antibody response in<br /> mice, Biol. Pharm. Bull., 19, 1996, pp. 641-643.<br /> [5] Shin K. H., Lim S. S., Lee S., Lee Y. S., Jung S. H., Cho S.Y., Antitumour and<br /> immuno-stimulating activities of the fruiting bodies of Paecilomyces japonica, a new<br /> type of Cordyceps spp., Phytother. Res., 17, 2003, pp. 830-833.<br /> [6] Yahagi N., Komatsu M., Hiramatsu M., Shi H., Yahagi R., Kobayashi H., Radical<br /> scavenging activities of condensed culture medium of Isaria japonica Yasuda and<br /> hot water extract of Fomes fomentarius (L.: Fr) Kicrx, Nat. Med. J., 53, 1999, pp.<br /> 319-323.<br /> [7] Lecay L. A., Brooks W. M., Initinal handling and diagnosis of diseased insets. In:<br /> manuals of techniques in Insect Pathology (Ed. L. Lacey), Academic Press, 1997,<br /> pp. 1-15.<br /> [8] Goettel M. S., Inglis G. D., Fungi: Hyphomycetes, In: manuals of techniques in<br /> insect pathology (Ed. L. Lacey), Academic Press, 1997, pp. 213-247.<br /> [9] Choi Y. W., Hyde K. D., Ho W. W. H., Fugal Diversity 2, 1997, pp. 29-38.<br /> [10] Samson R. A., Evans H. C., Latges J. P., Atlas of entomopathogenic fungi, Springer<br /> - Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1998, 1-187.<br /> [11] Luangsa-Ard J. J., Tasanatai K., Mongkolsamrit S., Hywel N. L., Atlas of<br /> invertebrate pathogenic fungi of Thailand, BIOTEC, NSTDA, Thailand, 2007.<br /> [12] Yosukawa K., Akihisa T., Kimura Y., Tamura T., Takido M., Inhibitory effect of<br /> cycloartenol ferulate, a component of rice bran, on tumor promotion in two-stage<br /> carcinogenesis in mouse skin, Biol. Pharm. Bull., 21(10), 1998, pp. 1072–1076.<br /> [13] González A. G., León F., Rivera A., Muñoz C. M., Bermejo J., Lanostanoid<br /> triterpenes from Ganoderma lucidum, J. Nat. Prod., 62, 1999, pp. 1700–1701.<br /> [14] Fattorusso E., Giovannitti B., Lanzotti V., Magna S., Violante U., 4,4-Dimethyl-5αergosta-8,24(28)-dien-3-ol from the fungus Marasmius oreades, Steroids, 57, 1992,<br /> pp. 119-121.<br /> [15] Ciminiello P., Fattorusso E., Magna S., Mangoni A., Pansinit M., Incisterols, a new<br /> class of highly degraded sterols from the marine sponge Dictyonella incise, J. Am.<br /> Chem. Soc., 112(9), 1990, pp. 3505-3509.<br /> <br /> 64<br /> <br />