intTypePromotion=3
Array
(
    [0] => Array
        (
            [banner_id] => 140
            [banner_name] => KM1 - nhân đôi thời gian
            [banner_picture] => 964_1568020473.jpg
            [banner_picture2] => 839_1568020473.jpg
            [banner_picture3] => 620_1568020473.jpg
            [banner_picture4] => 994_1568779877.jpg
            [banner_picture5] => 
            [banner_type] => 8
            [banner_link] => https://tailieu.vn/nang-cap-tai-khoan-vip.html
            [banner_status] => 1
            [banner_priority] => 0
            [banner_lastmodify] => 2019-09-18 11:11:47
            [banner_startdate] => 2019-09-11 00:00:00
            [banner_enddate] => 2019-09-11 23:59:59
            [banner_isauto_active] => 0
            [banner_timeautoactive] => 
            [user_username] => sonpham
        )

)

Chỉ thị phân tử: Kỹ thuật AFLP

Chia sẻ: Nguyễn Bảo Triệu | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:20

0
291
lượt xem
94
download

Chỉ thị phân tử: Kỹ thuật AFLP

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật AFLP được phát triển bởi công ty KeyGene trong đầu những năm 1990 và đã trở thành một trong những công nghệ in dấu vân tay di truyền (fingerprinting) phổ biến nhất trên toàn thế giới. Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) và PCR để khuếch đại những đoạn DNA có chiều dài giới hạn sau khi được cắt hạn chế bởi enzyme cắt hạn chế. Phương pháp có độ nhạy cao trong việc tìm dấu vết của DNA của bất kỳ nguồn gốc nào hay sự phức tạp nào...

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Chỉ thị phân tử: Kỹ thuật AFLP

  1. ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ KHOA SINH HỌC CHỈ THỊ PHÂN TỬ KỸ THUẬT AFLP (Amplified fragment length polymorphisms) Giảng viên: Học viên: TS. Nguyễn Thị Thu Liên Nguyễn Hữu Nhân Nguyễn Bảo Triệu Huế - 12/2011
  2. NỘI DUNG TRÌNH BÀY 1. Giới thiệu. 2. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP. 3. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị. 4. Ứng dụng. 5. Kỹ thuật cDNA­AFLP. 6. Ưu, nhược điểm 7. Kết luận. 8. Tài liệu tham khảo.
  3. Giới thiệu Kỹ thuật AFLP được phát triển bởi công ty KeyGene trong đầu  những  năm  1990  và  đã  trở  thành  một  trong  những  công  nghệ  in  dấu  vân tay di truyền (fingerprinting) phổ biến nhất trên toàn thế giới. Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kỹ thuật RFLP  (Restriction  Fragment  Length  Polymorphism)  và  PCR  để  khuếch  đại    những  đoạn  DNA  có  chiều  dài  giới  hạn  sau  khi  được  cắt  hạn  chế  bởi  enzyme cắt hạn chế. Phương pháp có  độ nhạy cao trong việc tìm dấu vết của DNA  của bất kỳ nguồn gốc nào hay sự phức tạp nào Có thể thực hiện với DNA của toàn hệ gen hay với cDNA (bản  sao nguyên bản).  Kỹ thuật  AFLP  được cấp bằng sáng chế vào năm 1991 và tại  thời  điểm này  được ban hành  ở nhiều quốc gia  như  Canada, Châu  Âu,  Nhật Bản, Úc và Mỹ. Hiện nay đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới. 
  4. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP ­ DNA được phân giải bởi hai enzyme cắt hạn chế khác nhau. ­  Phần  nối  (adapter)  oligonucleotide  được  nối  với  những  đầu  tận  cùng  của các phân đoạn DNA. ­ Tập con đặc trưng của các sản phẩm phân giải DNA được khuyếch đại,  sử dụng kết hợp các primer chọn lọc. ­ Phát hiện sự  đa hình có thể  được thực hiện với các  đồng vị phóng xạ,  nhuộm các màu huỳnh quang hay nhuộm bạc.
  5. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP Hình 1.Tổng quan về kỹ thuật AFLP
  6. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 1. Enzyme cắt hạn chế (RE): Sử dụng các RE loại II  ­ Thường sử dụng hai enzyne cắt hạn hạn chế khác nhau: EcoRI và MseI ­ Hai RE không cắt tại cùng một vị trí nhận biết ­ MboI va Sau3AI  ̀ BamHI: ­ Tất cả các RE sau khi cắt phải tạo ra đầu lồi
  7. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 1. Enzyme cắt hạn chế (RE): Kết quả sau khi cắt bằng RE 
  8. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 2. Phần nối (adapter) ­  Sau khi cắt bằng 2 RE, thì 2  đầu  đoạn DNA  được gắn các adapter  bằng enzyme ligase ­  Đoạn adapter gồm hai phần: phần trình tự lõi và phần trình tự  đặc  hiệu cho vị trí cắt enzyme
  9. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 3. PCR ­ Mồi của PCR được thiết kế dự trên trình tự adapter và một trình  tự chọn lọc khoảng vài nucleotide ­ Chỉ những phân đoạn nào chứa cả trình tự adapter và trình tự  chọn lọc mới được chọn lọc ­ Chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm  PCR và làm đơn giản quá trình phân tích   Quá trình PCR gồm hai phản ứng (preselective PCR) và  selective PCR
  10. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 3. PCR • Preselective PCR: Sử dụng primer + 1 nucleotide
  11. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 3. PCR • Selective PCR: Sử dụng primer + 1 + 2 nucleotide
  12. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 4. Phát hiện sự đa hình  ­Trường hợp primer có gắn đồng vị phóng xạ hoặc hóa chất phát  quang thì được phát hiện bằng hệ thống PCR có thu và xử lý tín  hiệu phát quang
  13. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 4. Phát hiện sự đa hình  ­ Trường hợp primer bình thường thì  sau khi chạy PCR, mẫu sẽ được điện di  trên gel và nhộm gel Pristionchus pacificus: C: California P: Poland H: Hawaii W: Washington
  14. Kỹ thuật cDNA-AFLP     * Phân lập mRNA từ mẫu quan tâm     * Sao chép ngược của mRNA bằng cách sử dụng  primer oligo­dT tổng hợp cDNA     *  Các  bước  tiến  hành  cắt  hạn  chế,  PCR,  phát  hiện  đa  hình  tương  tự  như  ở  DNA.
  15. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị Nguồn ­Nước cất và (hoặc) nước đã khử ion (deionised water) ­ Hoá chất Trang thiết bị Dụng cụ ­ Tủ lạnh, tủ đông sâu  ­ Các loại Micropipette và pipette  ­ Laminar có dòng hút khí tip tương ứng (đầu côn) ­ Máy li tâm ­ Các loại tube eppendorf ­ Máy PCR ­ Cối chày sứ ­ Máy đo pH  ­ Cân chuẩn ­ Găng tay ­ Máy điều chỉnh nguồn điện  ­ Máy điện di phương thẳng đứng ­ Lò hâm (hotplate)  ­ Máy giải trình tự tự động hoặc lò vi sóng (Microwave) ­ Máy soi bằng cực tím  (UV transilluminator)
  16. Ứng dụng ­ Đánh giá đa dạng di truyền ­ Phân tích độ dài di truyền ­ Kiểm tra dấu hiệu di truyền ­ Phân tích bộ sưu tập nguồn gene  (germplasm collections) ­ Xây dựng bản đồ gene ­ Quản lý các chỉ thị thăm dò
  17. Ưu, nhược điểm Ưu điểm: ­AFLP nhanh,  đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn  khảo sát được toàn bộ gen. ­Kỹ thuật này chỉ cần lượng ít DNA ban đầu   ­Không cần biết trước trình tự đích ­Có độ lặp lại phản ứng cao ­Các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài ­Khuếch  đại có chọn lọc một lượng lớn các  đoạn DNA  đa hình  trong một phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng giữa  các quần thể có quan hệ gần nhau.
  18. Ưu, nhược điểm Nhược điểm: • AFLPs tạo ra một lượng lớn thông tin cần phải  được phân  tích  tự  động,  vì  thế  cần  sự  giúp  đỡ  của  kỹ  thuật  máy  tính  cao • AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt  cá thể đồng hợp và dị hợp • Trong xây dựng bản  đồ di truyền, AFLPs thường tập trung  lại ở vùng centromeres và telomeres • Nhân viên phải có kỹ thuật phòng thí nghiệm và đặc biệt là  phân tích dữ liệu
  19. Kế t ­Kỹ  thuật  AFLP  dựa  vào ận lu sự  khuyếch  đại  chọn  lọc  các  phân đoạn hạn chế sau khi phân giải DNA ­Nó thăm dò sự  đa hình gây ra bởi những thay  đổi trong  những điểm hạn chế hay những vùng lân cận ­  Kỹ  thuật  này  tạo  nên  một  lượng  lớn  bands  trong  một  lần chạy, và các bước tiến hành đòi hỏi kỹ thuật cao
  20. Thank you!!!

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản