CHẨN ĐOÁN PHÂN LOẠI KÝ SINH TRÙNG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ

Chia sẻ: Nguyen Linh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:19

Thêm vào BST

Báo xấu

213
lượt xem 45
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ký sinh trùng (KST) được coi là có vị trí quan trọng thứ hai sau vi sinh vật trong mối quan hệ lây nhiễm và phát sinh bệnh tật giữa con người và động vật với hệ sinh thái và môi trường. Hàng năm, tỷ lệ gây nhiễm, gây bệnh và gây chết của bệnh do ký sinh trùng gây ra là rất cao buộc các nhà khoa học thực sự phải xem xét lại và tìm phương pháp mới trong việc giám định, chẩn đoán nhằm tìm ra phương pháp tối ưu trong việc nghiên cứu quy luật...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CHẨN ĐOÁN PHÂN LOẠI KÝ SINH TRÙNG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ

CHẨN ĐOÁN PHÂN LOẠI KÝ SINH TRÙNG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ KÝ SINH TRÙNG VÀ VẤN ĐỀ PHÂN LOẠI Ký sinh trùng (KST) được coi là có vị trí quan trọng thứ hai sau vi sinh vật trong mối quan hệ lây nhiễm và phát sinh bệnh tật giữa con người và động vật với hệ sinh thái và môi trường. Hàng năm, tỷ lệ gây nhiễm, gây bệnh và gây chết của bệnh do ký sinh trùng gây ra là rất cao buộc các nhà khoa học thực sự phải xem xét lại và tìm phương pháp mới trong việc giám định, chẩn đoán nhằm tìm ra phương pháp tối ưu trong việc nghiên cứu quy luật dịch tễ, điều trị và nguyên lý lập phả hệ quần thể sinh học xác định nguồn gốc lây nhiễm của ký sinh tr ùng(10). Hiện nay, ký sinh trùng được coi là tập hợp đa dạng nhất, nên việc phân loại về nhóm, loài, chủng trước đây đã có phần thiếu chính xác, đặc biệt đối với một số loài anh em (sibling species). Do vậy, nhiều khi hình thái học ký sinh trùng dễ gây nên phức tạp dẫn đến nhầm lẫn trong công tác chẩn đoán, điều trị, cũng như việc phân loại tiến hoá c ủa loài và họ KST. Phân loại và giám định bằng các phương pháp truyền thống như dựa vào hình thái học, vào sự phân bố địa lý hay theo đặc tính dịch tễ học và vòng đời, nhiều khi đã gộp nhầm những cá thể hoặc
quần thể ký sinh trùng mà thực chất chúng có những đặc tính di truyền học hoàn toàn khác biệt nhau. Những thành quả gần đây trong nghiên cứu KST, nhờ sử dụng các phương pháp nghiên cứu di truyền học hiện đại, nhờ sự tiến bộ của các phương pháp kỹ thuật gen và công nghệ ADN đã cho phép và bắt buộc chúng ta phải nhìn nhận lại mối quan hệ phân loại ký sinh trùng theo các phương pháp truyền thống, trước hết là phương pháp hình thái học(3,6,10). Việt Nam là một nước nhiệt đới với mức sống và trình độ dân trí về vệ sinh môi trường chưa cao, nên hàng năm bệnh do KST gây ra vẫn là một gánh nặng đối với ngành y tế và thú y của nước ta. Nghiên cứu về ký sinh trùng học (kể cả nhân y và thú y) ở nước ta đã góp phần không nhỏ vào thành quả chung của nhân loại. Tuy vậy, trong điều kiện Việt Nam hiện nay, việc nghiên cứu ký sinh trùng hầu hết là dựa vào các phương pháp truyền thống là chính mà chưa có điều kiện làm quen và phát triển một số phương pháp hiện đại, trong đó có việc tìm hiểu và ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử. NHỮNG ĐƠN VỊ PHÂN LOẠI CHÍNH VÀ PHỤ Là đơn vị cơ bản được sử dụng trong phân loại, thể hiện các đặc tính sinh học tự nhiên và sự tiến hoá của nhiều cá thể có quan hệ chung về mặt di truyền. Loài là khái niệm chung thể hiện theo các tiêu chuẩn về quan hệ sinh học lây nhiễm và sinh sản hữu tính. Những cá thể có phương pháp sinh sản vô tính hay tự sản (ví dụ: vi sinh vật) không thể liệt kê theo cách phân loại loài như vậy. Từ đó
nảy sinh sự nhầm tưởng và cần có hai khái niệm về loài: loài sinh học và loài di truyền học(12),(15). Loài sinh học nhiều lúc không đại diện đầy đủ cho loài di truyền học, loài di truyền học có thể coi là loài có quan hệ ruột thịt (sibling species) với loài sinh học, mặc dù các cá thể trong loài như thế này có thể có một số đặc tính thích ứng vật chủ và vòng đời có khác nhau. Dưới loài (subspecies) Là khái niệm cũng được sử dụng trong hệ thống phân loại sinh vật và ký sinh trùng, mặc dù thực chất không có tiêu chuẩn thật rõ ràng để đánh giá, chủ yếu là dựa vào đặc tính phân bố theo vùng địa lý của đối tượng, và mối cách biệt loài - dưới loài nhiều khi còn mang tính qui ước. Do vậy, nhiều khi quan hệ di truyền học trong các cá thể dưới loài rất khập khễnh và xa vời về quy luật tiến hóa. Tuy nhiên, nếu xét về tiêu chuẩn sinh học phân tử, loài và dưới loài cũng có những biểu hiện sai khác (divergence) khác nhau. Chủng (strain) Là đơn vị thấp nhất trong loài đại diện cho sự biến thái di truyền học (genetic variation) và mang tính cấp bậc phân loại của chính loài đó. Tuy nhiên, hiện nay khái niệm về chủng và sự sử dụng đơn vị “chủng” trong thực tế còn thiếu chính xác, lạm dụng, nhiều khi chỉ thích hợp với tiêu chuẩn này mà không thích hợp với điều kiện đánh giá khác. Thông thường, chủng là tập hợp của các cá thể phát hiện trong một vùng địa lý, có chung đặc tính di truyền học và thích ứng vật
chủ như nhau đã được xác định. Thực chất, loài và chủng là những đơn vị phân loại được sử dụng một cách phổ biến, còn khái niệm dưới loài có tính chất trung gian và có giá trị ước định trong phân loại. Mẫu (isolate) Không phải là đơn vị phân loại sinh học hay di truyền học, không có cấp bậc trong tiến hoá, đơn giản chỉ là một/nhiều cá thể sinh học có chung hình thái học và bước đầu được xác định quan hệ giống nhau. Một khi, các đặc tính hình thái học và gen học của chúng được xác định chính xác, thì lúc này mẫu (isolate) mới được coi và trở thành chủng (strain) đại diện cho loài đang nghiên cứu. Biến chủng (variants) Quy luật sinh học chính là sự bảo tồn (conservation) và biến đổi (variation), góp phần vào tiến hoá qua thời gian của sinh vật. Sự thay đổi đa dạng trong cùng một loài, hay còn gọi là biến đổi sinh học (biological variation), tạo ra các biến chủng, mà các biến chủng (variants) nhiều khi chưa hẳn đại diện cho sự biến đổi di truyền học (genetic variation hay genetic polymorphism). Các biến chủng xuất hiện nhất thời, tồn tại ngắn, do vậy không phù hợp với nguyên lý tiến hoá của loài, thậm chí nhiều khi còn thiếu nhiều đặc tính sinh - di truyền học để có thể kết luận chúng thuộc loài này hay loài khác. Mối quan hệ chủng - loài
Loài, dưới loài và chủng, như đã nói, được coi là các khái niệm đại diện cho quần thể, và là mốc đánh giá sự tiến hoá của quần thể. Do vậy các đơn vị phân loại này có ảnh hưởng rất lớn đến hệ thống phân loại quần thể sinh học (population systematics) do tính ph ức tạp của biến động di truyền, do sự chưa chuẩn xác của phân nhóm đơn vị phân loại và do tiến hoá của loài, dưới loài và chủng luôn xảy ra, nên hiện nay đánh giá hệ thống phân loại quần thể sinh học và lập phả hệ của loài gặp rất nhiều khó khăn. Cũng t ương tự, sự phức tạp và thiếu chính xác đó đã có ảnh hưởng không nhỏ đối với viêc chẩn đoán, điều trị lâm sàng và chương trình phòng chống bệnh tật nói chung và KST nói riêng. GIỚI THIỆU NHƯNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG TRONG GIÁM ĐỊNH VÀ PHÂN LOẠI LOÀI Phương pháp hình thái học Hình thái học (morphology) vẫn là phương pháp được sử dụng rộng rãi và có tính thực tế nhất trong giám định và phân loại ký sinh trùng. Hình thái bên ngoài của một ký sinh trùng hay các dạng phát triển trung gian của chúng là sự nhận biết nhanh nhất, dễ dàng nhất và thuận tiện nhất để có thể có kết luận sớm về loại ký sinh trùng cần được chẩn đoán hay đang nghiên cứu. Tuy vậy bằng phương pháp hình thái học các cá thể có quan hệ ruột thịt rất khó phát hiện, có thể chúng cùng một đặc tính di truyền nhưng có phương thức hoạt động sinh học khác biệt. Nhiều khi việc phân loại theo hình thái học đó đã không có ý nghĩa thực tiễn trong chẩn đoán và điều trị, cũng như tiến trình phân tích
dịch tễ học của ký sinh trùng gây bệnh, vì có nhiều cá thể giống về hình thái, nhưng biểu hiện tính tiến triển bệnh, vòng đời, tính kháng thuốc, di truyền, sinh sản hoàn toàn khác nhau. Thực tế mà nói, hình thái học vẫn là phương pháp dễ làm, nhanh chóng và trong thực tiễn được sự dụng đi trước một bước làm chìa khoá phân loại đối với quần thể ký sinh trùng có tính chất đơn dạng sinh học. Đối với nhiều loài có nhiều biến chủng và có tính đa dạng sinh học cao, phương pháp này chưa thể nhận hết những thông số nghiên cứu cần thiết, do vậy không cho phép chúng ta đơn phương sử dụng phương pháp hình thái học để giám định và phân loại, đặc biệt đối với một số nhóm, loài ký sinh trùng có hệ số biến chủng cao. Trong những trường hợp đó, cần áp dụng phương pháp sinh học phân tử để làm sáng tỏ và chuẩn xác hình thái học(1,10,13). Các phương pháp dựa trên sản phẩm protein của ký sinh trùng Có thể phân làm hai nhóm protein: protein cấu trúc và protein hoạt tính sinh học. Mỗi một loại sinh vật đều có nhiều loại protein hoạt tính, trong đó có các sản phẩm độc, các enzym phân giải và nhiều protein cấu trúc có tính đặc hiệu theo từng cá thể riêng. Phương pháp sử dụng nhiều nhất vẫn là phương pháp điện di protein (electrophoresis). Bất kỳ một protein n ào cũng cho thông số điện di có tính chất đặc trưng cho từng cá thể. Loại protein được sử dụng điện di thông thường là các enzym có hoạt tính sinh học cao của ký sinh trùng.
Có hai phương pháp chính trong giám định và phân loại: điện di enzym đồng phân (isoenzyme analysis) và điện di enzym dị phân (alloenzyme analysis). Hai phương pháp cổ truyền này được ứng dụng thành công trong nghiên cứu ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium), tiên mao trùng (Trypanosoma) và nhiều loại sán lá đường ruột(3,10,11). Tuy cùng chung nguyên lý là phát hiện protein cùng chức năng, nhưng kết quả phân tích điện di enzym đồng phân phát hiện protein cũ của cá thể để củng cố tính đồng nhất có tính chất giám định. Còn phân tích điện di enzym dị phân cho phép phát hiện protein mới cùng chức năng, từ đó tìm hiểu tính khác biệt của cá thể có tính chất phân loại. Phân tích trật tự amino acid của một sản phẩm protein của ký sinh trùng cũng được sử dụng từ những năm 1980 để giám định và phân loại. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi protein tinh sạch, trang thiết bị đắt tiền rất tốn kém và mất nhiều công sức. Hơn nữa, các phương pháp sinh học phân tử một khi xác lập trật tự nucleotide của gen nghiên cứu thì rất dễ dàng cho biết cấu trúc amino acid của gen tạo sản phẩm đó. Các phương pháp truyền thống khác trong giám định và phân loại Dựa vào đặc tính dịch tễ học và vòng đời Đó là các đặc tính về sự khác biệt thích ứng vật chủ, tính hướng định cơ quan, đặc tính phát triển vòng đời sinh học, quá trình và độ dài lây nhiễm, tiến triển và tiên lượng bệnh, hầu hết các đặc tính này là sự thể hiện cơ bản của đặc
tính di truyền, tuy vậy, ít nhất chúng cũng tồn tại theo phương thức ký sinh riêng của cá thể, mà chúng ta có thể, đối chiếu ghi nhận loại ký sinh trùng này đối với các loại ký sinh trùng khác(7),(14). Các đặc tính dịch tễ học và vòng đời ký sinh này còn được sử dụng nhằm phân biệt hai loại ký sinh trùng có quan hệ ruột thịt (ví dụ: giun đũa ký sinh ở lợn Ascaris suum và giun đũa ký sinh ở người Ascaris lumbricoides), mà dựa vào đặc tính hình thái đã không phân biệt được(3). Dựa vào đặc tính phân bố theo vùng, địa lý và phân bố vật chủ Mặc dù không phải thiết yếu, nhưng sự tương đồng và khác biệt về điều kiện địa lý và vật chủ cũng góp phần chính xác hóa các loài và chủng có quan hệ gần nhau. Giun đũa người (Ascaris lumbricoides) và lợn (A. suum) đã được phân biệt thông qua phương pháp phân bố vật chủ, và chứng tỏ chúng có quan hệ họ hàng ruột thịt. Sán dây ký sinh trên người trước đây được cho là một dưới loài của sán dây bò (Taenia saginata) với tên gọi kép T. saginata asiatica, nhưng hiện nay, dựa vào tính ký sinh vật chủ và đặc biệt dựa vào phân tích sinh học phân tử, sán dây người đã được chính thức công nhận là một loài riêng biệt có tên gọi Taenia asiatica(12). Dựa vào đặc tính lai chéo và sinh lý, sinh hoá Lai chéo (cross-breeding) ở các cá thể nhiều khi, cho những kết luận giá trị về giám định và phân loại. Đối với ký sinh trùng, do tính phức tạp của vòng đời và vật chủ trung gian, thực nghiệm lai chéo nhiều khi khó có thể thực hiện. Tuy vậy
một số loại ký sinh trùng đường máu (Schistosoma spp), tiêm mao trùng (Trypanosoma spp), ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium spp), được phân loại qua một số thực nghiệm lai chéo. Các đặc tính lý hoá của ký sinh tr ùng biểu hiện trong các điều kiện nuôi, sự thích ứng môi trường và vật chủ, trao đổi chất, hoạt động của enzym trong quá trình sinh trưởng và phát triển, tính kháng và nhạy cảm thuốc và hoá chất, hoá dược... cũng được khảo sát và đánh giá phân biệt nhiều loại ký sinh trùng trong chẩn đoán, điều trị. Các đặc tính này không được xem xét để đánh giá tiến hoá và phân loại(2). Dựa vào các phương pháp huyết thanh học Sự phát triển vượt bậc của khoa học về miễn dịch học, cho phép chúng ta ứng dụng những phương pháp cực nhạy và chính xác trong chẩn đoán và giám định. Sử dụng kháng nguyên sơ chế và tinh chế, cũng như các loại kháng thể đa và đơn dòng của ký sinh trùng, chúng ta có được các phương pháp tin cậy và nhanh trong việc giám định chủng và loài, ví dụ các phương pháp hấp phụ đánh dấu enzym (ELISA), phương pháp miễn dịch học phóng xạ (RIA), phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IF). Điều đáng chú ý là phương pháp huyết thanh học ký sinh trùng dễ cho kết quả chéo (cross-reaction), hơn nữa, cá thể có thể bị đa nhiễm KST, nên nhiều khi khó chẩn đoán chính xác vật chủ đang mang loại KST nào. Đối với nghiên cứu tiến hoá và lập phả hệ của loài, phương pháp huyết thanh học không được coi là có ý nghĩa thực tiễn, ngược lại, phương pháp này cùng với
phương pháp hình thái học là các phương pháp rất có giá trị trong chẩn đoán và điều trị. Dựa vào đặc tính nhuộm màu cá thể và tế bào Khi ép nhuộm bằng các loại thuốc nhuộm có thể phân biệt dễ dàng hình dạng KST, thậm chí còn quan sát được sắp xếp và cấu trúc các cơ quan bên trong, đặc biệt quan sát được sự phân thuỳ và hệ sinh sản của KST tạo cơ sở chẩn đoán phân loại. Phương pháp nhuộm tế bào trước hết là sự phân lập và so sánh nhiễm sắc thể (NST) của tế bào, rồi từ đó tìm kiếm các phân đoạn ADN (các locus) trong NST chứa các gen hay các đoạn ADN có giá trị trong giám định và phân loại. Số lượng cặp, hình thái, tính bắt màu đặc trưng của NST... thông thường cho giá trị tổng quát để bước đầu định hướng giám định và phân loại các cá thể trong và ngoài loài(13). Phương pháp nhuộm tế bào mang tính trung gian giữa phương pháp truyền thống và sinh học tế bào tìm cấu trúc phân tử. Hiện nay ở Việt nam nghiên cứu giám định và phân loại KST vẫn dựa vào phương pháp hình thái học là chính mà chưa có điều kiện ứng dụng rộng rãi các phương pháp SHPT. Tuy nhiên, do yêu c ầu nghiên cứu, ngành sinh học Việt nam nói chung và KST học nói riêng cũng cần nhanh chóng tìm hiểu và áp dụng các loại phương pháp mới để có những kết quả nghiên cứu hoàn thiện hơn. NHỮNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DỰA TRÊN CẤU TRÚC ADN CỦA HỆ GEN
Phương pháp di truyền học tế bào Các phân đoạn ADN trong mỗi một nhánh nhiễm sắc thể (NST) có tro ng hệ gen được chọn nghiên cứu thông thường là những vùng chứa các gen đặc hiệu, hay những vùng có cấu trúc đặc biệt, hoặc là các vùng bất ổn định có nhiều chuỗi ADN lặp ngắn (micro and minisatellite) hoặc lặp dài (macro-satellite). Các chuỗi lặp (gọi là các satellite) là điểm yếu của hệ gen, mang dấu hiệu di truyền đặc tr ưng (specific genetic markers) cho từng cá thể, rất có giá trị trong nghiên cứu tiến hoá và phân loại. Đối với KST, nghiên cứu các cấu trúc lặp và những vùng gen đặc hiệu thông thường có giá trị hơn sử dụng hình thái và đặc tính NST, vì ở KST, NST của hệ gen bất ổn định qua các giai đoạn sinh trưởng, phát triển, và vòng đời qua vật chủ trung gian. Như vậy, phương pháp di truyền học tế bào trước hết là sự phân lập và so sánh NST của tế bào, rồi từ đó tìm kiếm các phân đoạn ADN (các locus) trong NST chứa các gen hay các đoạn ADN có giá trị trong giám định và phân loại. Số lượng cặp, hình thái, tính bắt màu đặc trưng của NST... thông thường cho giá trị tổng quát để bước đầu định hướng giám định và phân loại các cá thể trong và ngoài loài(2,4,5). Phương pháp hợp lai ADN -ADN
Phương pháp hợp lai ADN -ADN (DNA-DNA hybridization) là kỹ thuật hợp nhất một đoạn dài ngắn khác nhau, thậm chí cả một vùng ADN có đồng nhất về cấu trúc của hai cá thể khác nhau. ADN sử dụng phải là 1 sợi (sợi âm hoặc sợi dương) có cấu trúc đã biết, để dò tìm ADN mới bằng cách hợp nhất theo cơ chế bổ sung với sợi tương ứng trong hệ gen của cá thể làm đối tượng đang nghiên cứu. Như vậy, bất kể vùng nào trong hệ gen của các cá thể, các cấu trúc tương ứng đều có khả năng kết hợp với nhau. Sự kết hợp ADN này không hoàn toàn tuyệt đối, cho nên phương pháp hợp lai ADN - ADN chỉ có thể sử dụng để biết tổng thể trong sơ bộ giám định mà không có giá trị thật sự trong khảo sát các đặc tính cá thể để phân loại. Do vậy, phương pháp này ít được coi là có hiệu quả trong nghiên cứu về phả hệ. Hơn nữa, đây là phương pháp đắt tiền, khó thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm còn thiếu thốn, và lượng ADN nghiên cứu đòi hỏi rất lớn (tới hàng miligam). Phương pháp lai ADN phóng xạ Đó là việc sử dụng một phân đoạn ADN đã biết, được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ, rồi hợp lai với ADN của hệ gen các cá thể cần nghi ên cứu. Nếu có sự tương ứng đồng nhất về cấu trúc, đoạn ADN gắn đồng vị phóng x ạ sẽ kết hợp với ADN hệ gen và vùng đó sẽ được phát hiện bằng các kỹ thuật tiếp theo của ph ương pháp này. Nhiều loại KST được giám định bằng phương pháp này, trong đó có: Leishmania, Trypanosoma, Schistosoma, Fasciola(8,10), đặc biệt là KST sốt rét,
Plasmodium falciparum. Đối với KST sốt rét, nhiều phương pháp chẩn đoán kể cả huyết thanh học bằng kháng thể đơn dòng đều rất khó phân biệt các chủng của chúng, nhưng phương pháp ADN phóng xạ đã cho kết quả chính xác. Ngày nay, phương pháp này được kết hợp với kỹ thuật PCR (xem phần sau) và chỉ thị hệ gen nhân, đã cho những kết quả mà các phương pháp khác không thể đạt được. Phương pháp phân tích biến thái phân đoạn ADN bằng kỹ thuật enzym giới hạn (phương pháp RFLP) Đây là một phương pháp mới, sử dụng enzym giới hạn (restriction enzyme), cắt rời ADN hệ gen thành nhiều đoạn dài ngắn khác nhau. Khi kiểm tra trên thạch agarose chúng ta thu nhận được các đoạn (băng) ADN khác nhau, từ đo lập nên bản đồ hệ gen, gọi là bản đồ enzym giới hạn của mỗi một cá thể. Phương pháp này có tên gọi là RFLP (restriction fragment length polymorphism). Enzym giới hạn là sản phẩm protein của vi khuẩn, có khả năng nhận biết một chuỗi nucleotide ngắn (4-8 nucleotide) và cắt rời ADN ở vị trí này. Khi sử dụng 1 hay nhiều enzym giới hạn, chúng sẽ tìm đúng vị trí đặc hiệu để cắt và cho những đoạn ADN dài ngắn khác nhau. Bất kỳ có sự biến đổi nào trong hệ gen (sự đảo gen, thêm bớt ADN, đột biến điểm, tăng giảm các cấu trúc lặp...), đều dẫn đến sự thay đổi các điểm cắt, và do vậy, khi dùng phương pháp RFLP sẽ cho bản đồ
enzym hạn chế khác biệt. Cá thể đó đã có sự biến đổi di truyền nhất định, hay nói cách khác đã có thể thuộc biến chủng khác. Phương pháp RFLP dễ làm, cho độ chính xác cao và có thể thực hiện trên ADN của nhiều cá thể trong thời gian ngắn. Một điều cần chú ý là đôi khi ngẫu nhiên có 2 hay nhiều đoạn ADN bằng nhau, rất khó phát hiện độ dài trên thạch agarose. Sau khi xử lý kết quả nhiều lần bằng phương pháp RFLP, mỗi một hệ gen của mỗi một cá thể thuần chủng sẽ cho một bản đồ g en xác định và giống nhau. Ngược lại, khi bị biến đổi, các cá thể biến chủng sẽ cho bản đồ RFLP khác nhau. Độ sai khác càng xa thì sự biến chủng càng lớn. Khi độ sai khác cao hơn mức xác định, các cá thể này đã có thể thuộc về chủng khác khi xem xét phân loại. Phương pháp phân tích trực tiếp ARN Nhiều nghiên cứu đã sử dụng axit ribonucleic (ARN) ribôxôm của hệ gen làm đối tượng phân tích để giám định và phân loại sinh vật. ARN ribôxôm sao chép dưới dạng sợi đơn, nên cần phải chuyển đổi trở thành ADN bằng enzym sao chép ngược (reverse transcriptase) và sử dụng các primer thông thường để phân tích trật tự nucleotide. Tuy đ ược sử dụng khá phổ biến, nhưng do tính phức tạp, và gần đây do kỹ thuật phân tích ADN trực tiếp được sử dụng thông dụng hơn, phương pháp này đã không còn chiếm vị trí quan trọng nữa. Hơn nữa, ARN
nghiên cứu đòi hỏi phải tinh kiết, phải tách chiết trực tiếp từ tế bào sống, rất khó thu nhận với số lượng lớn. NHỮNG PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN KỸ THUẬT PCR Phản ứng PCR Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) được sử dụng rộng rãi từ những năm đầu 1990, và thực sự là phương tiện có hiệu quả trong nghiên cứu di truyền phân tử của các loài. Chỉ cần một lượng nhỏ ADN làm khuôn (tinh khiết hoặc hỗn hợp), PCR có thể nhân lên hàng triệu bản sao ADN vùng cần nghiên cứu. Thông thường, nếu sử dụng kỹ thuật PCR đơn giản, đoạn ADN thu nhận được có độ dài cao nhất đến 2.000-3.000 nucleotide. Nếu áp dụng kỹ thuật PCR hiện đại, với enzym chịu nhiệt cao và bền, có thể thu nhận ADN có độ dài đến trên 10.000, thậm chí đến 20.000 nucleotide. PCR là phản ứng enzym xúc tác của enzym ADN polymeraza chịu nhiệt, sử dụng nhiều nhất là Taq polymearase (phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus), trong môi trường có nồng độ ion Magiê (Mg++) thích hợp, với các thành phần dẫn chất nucleotide đầy đủ làm nguyên liệu, có hai đoạn ngắn nucleotide làm mồi (gọi là oligo hay primer). Phản ứng sẽ tiến hành tổng hợp các đoạn ADN tương ứng trên khuôn ADN, trong giới hạn giữa các primer. Sự tổng hợp ADN tăng theo cấp số 2n, sau 25-40 chu kì, sẽ cho số lượng ADN là hàng triệu bản sao. Thời gian thực hiện PCR là vài giờ, với chương trình tự động hoá,
nên không tốn công sức. Hiện nay, đã có máy phân tích trật tự nucleotide tự động (automated sequencer), nên sản phẩm PCR sau khi đ ược làm sạch, sẽ được phân tích ngay rất thuận lợi cho nghiên cứu. Phương pháp PCR không đòi hỏi ADN với lượng lớn, nên có thể sử dụng trực tiếp ADN mẫu vật để làm khuôn, mà không cần phải nuôi cấy (đối với KST chẳng hạn), do vậy loại trừ ảnh hưởng của vật chủ và môi trường đối với đối tượng nghiên cứu. Đối với phản ứng PCR, tính vô trùng phân tử phải được chú ý, tránh lẫn tạp nhiều loại ADN khác nhau(9). Có nhiều loại PCR, trong đó có PCR thông thường và PCR đặc biệt. PCR thông thường (conventional PCR) là sử dụng 1 cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR thu được có độ dài vài trăm đến vài nghìn nucleotide. PCR đặc biệt trước hết phải kể đến: i) PCR dài (long PCR): cho sản phẩm vài chục nghìn nucleotide, thành phần tham gia đòi hỏi tinh khiết, chọn lọc, có tính năng cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu giải mã hệ gen. ii) PCR lồng (nested PCR): Có PCR lồng đơn (sử dụng 1 cặp mồi); bán lồng (semi-nested PCR) sử dụng 3 mồi; và lồng hoàn toàn (fully nested PCR) sử dụng 2 hay nhiều cặp mồi. PCR lồng đảm bảo cho sản phẩm tin tưởng và ADN sinh ra ở chu kỳ trước là nguồn khuôn tiếp cho các chu kỳ sau của PCR.
iii) PCR đơn, kép và đa năng: PCR đơn (uniplex-PCR) sử dụng 1 cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm trên 1 nguồn khuôn từ 1 loại (vi) sinh vật; PCR kép (duoplex- PCR) sử dụng 2 cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm trên 2 nguồn khuôn từ 2 loại (vi) sinh vật; PCR đa năng (multiplex-PCR) sử dụng nhiều cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm trên nhiều nguồn khuôn khác nhau, do đó cùng lúc chẩn đoán, phát hiện nhiều loại (vi) sinh vật khác nhau. iv) PCR khác: Ngoài ra còn nhiều loại PCR sử dụng mồi không đặc hiệu, hoặc PCR cực đại (mega PCR), PCR tăng /giảm, PCR định lượng (Real-time PCR), PCR xác suất ... Phương pháp RFLP -PCR Như trên đã trình bày, RFLP là phương pháp dùng enzym giới hạn cắt ADN hệ gen của cá thể, lập bản đồ gen để nghiên cứu. RFLP -PCR cũng là phương pháp dùng enzym giới hạn, nhưng chỉ để cắt một phần hệ gen, là đoạn ADN thu nhận được qua phản ứng PCR. Như vậy, các phân đoạn ADN được cắt ngắn hơn, chính xác hơn, bản đồ gen chi tiết hơn, nên những thay đổi nhỏ ảnh hưởng đến phân đoạn ADN của hệ gen cũng được phát hiện dễ dàng hơn. Đây là phương pháp dễ làm, đơn giản, các đoạn ADN sau khi cắt được nhuộm bằng Ethidium Bromide, một loại hoá chất phát hiện ADN khi xem dưới tia cực tím, sau khi chạy điện di trên thạch agarose. Đối với phương pháp RFLP, lượng ADN nghiên cứu cần rất nhiều, nhưng với phương pháp RFLP-
PCR, chỉ cần một lượng nhỏ (nanogam) cũng đủ, vì ADN của vùng cần nghiên cứu có thể thu được một lượng lớn qua phản ứng PCR. Bằng phương pháp này, nhiều nhóm KST đơn bào (Protozoa) và một số sán lá đã được nghiên cứu và cho bản đồ gen từng vùng của hệ gen. Phương pháp RAPD phân tích biến thái ADN bằng phản ứng PCR xác suất Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), thực chất là phản ứng PCR nhân các vùng ADN bằng các primer không hoàn toàn đặc hiệu. Cùng lúc, các cặp primer đó, sẽ cho các đoạn ADN khác nhau, được nhân lên có tính chất xác suất (không hoàn toàn được xác định trước). Mặc dù vậy, hai cá thể có tương đồng về di truyền và thuần chủng, sẽ cho số lượng, độ dài các đoạn ADN tương đương, khi sử dụng các cặp primer như nhau và phản ứng PCR thực hiện trong điều kiện như nhau. Nếu có sự sai khác (số lượng và độ dài) của sản phẩm PCR, chắc chắn giữa các cá thể đó đã có sự biến đổi nhất định trong hê gen của chúng. Tương tự, những cá thể lai thuần sẽ cho bản đồ sản phẩm PCR giống nhau, lai tạp sẽ cho bản đồ PCR khác nhau. Khác với PCR đặc hiệu, PCR xác suất (RAPD) sử dụng các cặp primer không hoặc kém đặc hiệu và ngắn (thông thường 10-12 nucleotide). Các primer này được tổng hợp dựa trên chuỗi nucleotide bảo tồn trong loài, do vậy, phương
pháp RAPD được sử dụng nghiên cứu cho nhiều chủng trong loài, có tính chất đa dụng hơn các phản ứng PCR đặc hiệu khác. Cũng do tính kém đặc hiệu của primer, nên phương pháp RAPD có yếu thế là nếu sử dụng ADN có lẫn tạp sẽ cho sản phẩm PCR lẫn tạp rất phức tạp khi đánh giá kết quả. Do vậy, phương pháp RAPD phải được sử dụng một cách thận trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử KST, vì KST là thực thể dễ lẫn tạp với nhiều loại sinh vật khác, dễ lẫn tạp với vật chủ và môi trường. Tuy vậy, các phương pháp RFLP, RFLP-PCR và RAPD là những phương pháp ưu việt trong nghiên cứu giám định, phân loại sinh vật nói chung và KST nói riêng. Các phương pháp này còn được coi là phương pháp tìm dấu di truyền học phân tử của loài (DNA finger-printing), kể cả xét nghiệm hình sự ở người và phân loại nhân chủng học. Trong nghiên cứu KST, bằng các phương pháp này, đã có một số kết quả về tính đa dạng sinh học của một số loài cơ bản như: Schistosoma, Cryptosporodium, Plasmodium....