Cấy phôi ở bò Bos Indicus

Cấy phôi ở bò Bos Indicus<br /> Nguồn: Enhancing tropical beef cattle genetics, reproduction and animal breeding skills, Queensland, ausralia, 2001 (Trang web, 20/6/2002-Người dịch: Nguyễn Văn Lý)<br /> <br /> 1. Giới thiệu<br /> Cấy phôi ở bò Bos Indicus không giống như bò Bos taurus. Điều này chủ yếu do sự khác biệt về giải phẫu và sinh lý của hệ thống sinh sản giữa 2 loại bò này. Cổ tử cung ở một số bò Bos indicus dài, xoắn và việc này làm cho khó dẫn tinh và thu phôi. Động dục ở loại bò này ngắn hơn, độ mẫn cảm thấp hơn, và ở một số trường hợp, động dục xuất hiện chủ yếu vào ban đêm. Thời gian rụng trứng sớm hơn so với động dục. Những điều này đã làm cho việc thu phôi kém hơn, tỷ lệ thụ tinh kém hơn và các vấn đề khác đi cùng với chương trình cấy phôi ở bò Bos indicus. Trước khi bắt đầu gây rụng trứng nhiều ở một bò cái cho phôi Bos indicus, cần phải bảo đảm chắc chắn rằng cổ tử cung có thể dẫn tinh và rửa thu phôi được. Cổ tử cung bị xoắn thường xuất hiện ở bò già nhiều hơn so với bò còn ít tuổi hay bò hậu bị. Những bò cái cho phôi có cổ tử cung xoắn nhiều có thể rửa thu phôi bằng phẫu thuật. Bình thường bò Bos indicus được coi là giống bò nhút nhát. Tuy nhiên, việc này có thể vượt qua được bằng cách thường xuyên nuôi giữ chúng trong sân chuồng, sử dụng đực thiến có buộc dụng cụ đánh dấu và sử dụng cụ phát hiện động dục ở bò cho phôi.<br /> <br /> 2.Gây động dục đồng pha ở bò cho phôi để gây rụng trứng nhiều<br /> Nếu trong chương trình cấy phôi có nhiều bò cho phôi, thì cần phải gây động dục đồng pha những con bò này. Những bò cho phôi đang ở Ngày 8-14 của chu kỳ động dục có thể nhóm lại với nhau và bắt đầu điều trị gây rụng trứng nhiều. Các phương pháp sau đây thường được sử dụng: Chu kỳ tự nhiên: Phải nhận biết được động dục của tất cả bò cho phôi và lựa chọn những con ở giữa Ngày 8-Ngày 14 của chu kỳ để đưa vào chương trình cấy phôi. Tiêm một liều Prostaglandin: Phải nhận biết được động dục của tất cả bò cho phôi, lựa chọn những con ở ngày 3-4 của của kỳ và tiêm cho tất cả những con còn lại bằng một liều PG để gây đồng pha. Tiêm 2 liều Prostaglandin: Tiêm tất cả bò cho bằng một liều PG ở Ngày 1. 11 ngày sau tiêm PG lần 2. Quan sát động dục trong 4-5 ngày. Bắt đầu gây rụng trứng nhiều 10 ngày sau khi động dục của đa số bò cho phôi. Synchromate-B: Đặt SMB ở Ngày 1, prostaglandin vào sáng Ngày 9 và rút SMB vào chiều cùng ngày. Quan sát động dục trong 3 ngày. Đưa tất cả bò động dục vào chương trình cấy phôi.<br /> <br /> 2. Sờ khám buồng trứng để gây rụng trứng nhiều<br /> <br /> Điều quan trọng là phải sờ khám buồng trứng của bò cho phôi một ngày trước khi bắt đầu điều trị gây rụng trứng nhiều để đảm bảo chắc chắn sự có mặt của thể vàng vì một số gia súc, mặc dầu có biểu hiện tất cả các triệu chứng động dục, nhưng không rụng trứng. Hiện tượng này phổ biến ở bò Bos indicus hơn so với ở bò Bos Taurus. Gây rụng trứng nhiều ở những gia súc kém như thế sẽ dẫn đến không rụng trứng, tỷ lệ thu phôi kém và chất lượng phôi kém.<br /> <br /> 3. Các loại hocmôn dùng để gây rụng trứng nhiều:<br /> Folltropin: Bò già Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 3,0ml sáng/chiều 2,5ml sáng/chiều 2,0ml sáng/chiều 1,5ml sáng/chiều Bò ít tuổi 2,5ml sáng/chiều 2,0ml sáng/chiều 1,5ml sáng/chiều 1,0ml sáng/chièu Bò hậu bị 2,0 hay 1,8ml sáng/chiều 1,5 hay 1,3ml sáng/chiều 1,0 hay 0,8 ml sáng/chiều 0,5 hay 0,3ml sáng/chiều<br /> <br /> Prostaglandin được tiêm vào Ngày 3 hay Ngày 4 vào buổi sáng và buổi chiều. Bò cho phôi được phối giống 12, 24 và 36 giờ sau khi động dục. Thu phôi 6-7 ngày sau khi động dục.<br /> <br /> 4. Đông lạnh và giải đông phôi<br /> 10% Glycerol (1,4M) và Ethylene Glycol (E.G) đều được dùng làm chất bảo vệ lạnh. Cả hai loại chất bảo vệ lạnh này đều được đóng trong lọ thuỷ tinh có nút cao xu trong EMCARE (môi trường không đệm phosphate) hay môi trường nuôi cấy trứng (OCM-môi trường đệm phosphate). Cả hai loại đều được bổ xung 0,4% BSA và kháng sinh (Kanamycin). (Nghiên cứu gần đây ở RuaKura, New Zealand đã chứng minh rằng EMCARE, một hệ thống đệm ZWITTERION tốt hơn so với Các hệ thống đệm PHOSPHATE đối với môi trường nuôi giữ phôi trong thời gian vừa phải, và vì thế nhiều loại môi trường EMCARE được khuyến cáo).<br /> <br /> 5. Đông lạnh và giải đông trong Glycerol<br /> (i) Đông lạnh trong Glycerol<br /> Tổng thời gian phôi cần phải ở trong 10% Glycerol trước khi đưa vào đông lạnh ở -5,5-6,50C là 15-30 phút ở nhiệt độ 20-250C. (Độc tính có liên quan đến nhiệt độ, do đó nhiệt độ càng cao thì thời gian cân bằng càng ít hơn. Một điều nữa là cân bằng không nên thực hiện ở nhiệt độ dưới 200C). Hãy cài đặt máy đông lạnh, và cọng rạ được dán nhãn trước khi hút phôi từ môi trường giữ phôi vào môi trường đông lạnh. Đưa phôi vào 10% glycerol, và bắt đầu đặt đồng hồ (hay chú ý đến thời gian). Đưa phôi vào cọng rạ như đã mô tả ở trên. Sau một thời gian tối thiểu 15 phút và tối đa 20-30 phút<br /> <br /> (phụ thuộc vào nhiệt độ), đặt cọng rạ vào máy đông lạnh ở –5,50-6,50C. Tạo đá sau 1 phút (thời gian không quan trọng, nhưng thời gian cần thiết phải đủ để đủ lạnh để tạo đá). Tạo đá phía trên cột có phôi bởi vì đá không tạo bóng khí. Một số cọng rạ có thể tự tạo đá trong một số máy đông lạnh nhưng đừng tin tưởng vào điều này- thường xuyên phải kiểm tra bằng tay nếu nghi ngờ. Rất dễ nhìn thấy sự hình thành đá (môi trường biến thành màu trắng) nếu có đủ ánh sáng-hãy sử dụng ngọn nến nếu thấy cần thiết. Giữ trong 10 phút. Khi sử dụng glycerol làm chất bảo vệ lạnh, tốc độ làm lạnh từ -0,30C/phút 0,50C/phút đến -340C và -350C sẽ cho kết quả tương tự. Tốc độ làm lạnh -0,50C/phút đến -300C cho kết quả tốt trong glycerol. Nhúng vào ni tơ lỏng ở nhiệt độ -300C đến -350C. Đưa phôi vào cọng rạ để đông lạnh và cấy chuyển gián tiếp (ví dụ trong Glycerol) Ghi nhà sản xuất Nút Không FM (7cm) FM (0.5cm)<br /> chận khí<br /> <br /> Cột môi trường đông lạnh nhỏ (FM) 0.5-1 cm Phôi Không khí<br /> <br /> Nếu sử dụng PVC để gắn thì phải có một lượng nhỏ dung dịch ở đây để làm ướt PVC<br /> <br /> Nếu gắn bằng nhiệt thì để trống chỗ này để gắn<br /> <br /> Phải đưa phôi vào cọng rạ làm sao cho phôi ở vị trí ít nhất là 1/3 cọng rạ kể từ phí dưới (khi cọng rạ được để đứng trong máy đông lạnh), do đó phôi không chìm xuống phía dưới và không bị đông lạnh ở trong phần bóng khí. Phôi phải ở phần giữa cột môi trường do đó không được tạo đá trực tiếp lên phôi. Có thể nhìn thấy phôi trong cọng rạ bằng mắt thường nếu góc chiếu sáng phí sau cọng rạ đúng vị trí. Điều này đã tiết kiệm thời gian khi xem xét vị trí của phôi có đúng không, và vị trí của phôi rất quan trọng để cho những kết quả thống nhất. Nếu phôi không ở đúng vị trí, hãy giữ cọng rạ thẳng đứng (hay lộn ngược xuống) và điều đó cho phép phôi rơi xuống đúng vị trí.<br /> <br /> (ii) Giải đông phôi đông lạnh trong glycerol Giải đông cũng phải được thực hiện ở nhiệt độ 20-300C. Tuy nhhiên, khi không thể thì hãy nhớ rằng pha loãng chất bảo vệ lạnh chậm hơn ở nhiệt độ thấp hơn, và pha loãng nhanh hơn ở nhiệt độ cao hơn. Đĩa giải đông (môi trường đặc biệt) Đĩa rửa (Môi trưòng giữ phôi)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> Đĩa giải đông Lỗ A 5% glycerol, 0,5M Sucrose* 6 phút 30 giây (ở nhhiệt độ 20-250C) Lỗ B 0% glycerol, 0,5M Sucrose** 6 phút 30 giây (ở nhhiệt độ 20-250C) *Trộn một nửa và một nửa (Ví dụ 2ml và 2ml) 1M Sucrose và 10% Glycerol. ** Trộn một nửa và một nửa (Ví dụ 2ml và 2ml) 1M Sucrose và môi trường giữ phôi. Khi trộn lẫn hãy bảo đảm để sử dụng phôi bằng syringe an toàn, và trộn kỹ.<br /> Giải đông<br /> <br /> Lấy ra khỏi ni tơ lỏng, giữ 10 giây và sau đó 300C trong 15-20 giây. Hãy cẩn thận lau sạch nước khỏi cọng rạ. Khi giải đông, nếu cọng rạ được gắn bằng bột PVC, hãy bảo đảm rằng không có bột, hay dung dịch bị tiếp xúc với bột, được tiếp xúc với phôi. Bột PVC rất độc đối với phôi. Hẫy đẩy dung dịch trong cọng rạ vào một đĩa sạch 35mm, hẫy định vị phôi và đặt vào lỗ A 6 phút, 30 giây, sau đó trong lỗ B 6 phút, 30 giây (ở nhiệt độ 20-25C) sau đó đưa vào đĩa rửa.<br /> <br /> Đĩa rửa<br /> Khoảng 2ml môi trường giữ phôi trong mỗi lỗ.<br /> <br /> Rửa khoảng 15 giây trong mỗi lỗ, sau đó giữ trong lỗ 4 và đưa vào cọng rạ. Thay thế cọng rạ và dung dịch rửa sau khi mỗi đĩa đã sử lý khoảng 8 phôi.<br /> <br /> Đưa phôi vào cọng rạ để cấy sau khi giải đông<br /> Rửa mỗi cọng rạ 2 lần với môi trường giữ phôi và kiểm tra đầu cuối của cọng rạ (vì phôi có thể bị mắc kẹt ở đó).<br /> Không khí Phôi Không khí<br /> <br /> Nhà sản xuất Nút chận<br /> <br /> Cắt 2-4mm nếu cần thiết<br /> <br /> ~5cm<br /> <br /> ~3cm<br /> <br /> ~2cm<br /> <br /> Hút khoảng 5cm môi trường, sau đó khoảng 3-4mm bóng khí, sau đó phôi ở trong cột khoảng 3cm, 3-4mm bóng khí khác, và sau đó hút đầy môi trường vào cọng rạ. Cắt khoảng 3-4mm phần cuối của cọng rạ nếu thấy cần (một số súng đòi hỏi cọng rạ ngắn hơn). Hãy kiểm tra vị trí của phôi trong cọng rạ, và đưa vào súng cấy phôi có cả vỏ súng cấy phôi và vỏ nilon để giữ vệ sinh. Hãy giữa nằm ngang (do đó phôi không bị rơi vào bóng khí) trong găng tay dẫn tinh sạch và tránh ánh sáng chiếu trực tiếp vào phôi.<br /> <br /> 1. Đông lạnh và giải đông trong Ethylene Glycol (E.G.)<br /> (i) Đông lạnh trong Ethylene Glycol Ethylene Glycol (E.G.) có phân tử nhỏ hơn glycerol, do đó nó di chuyển vào trong tế bào phôi nhanh hơn. Vì điều này mà nó được coi là độc hơn. Chỉ nên giữ phôi trong E.G tối đa là 10 phút trước khi đưa vào máy đông lạnh ở nhiệt độ -5,5 đến -6,50C. Giữ 5-10 phút sau khi tạo đá sau đó đông lạnh với tốc độ -0,50C-0,60C/phút đến 30 C đến -320C sau đó nhúng vào ni tơ lỏng.<br /> 0<br /> <br /> (Hãy nhớ rằng một khi phôi đã được đặt vào máy đông lạnh ở khoảng -6,00C và đã tạo đá, độc tính củat chất bảo vệ lạnh bị giảm xuống rất nhiều, do đó hãy sử dụng<br /> <br />