Chế tạo hạt từ gắn kháng thể kháng salmonella spp., dùng để tăng khả năng phát hiện vi khuẩn

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

50
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu với mục tiêu nhằm tìm hiểu chế tạo phức hợp hạt từ gắn kháng thể kháng salmonella và tối ưu phương pháp IMS trong việc bắt giữ và cô đặc vi khuẩn. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Chế tạo hạt từ gắn kháng thể kháng salmonella spp., dùng để tăng khả năng phát hiện vi khuẩn

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 CHẾ TẠO HẠT TỪ GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG SALMONELLA SPP., DÙNG ĐỂ TĂNG KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN Dương Ngọc Diễm*, Đỗ Thị Kim Yến*, Nguyễn Thị Nguyệt Thu* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Salmonella spp. là tác nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm. Phân tách miễn dịch từ (IMS) sử dụng các vi hạt từ tính, có bề mặt gắn kháng thể đặc hiệu với Salmonella để tóm bắt và cô đặc vi khuẩn trực tiếp trên các nền mẫu phức tạp, giúp giảm thiểu khả năng cho kết quả âm tính giả. Mục tiêu nghiên cứu: Chế tạo phức hợp hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella và tối ưu phương pháp IMS trong việc bắt giữ và cô đặc vi khuẩn. Phương pháp nghiên cứu: Tinh chế kháng thể kháng Salmonella từ kháng huyết thanh thương mại bằng phương pháp sắc kí ái lực miễn dịch. Kháng thể sau tinh chế được cộng hợp đồng trị lên hạt từ. Khảo sát các điều kiện tối ưu của phương pháp IMS trong tóm bắt và phát hiện Salmonella. Kết quả nghiên cứu: Phương pháp IMS sử dụng 2 μl (9,8x109 hạt/ml) phức hợp hạt từ 1 μm gắn 200 μg kháng thể kháng Salmonella ủ với vi khuẩn trong 10 phút cho khả năng phát hiện 103 tế bào Salmonella/ml. Kết luận: Kháng thể kháng Salmonella được tinh chế từ kháng huyết thanh thương mại và được gắn lên hạt từ đường kính 1 μm. Phức hợp hạt từ ‐ kháng thể có khả năng bắt được tất cả các nhóm vi khuẩn Salmonella gây ngộ độc thực phẩm (B, D, E, C1, C2‐C3) và nhóm A (chỉ được phân lập từ mẫu bệnh phẩm). Phương pháp IMS sử dụng phức hợp hạt từ‐kháng thể tự chế tạo để tóm bắt và cô đặc hiệu quả Salmonella trực tiếp từ từ dung dịch đệm pha loãng. Từ khóa: Salmonella, phân tách miễn dịch từ, phương pháp cộng hợp ABSTRACT PREPARE THE COMPLEX OF IMMUNOMAGNETIC BEAD WITH COVALENTLY LINKED ANTI‐ SALMONELLA ANTIBODIES USED TO ENHANCE THE ABILITY TO ISOLATE SALMONELLA SPP. Duong Ngoc Diem, Do Thi Kim Yen, Nguyen Thi Nguyet Thu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 250 ‐ 256 Background: Salmonella is one of the most common causes of food poisoning in humans. Immunomagnetic separation (IMS) using small super‐paramagnetic particles coated with antibodies against Salmonella for the isolation of this pathogen directly from complex samples. It helps to reduce false negative results. Objectives: Prepare the complex of immunomagnetic bead with covalently linked anti‐Salmonella antibodies and optimize the IMS procedure for trapping and isolating Salmonella. Method: Purified antibodies from the commercial Salmonella O Antiserum by immuno‐affinity chromatography on Hitrap‐protein A column. The antibodies were conjugated onto magnetic beads by 1‐ethyl‐3‐ (3‐dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC). Evaluation the activity of antibodies conjugated beads by agglutination reaction on glass slide. Determine the optimal conditions of IMS method. Build‐in the culture method for the isolation of Salmonella in food samples using the magnetic bead- antibodies complex. Results: Magnetisable beads in 1 μm diameter were coated with 200 μg anti‐Salmonella antibodies. The sensitive of system in PBS is 103 Salmonella per ml. IMS method is set with the following parameters: 2 μl * Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Dương Ngọc Diễm ĐT: 0909966780 250 Email: ngocdiem99s@yahoo.com Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Nghiên cứu Y học complex was incubated with bacteria in 10 minutes and the complex after catching bacteria were washed 3 times with PBS – 0,1% Tween 20. Conclusion: Purified anti‐Salmonella from commercial antiserum and prepared magnetic bead-antibodies complex. This complex can arrest Salmonella groups: A, B, C1, C2‐C3, D and E. IMS technique using fabricated complex to capture and concentrate Salmonella directly from diluted buffer solution. Keywords: Salmonella, immunomagnetic separation, coating procedure tách khỏi các thành phần khác trong mẫu nhờ ĐẶT VẤN ĐỀ vào thanh nam châm đặt bên ngoài ống nghiệm. Salmonella spp. là một trong các tác nhân Vi khuẩn liên kết trên hạt từ vẫn giữ được khả hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm. Năm 2012, tại năng tăng sinh trên các loại môi trường. Kỹ Mỹ có 423 vụ ngộ độc thực phẩm thì ngộ độc do thuật IMS được thực hiện trong khoảng 30 phút, Salmonella đứng hàng thứ hai và chiếm 25% 4. Ở có thể thay thế hay làm tăng hiệu quả của các Việt Nam, mỗi năm có khoảng 120‐250 vụ ngộ bước tăng sinh chọn lọc (thông thường cần 18‐48 độc thực phẩm do nhiễm khuẩn trong đó số vụ giờ)10. ngộ độc do Salmonella chiếm đến 70%15. Theo thống kê, S. enteritidis và S. typhimurium là hai kiểu huyết thanh phổ biến nhất được phân lập từ mẫu thực phẩm cũng như từ bệnh nhân trên toàn thế giới4,5. Các thực phẩm thường nhiễm Salmonella là thịt, cá, trứng, sữa, thủy sản, rau quả, nước chấm, nước khoáng, … Trong những năm gần đây, tỷ lệ bùng phát ngộ độc thực phẩm gây ra bởi trái cây tươi và rau quả đã tăng lên và trở thành mối quan tâm lớn ở nhiều nước(12). Do Salmonella có khả năng gây hại nghiêm trọng đến sức khỏe con người và động vật nên nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam đã qui định không cho phép sự hiện diện của Salmonella thực phẩm(3,11). Phương pháp phát hiện Salmonella hiện nay thường cho kết quả từ 5‐7 ngày và trên một số nền mẫu phức tạp có thể cho kết quả âm tính giả. Vì thế, một phương pháp xác định Salmonella cho kết quả nhanh hơn, với độ nhạy bằng hay cao hơn phương pháp nuôi cấy thông thường là cần thiết. Phân tách miễn dịch từ được sử dụng thành công và rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sinh học khác nhau như sinh học phân tử, miễn dịch học và vi sinh học13. Để tách vi khuẩn mong muốn có trong mẫu, các vi hạt có từ tính được gắn kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn đích. Vi hạt sau khi liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích dễ dàng được Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Hiện nay, tại Việt Nam, đã có nghiên cứu đầu tiên ứng dụng phức hợp hạt từ‐kháng thể kháng E.coli O157 dạng thương mại để phân lập vi khuẩn E.coli O157:H7 10. Tuy nhiên, vấn đề về chế tạo phức hợp hạt từ gắn kháng thể kháng vi sinh vật mục tiêu vẫn chưa có công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào. Mục tiêu nghiên cứu ‐ Chế tạo phức hợp hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella. ‐ Tối ưu và đánh giá phương pháp IMS trong việc bắt giữ và cô đặc Salmonella. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu ‐ Chủng vi khuẩn: Salmonella Paratyphi A ATCC 9150, Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Salmonella Choleraesuis ATCC 12011, Salmonella Newport, Salmonella Enteritidis ATCC 13076, Salmonella Anatum, Salmonella Senftenberg. ‐ Hạt từ mang nhóm carboxylic acid: Carboxylic acid MyOne với kích thước hạt là 1 μm và Carboxylic acid M‐270 với kích thước hạt là 2,8 μm (Invitrogen). ‐ Huyết thanh thỏ đa giá kháng Salmonella nhóm O: Salmonella O Antiserum Poly A, Salmonella O Antiserum Poly B (BD Difco). 251 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Phương pháp nghiên cứu Xác định khả năng phản ứng của kháng huyết thanh thương mại với các chủng vi khuẩn S. paratyphi A, S. typhimurium, S. cholerasuis, S. newport, S. enteritidis, S. anatum và S. Senftenberg Mỗi loại vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy trên TSA ở 37ºC trộn với 10 μl kháng huyết thanh. Quan sát ngưng kết sau 1 phút. Chứng âm là mẫu vi khuẩn trong NaCl 0,9%. Tinh chế kháng thể từ kháng huyết thanh thương mại bằng sắc ký ái lực qua cột Hitrap‐Protein A Cho 1 ml dung dịch kháng huyết thanh qua cột Hitrap‐Protein A. Rửa cột sắc ký bằng dung dịch đệm Tris‐HCl 10 mM, pH=7,5. Đẩy kháng thể bám trên cột bằng dung dịch glycine 0,1 M, pH=2,5 và trung hòa bằng Tris 1 M, pH=8. Thu phần kháng thể qua cột và bảo quản ở 4ºC cho đến khi sử dụng. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford Dung dịch IgG chuẩn: pha trong đệm PBS (dải nồng độ đi từ 0‐32 g/ml). Dung dịch IgG chuẩn và IgG mẫu được ủ với dung dịch Bradford trong 5 phút tại nhiệt độ phòng. Đo hấp phụ quang của các dung dịch tại bước sóng 595 nm. Dựng đường chuẩn dựa trên lượng IgG chuẩn và độ hấp thụ của nó. Dựa trên đường chuẩn xác định nồng độ của dung dịch IgG chưa biết. Dùng phần mềm KC4 để tính hàm lượng kháng thể có trong mẫu. Cộng hợp đồng trị kháng thể sau tinh chế vào hạt từ (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) 1 ml hạt từ được rửa với 1 ml đệm MES 15 mM, pH=6. Huyền phù hạt từ trong 100 l đệm MES 15 mM, pH=6 và hoạt hóa bằng 100 l EDC trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và lắc tròn. Loại bỏ nước nổi bằng DynaMag‐2 và thu hạt từ. Thêm kháng thể O‐polyA, O‐polyB vào. Ủ lắc dung dịch trên qua đêm ở nhiệt độ phòng. 252 Loại bỏ nước nổi và thu hạt từ. Rửa hạt từ bằng 1 ml đệm PBS‐0,1% Tween 20. Huyền phù lại hạt từ trong PBS‐0,1% Tween 20‐0,1% BSA (9,8x109 hạt/ml). Bảo quản phức hạt từ‐kháng thể ở 4ºC. Khảo sát các điều kiện tác động đến khả năng tương tác của hạt từ gắn kháng thể với vi khuẩn S. Enteritidis Chuẩn bị mẫu vi khuẩn Vi khuẩn S. enteritidis được nuôi cấy trong nước đệm pepton từ 18‐24 giờ ở 37ºC cho đến khi OD600 đạt khoảng 0,8 ứng với 1‐2x108 cfu/ml(16. Dung dịch trên được pha loãng bậc 10 trong đệm muối phosphate thành dãy: 107‐106‐ 105‐104‐103‐102‐101‐100 cfu/ml. Mật độ vi khuẩn được xác định bằng cách cấy trải các dung dịch lên đĩa thạch TSA, ủ ở 37ºC từ 18‐24 giờ và đếm số khuẩn lạc tạo thành. Tác động của kích thước hạt từ và lượng kháng thể gắn lên hạt Các dạng hạt từ được ủ với các nồng độ kháng thể khác nhau. Hạt có đường kính 1 μm: cộng hợp ở hai nồng độ kháng thể là 200, 400 μg/ml hạt. Hạt có đường kính 2,8 μm: cộng hợp ở 3 nồng độ kháng thể là 200, 400, 600 μg/ml hạt. Sau khi ủ 10 phút với vi khuẩn ở dãy pha loãng từ 102‐105, rửa 3 lần, cấy trải lên thạch XLD, ủ 37°C trong 18‐24 giờ và đếm số khuẩn lạc. Tác động của thể tích phức hợp hạt từ‐kháng thể Phức hợp hạt từ‐kháng thể với thể tích 1, 2, 5 và 10 μl được cho vào bắt vi khuẩn ở dãy pha loãng từ 102‐105. Sau IMS, cấy trải 0,1 ml lên thạch XLD. Tác động của thời gian ủ phức hợp hạt từ‐kháng thể với vi khuẩn đích Phức hợp hạt từ‐kháng thể được cho vào bắt vi khuẩn ở dãy pha loãng từ 102‐104 với thời gian ủ 5, 10, 20 và 40 phút. Sau IMS, cấy trải 0,1 ml lên thạch XLD. Khả năng bắt các loại vi khuẩn Salmonella của hạt từ gắn kháng thể Hút 1 ml dung dịch vi khuẩn đã pha loãng (10 ‐106) vào từng ống eppendorf. Thêm 2 μl hạt 2 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 từ và hỗn hợp được ủ lắc ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Loại bỏ nước nổi dùng nam châm DynaMag‐2. Rửa phức hợp hạt từ bằng đệm PBS‐0,1% Tween 20. Huyền phù phức hợp hạt từ‐vi khuẩn trong 100 l NaCl 0,9%. Cấy trải toàn bộ phức hợp lên thạch XLD và đếm số khuẩn lạc. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xác định khả năng bắt Salmonella của kháng huyết thanh thương mại Hiện nay có hơn 2600 kiểu huyết thanh Salmonella, trên 59% thuộc về S. enterica subsp. I (S. enterica subsp. enterica). Trong S. enterica subsp. I, các kiểu huyết thanh kháng nguyên O thông dụng nhất là A, B, C1, C2‐C3, D và E (E1‐E4). 99% bệnh do Salmonella trên người và các động vật máu nóng gây ra từ các kiểu huyết thanh này. Tuy nhiên, chỉ khoảng 10 kiểu huyết thanh thường gây ra ngộ độc: S. typhimurium, S. derby và S. heidelberg (nhóm B), S. enteriditis (nhóm D), S. anatum và S. senftenberg (nhóm E), S. virchow, S. montevideo và S. infantis (nhóm C1), S. hadar và S. newport (nhóm C2‐C3)25, trong đó S. typhimurium và S. enteriditis được xem là mầm bệnh truyền qua thực phẩm quan trọng nhất. Kháng huyết thanh thương mại O‐poly A và O‐poly B có đặc tính ngưng kết với các nhóm Salmonella như sau: ‐ Salmonella O Antiserum Poly A dùng ngưng kết với Salmonella nhóm A, B, D, E, L. ‐ Salmonella O Antiserum Poly B dùng ngưng kết với Salmonella nhóm C1, C2, F, G, H. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng huyết thanh thương mại với các chủng vi khuẩn S. paratyphi A (nhóm A), S. typhimurium (nhóm B), S. enteritidis (nhóm D1), S. anatum (nhóm E1), S. senftenberg (nhóm E4), và S. cholerasuis (nhóm C1), S. newport (nhóm C2‐C3), chúng tôi nhận thấy kháng huyết thanh có khả năng ngưng kết với các chủng trên (hình 1). Do đó, để có thể phát hiện được tất cả các kiểu huyết thanh gây ngộ độc thực phẩm, chúng tôi đã dùng cả hai loại kháng thể trên phủ lên hạt từ. Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Nghiên cứu Y học Hình 1: Kiểm tra kháng huyết thanh thương mại Khả năng cộng hợp kháng thể lên hạt từ Mật độ liên kết của kháng thể vào hạt từ là yếu tố quyết định hiệu quả liên kết của hạt từ với vi khuẩn sau này. Theo hướng dẫn từ nhà sản xuất, nồng độ kháng thể gắn lên hạt tối đa là 400 μg/ml đối với hạt có đường kính 1 μm và 600 μg/ml đối với hạt có đường kính 2,8 μm. Do đó, chúng tôi tiến hành gắn kháng thể ở các nồng độ khác nhau nhưng không vượt quá nồng độ khuyến cáo của nhà sản xuất. ‐ Hạt có đường kính 1 μm: cộng hợp kháng thể ở 2 nồng độ 200, 400 μg/ml hạt. ‐ Hạt có đường kính 2,8 μm: cộng hợp kháng thể ở 3 nồng độ 200, 400, 600 μg/ml hạt. ‐ Xác định hiệu suất của quá trình cộng hợp bằng phương pháp Bradford. Kết quả cho thấy tất cả kháng thể đều cộng hợp hết lên hạt từ trừ nồng độ 400 μg kháng thể/ml hạt từ 1 μm hiệu suất cộng hợp chỉ đạt 81,3%. Do đó, lượng kháng thể gắn trên hạt tương ứng là 325 μg/ml. Chúng tôi thực hiện phản ứng ngưng kết giữa phức hợp hạt từ‐kháng thể với các chủng Salmonella trên lam kính để xác định khả năng tương tác giữa kháng thể với Salmonella sau cộng hợp. Hình 2: Kiểm tra hoạt tính phức hợp hạt từ‐kháng thể sau cộng hợp Kết quả cho thấy, phức hợp hạt từ‐kháng thể vẫn có khả năng ngưng kết với tất cả các nhóm Salmonella: A, B, C1, C2‐C3, D và E (biểu hiện qua các hạt từ kết tụ lại tại tâm của dung dịch). Hạt 253 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 từ không gắn kháng thể được xem là mẫu đối chứng (phân bố đều trong dung dịch). Khảo sát các điều kiện tác động đến khả năng tương tác của hạt từ gắn kháng thể với vi khuẩn S. enteritidis Để khảo sát các điều kiện tối ưu cho phương pháp IMS, chúng tôi dùng chủng S. Enteritidis vì đây là kiểu huyết thanh thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm. Tác động kích thước hạt từ và lượng kháng thể gắn lên hạt Kích thước hạt và lượng kháng thể sẽ quyết định khả năng tóm bắt vi khuẩn. Trong một số nghiên cứu, hạt từ có đường kính nhỏ bắt vi khuẩn tốt hơn do tốc độ lắng chậm khi ủ, thời gian tóm bắt vi khuẩn mục tiêu nhanh và ít gắn kết với các thành phần không đặc hiệu. Một số nghiên cứu khác cho thấy sử dụng hạt từ lớn tốt hơn do bề mặt lớn nên dễ 8,9 dàng tiếp xúc với bề mặt tế bào vi khuẩn . Mật độ kháng thể liên kết lên hạt cũng tác động đến hiệu suất bắt giữ vi khuẩn. Nếu lượng kháng thể trên hạt thấp, khả năng tóm bắt vi khuẩn ở lượng thấp giảm. Nếu lượng kháng thể trên hạt cao, hiệu suất bắt có thể giảm do hiệu ứng cản không gian giữa các phân tử kháng thể làm chúng khó tương tác với vi khuẩn. Trên hai loại hạt từ có đường kính 1 μm và 2,8 μm có các mật độ kháng thể liên kết khác nhau, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tóm bắt vi khuẩn S. enteritidis tại dãy pha loãng từ 102‐105. Do Salmonella có thể liên kết không đặc hiệu với hạt từ gắn kháng thể nên để xác định khả năng liên kết vào hạt từ của vi khuẩn là do liên kết đặc hiệu với kháng thể hay do liên kết không đặc hiệu với phức hợp hạt từ‐kháng thể, thực hiện gắn kháng thể tả lên hạt từ và tiến hành thí nghiệm song song. Kết quả cho thấy hạt từ gắn kháng thể tả không tương tác không đặc hiệu với Salmonella. Đường kính hạt và mật độ kháng thể liên kết trên hạt tác động đến hiệu quả bắt giữ vi khuẩn đích (bảng 1). Khi sử dụng 254 cùng một thể tích hạt từ để tóm bắt vi khuẩn, hạt từ 2,8 m chỉ bắt được vi khuẩn ở độ pha loãng 104 trong khi hạt từ 1 m vẫn tóm bắt được vi khuẩn ở độ pha loãng 102. Xét về mật độ kháng thể liên kết trên hạt từ 1 m, kết quả cho thấy không có sự khác biệt về khả năng bắt giữ vi khuẩn đích giữa 2 nồng độ 200 và 325 μg/ml hạt. Do đó, chúng tôi chọn hạt từ 1‐200 (hạt từ 1 μm phủ 200 μg kháng thể kháng Salmonella) cho các bước thử nghiệm tiếp theo. Bảng 1: Ảnh hưởng của kích thước hạt từ và lượng kháng thể gắn lên hạt 2,8 m Vi khuẩn/ml 1 m 600 400 200 325 200 µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 9,2x105 9,2x104 9,2x103 9,2x102 23 19 0 0 28 0 0 0 24 6 0 0 >250 >250 151 41 >250 >250 193 27 1 mIgGtả 325 µg/ml 0 0 0 0 Tác động của thể tích phức hợp hạt từ‐ kháng thể Lượng hạt từ sử dụng cần phải tối ưu vì đây là vật liệu có giá thành tương đối cao nhưng vẫn đảm bảo khả năng bắt giữ được vi khuẩn. Phức hợp hạt từ‐kháng thể với các thể tích khác nhau (1, 2, 5 và 10 μl) được cho vào bắt vi khuẩn ở dãy pha loãng từ 102‐105. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Thực hiện IMS. Kết quả cho thấy thể tích từ càng nhiều khả năng bắt vi khuẩn càng tốt, nhưng với thể tích 2 μl hạt từ vẫn có khả năng tóm bắt vi khuẩn tại độ hòa loãng tương tự như các thể tích cao hơn (bảng 2) nên chúng tôi chọn thể tích 2 μl từ cho các thí nghiệm tiếp theo. Bảng 2: Ảnh hưởng của thể tích phức hợp hạt từ‐ kháng thể đến khả năng bắt S.E Thể tích hạt từ sử dụng (µl) 1 2 5 10 Khuẩn lạc sau IMS và cấy trải trên XLD 2,4x102 2,4x103 2,4x104 2,4x105 1 24 49 55 19 197 220 > 250 71 > 250 > 250 > 250 234 > 250 > 250 > 250 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học