Cơ quan đích của gill-associated virus (gav) cảm nhiễm ở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei Boone, 1931)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 1/2014<br /> <br /> THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br /> <br /> CƠ QUAN ĐÍCH CỦA GILL-ASSOCIATED VIRUS (GAV) CẢM NHIỄM<br /> Ở TÔM CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei Boone, 1931)<br /> TARGET ORGANS OF GILL-ASSOCIATED VIRUS (GAV)<br /> INFECTED IN WHITELEG SHRIMP (Litopenaeus vannamei Boone, 1931)<br /> Nguyễn Thị Thùy Giang1<br /> Ngày nhận bài: 11/10/2013; Ngày phản biện thông qua: 08/11/2013; Ngày duyệt đăng: 10/3/2014<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei, Boone, 1931) nhập vào Trường Đại học Ghent (Vương quốc Bỉ) từ Thái<br /> Lan. Đây là đàn tôm không bị nhiễm các loại tác nhân gây bệnh đặc biệt (SPF), được ương nuôi trong hệ thống nước tuần<br /> hoàn ở điệu kiện môi trường có nhiệt độ 28 ± 10C, pH: 7,8-8,1 và độ mặn 35 ppt. Khi tôm này đạt kích cỡ 15-20g/con đã<br /> được cảm nhiễm chủng virus GAV (YHV type 2) bằng phương pháp tiêm cơ. Chủng virus này đã được phân lập từ tôm sú<br /> (Penaeus monodon) nuôi ở Úc. Sau 7 ngày cảm nhiễm, tôm thí nghiệm không bị chết, nhưng 20% số tôm này đã thể hiện<br /> một số dấu hiệu bất thường như: đường ruột rỗng do bỏ ăn, màu sắc cơ thể nhợt nhạt, đặc biệt là phần đầu ngực, cá biệt<br /> vỏ tôm bị mềm. Bằng phương pháp hóa mô miễn dịch, 3 loại mô đích của GAV ở tôm chân trắng đã được xác định là mô<br /> liên kết, biểu mô và mô tim. Đã có hàng loạt các cơ quan đích của GAV ở loài tôm chân trắng cũng đã được phát hiện như:<br /> mang, gan tụy, cơ quan lympho, cơ quan tạo máu, dạ dày, ruột tịt, tuyến sinh dục, hạch thần kinh, tuyến anten và phần phụ.<br /> Từ khóa: Gill-associated virus, tôm chân trắng, cơ quan đích, virus bệnh đầu vàng nhóm 2<br /> <br /> ABSTRACT<br /> White leg shrimp (Litopenaeus vannamei) was imported into Ghent university (Belgium) from Thailand, the shrimp<br /> was free from some specìic pathogens (Specific pathogen free - SPF), reared in a recirculating water system at the<br /> environmental conditions such as temperature 28 ± 100C, pH: 7.8 to 8.1 and 35 ppt salinity. When the shrimp reached 15-20<br /> g/individual, they was infected a GAV strain (YHV type 2), isolated from black tiger shrimp (Penaeus monodon) cultured<br /> in Australia, by intranmuscular injection administration. After 7 days, no experimental shrimp died, but 20% of the GAV<br /> infected shrimp showed some abnormal signs such as anorexia, empty gut, soft shell. By immunohistochemistry method,<br /> 3 types of target tissues của GAV in Litopenaeus vannamei have been identified as connective, epithelial and cardiac<br /> tissue. In addition, a series of GAV target organs in the infected shrimp were also found, such as gills, hepatopancreas, lymphoid<br /> organ, hematopoietic organ, stomach, intestine, gonad, ganglion, antennae and appendages.<br /> Keywords: Gill-associated virus, GAV, Yellow head virus type 2, whiteleg shrimp, pathogenesis<br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh đầu vàng (YHD) do yellow head virus<br /> (YHV) gây ra ở tôm sú (Penaeus monodon) đã được<br /> phát hiện lần đầu tiên tại Thái Lan năm 1991, sau đó<br /> lan ra các quốc gia khác như: Trung Quốc, Philipine,<br /> Indonessia, Srilanka và Đài Loan gây ra những thiệt<br /> hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi tôm của châu<br /> Á (OIE, 2009). Đến năm 2008, có ít nhất 6 type của<br /> YHV đã được xác định, trong đó chỉ có YHV type 1 và<br /> YHV type 2 đã được biết gây bệnh và chết ở tôm he.<br /> YHV type 1 chính là tác nhân gây ra bệnh đầu vàng<br /> 1<br /> <br /> (YHD) ở tôm sú (P. monodon) ở Thái Lan, tôm bệnh<br /> có dấu hiệu chính là phần đầu ngực của tôm chuyển<br /> màu vàng, gan và mang cũng có mầu vàng và tỷ lệ<br /> chết cao (Lightner, 1996; Wijegoonawamdane et al.,<br /> 2008). Năm 1996, YHV type 2 đã được thông báo<br /> gây ra bệnh ở giai đoạn ấu niên và trưởng thành của<br /> tôm sú nuôi trong các trang trại nuôi của Úc, gây ra<br /> tỷ lệ chết tới 100% (Spann et al., 1997). Bệnh này<br /> có các dấu hiệu khác với bệnh YHD đã được thông<br /> báo ở châu Á như: có màu đỏ ở phần đầu ngực và<br /> đuôi, mang tôm bệnh chuyển sang màu vàng, nâu<br /> <br /> ThS. Nguyễn Thị Thùy Giang: Viện Nuôi trồng thủy sản – Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 13<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> hoặc đỏ. Do vậy, virus YHV type 2 còn có tên là<br /> Gill-associated virus (GAV). Gần đây, GAV đã được<br /> phát hiện với tỷ lệ cao (100%) trong quần đàn tôm sú<br /> nuôi tại Úc (Cowley et al., 2004, 2009 và Walker et al.,<br /> 2001) và được cho rằng GAV cùng với các virus khác<br /> như IHHNV và MoV có liên quan đến hội chứng chết<br /> giữa vụ nuôi (Mid-crop mortality syndrome - MCMS)<br /> ở tôm sú (Oanh et al., 2011).<br /> Loài tôm chân trắng (L. vannamei) đã được di<br /> nhập từ Nam Mỹ vào nuôi rộng rãi ở nhiều quốc gia<br /> trên thế giới, đặc biệt là châu Á, góp phần làm tăng<br /> đáng kể sản lượng tôm nuôi của thế giới.<br /> Nghiên cứu này là một nội dung trong dự án<br /> nghiên cứu khả năng gây bệnh của GAV (YHV type 2)<br /> ở loài tôm chân trắng (L.vannamei) trong điều kiện<br /> thí nghiệm.<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Địa điểm nghiên cứu<br /> - Phòng Virus học của Khoa Thú y, Trường Đại<br /> học Ghent (Vương quốc Bỉ).<br /> - Phòng Thực nghiệm ướt của Khoa Thú y,<br /> Trường Đại học Ghent (Vương quốc Bỉ).<br /> 2. Vật liệu<br /> 2.1. Tôm chân trắng khỏe dùng cho thí nghiệm<br /> Hậu ấu trùng (postlavae) của dòng tôm chân<br /> trắng Litopenaeus vannamei không bị nhiễm các<br /> loại virus nguy hiểm như: WSSV, TS IHHN, IMN và<br /> YHV, được nhập về Trường Ghent (Vương quốc<br /> Bỉ) từ Thái Lan, được ương nuôi trong hệ thống<br /> nước tuần hoàn ở điệu kiện môi trường có nhiệt độ<br /> 28 ± 10C, pH: 7,8-8,1 và độ mặn 35 ppt.<br /> 2.2. Chủng virus GAV (YHV type 2)<br /> Một chủng GAV (hay còn gọi là YHV type 2)<br /> được cung cấp bởi Viện Nông nghiệp Nhiệt đới<br /> (CSIRO) của Úc, chủng virus này đã được phần lập<br /> từ tôm sú (Penaeus monodon) nuôi bị nhiễm GAV<br /> tại quốc gia này- AUS-96-Ref strain of GAV.<br /> 2.3. Tạo nguồn virus dùng cho thí nghiệm<br /> (virus stock)<br /> Chủng virus GAV nhận được từ Úc được pha<br /> loãng 10 lần trong phosphate buffer saline (PBS) để<br /> tạo nên PBS-GAV gốc. 50 µl PBS-GAV gốc được tiêm<br /> vào cơ của mỗi cá thể tôm chân trắng (15-20 g/con<br /> với n = 25 con). Tôm đã tiêm dịch virus được nuôi<br /> trong điều kiện nhiệt độ 27 ± 10C, độ mặn 35 ppt,<br /> để virus có thể nhân bản trong cơ thể của tôm. Sau<br /> thời gian 5 ngày, những con tôm chân trắng đã bị<br /> nhiễm GAV được thu và bảo quản ở nhiệt độ đông<br /> sâu (-700C). Khi cần, xả đông tôm ở nhiệt độ phòng,<br /> dùng phanh và kéo vô trùng cắt bỏ giáp đầu ngực<br /> của tôm. Mô của tôm được nghiền đồng nhất bằng<br /> máy nghiền đồng thể, trong PBS đã pha loãng 10 lần,<br /> <br /> 14 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Số 1/2014<br /> tỷ lệ giữa mô tôm và PBS pha loãng là 1/10. Hỗn<br /> hợp này được ly tâm bằng máy ly tâm lạnh (ở 400C,<br /> 5500 vòng /phút, trong 20 phút). Phần dịch nổi sau<br /> ly tâm được lọc qua màng 0,45 µm (có hỗ trợ bởi<br /> máy hút chân không). Dịch dưới lọc chính là virus<br /> stock, được giữ trong một cốc vô trùng và bảo quản<br /> ở nhiệt độ đông sâu -7000C cho đến khi thí nghiệm<br /> được triển khai.<br /> 2.4. Kháng thể đơn dòng (Mab) để xác định kháng<br /> nguyên của YHV trong kỹ thuật hóa mô miễn dịch<br /> Mab Y19 là kháng thể đơn dòng kháng lại 20<br /> kDa nucleoprotein p20 của YHCV (Sithigorngul et<br /> al, 2002) đã được cung cấp từ Phòng Sinh vật học,<br /> Khoa Khoa học, thuộc Đại học Srinakharinwirot,<br /> Bangkok, Thái Lan.<br /> 2.5. Các mẫu tôm chân trắng đã dương tính với GAV<br /> Các mẫu tôm này được thu trực tiếp từ các thí<br /> nghiệm cảm nhiễm GAV vào tôm khỏe. Sau cảm<br /> nhiễm, tôm chân trắng đã không bộc lộ những dấu<br /> hiệu đặc thù của bệnh đầu vàng (YHD), nên 100%<br /> số tôm ở bể thí nghiệm và bể đối chứng đã được<br /> thu để làm mẫu vật cho các nghiên cứu xác định mô<br /> đích và cơ quan đích của GAV ở tôm chân trắng.<br /> 2.6. Kháng thể thứ cấp Biotinylated sheep anti-mouse<br /> IgG antibody (RPN1001 Amersham Biosciences, UK)<br /> Được sử dụng như kháng thể thứ cấp trong<br /> phương pháp mô hóa miễn dịch. Kháng thể chiết<br /> xuất từ cừu được gắn Biotin này sẽ tạo nên phản<br /> ứng đặc hiệu với Immunoglobulin của kháng thể<br /> sơ cấp Mab Y19. Kháng thể này tiếp tục sẽ được<br /> nhận biết bởi phức hợp chứa enzyme Streptavidine<br /> biotinylated horseradish peroxidase complex<br /> (RPN1051 Amersham Biosciences, UK) theo mối<br /> gắn kết Biotin - strepavidine trong bước tiếp theo<br /> của phương pháp mô hóa miễn dịch.<br /> 3. Thiết kế thí nghiệm<br /> Tôm chân trắng (L.vannamei) có kích cỡ 15-20<br /> g/con, thuộc dòng tôm không bị nhiễm các loại virus<br /> đặc thù (SPF), được dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm<br /> virus với mục đích xác định các loại mô đích và cơ<br /> quan đích của GAV ở loài tôm chân trắng. Dịch virus<br /> stock (chứa GAV trong PBS - làm từ tôm chân trắng<br /> bị nhiễm GAV ở điều kiện thí nghiệm như đã mô tả<br /> ở mục 2.2.) được lấy ra khỏi tủ đông, pha loãng với<br /> PBS theo tỷ lệ 1:3 (có pH = 7,4). Dịch virus này được<br /> tiêm vào cơ bụng của 30 con tôm khỏe với liều 50<br /> µl/con tôm và 10 con tôm khỏe khác ở nghiệm thức<br /> đối chứng được tiêm dung dịch PBS vào cơ với<br /> liều 50 µl/con tôm. Sau cảm nhiễm, tôm thí nghiệm<br /> và đối chứng được nuôi dưỡng tách biệt trong hai<br /> bể kính có thể tích 100 lít với nước biển nhân tạo<br /> có độ mặn 35 ppt và nhiệt độ nước 27 ± 10C, sục<br /> khí liên tục ngày đêm. Quan sát các biến đổi bệnh<br /> lý của tôm thí nghiệm trong 7 ngày sau cảm nhiễm.<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> Đến ngày thứ 7, tôm ở bể thí nghiệm và bể đối chứng<br /> được thu, được cố định bằng cách tiêm 2 ml dung dịch<br /> Davidson vào phần đầu ngực và phần bụng của mỗi<br /> con tôm, sau đó cố định mẫu tôm này trong dung<br /> dịch Davidson với tỷ lệ về thể tích là 1:10. Sau 48h<br /> các mẫu này được chuyển sang cồn ethanol 50% để<br /> bảo quản cho đến khi được đưa vào phân tích tiếp<br /> theo bằng phương pháp hóa mô miễn dịch.<br /> 4. Phương pháp phân tích mẫu tôm<br /> Phương<br /> pháp<br /> hóa<br /> mô<br /> miễn<br /> dịch<br /> (Immunohistochemistry - IHC)<br /> Phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC)<br /> được giới thiệu bởi Sithrigorngul et al (2000) và<br /> Escobedo-Bonilla et al (2007) được sử dụng trong<br /> nghiên cứu này để xác định các loại mô đích và cơ<br /> quan đích của GAV khi virus này cảm nhiễm vào<br /> tôm chân trắng bằng phương pháp tiêm cơ.<br /> Các bước thực hiện được mô tả như sau:<br /> - Các tiêu bản đã được gắn với các lát cắt của<br /> mô tôm được bảo quản ở 550C, trong 30 phút.<br /> - Tiếp theo các tiêu bản này được làm mất<br /> parafin và no nước bằng cách đặt các lam mẫu trong<br /> xilen và cồn ethanol có nồng độ giảm dần: 100%,<br /> 95%, 70% và 50%, trong 5 phút cho mỗi bước thực<br /> hiện. Sau đó các lam mẫu được rửa trong dung dịch<br /> đệm Tris - có muối ăn (NaCL), trong 5 phút.<br /> - Ủ các lam mẫu này trong dung dịch gồm: 1%<br /> sodium azide và 0,02% hydrogen peroxidase trong<br /> dung địch đệm Tris có pH = 7,4.<br /> - Tiếp tục các lam mẫu này được ủ với kháng<br /> thể sơ cấp Y19 với độ pha loãng 1/200, ở nhiệt độ<br /> 370C, trong thời gian 1 giờ, sau đó các lam mẫu<br /> được rửa trong dung dịch Tris-có muối (NaCl).<br /> - Tiếp tục các slides mẫu được ủ tiếp kháng thể<br /> thứ cấp, biotinylated sheep antimouse IgG antibody,<br /> trong 1 giờ ở nhiệt độ 370C.<br /> <br /> Số 1/2014<br /> - Các lam mẫu lại được rửa một lần nữa với đệm<br /> Tris-NaCl trước khi ủ với dung dịch streptavidine<br /> biotinyllated horseradish peroxidase (RPN1051,<br /> Amersham Biosciences - Anh) ở độ pha loãng<br /> 1/200, trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.<br /> - Phát triển màu cho các mẫu mô được làm với<br /> 0,01% của 3, 3’- diaminobenzidine - DAB (D8001<br /> Sigma-Aldrich, Đức) trong đệm Tris không có NaCl,<br /> trong 10 - 15 phút.<br /> - Các lam mẫu được nhuộm với hematoxylin,<br /> sau đó rửa, làm mất nước trong cồn ethanol, làm<br /> trong mẫu trong xilen và đậy mẫu bằng lamel với<br /> keo dán kính.<br /> - Quan sát các lam mẫu này dưới kính hiển vi<br /> quang học. Các vùng mô dương tính với GAV (YHV<br /> type 2) thể hiện có màu nâu, khác biệt với các vùng<br /> mô âm tính có màu xanh đen của hematoxylin.<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> 1. Dấu hiệu bệnh ở tôm chân trắng khi bị nhiễm GAV<br /> Như đã trình bày ở mục 2.3 (trang 2), tôm<br /> chân trắng cỡ 15 - 20 g/con được cảm nhiễm dịch<br /> virus stock bằng phương pháp tiêm cơ với liều<br /> 50 µl/con. Bảy ngày sau cảm nhiễm, có khoảng 20%<br /> những con tôm chân trắng bị nhiễm GAV trong thí<br /> nghiệm này đã bộc lộ một số dấu hiệu khác với tôm<br /> ở nghiệm thức đối chứng như: bỏ ăn nên đường<br /> ruột rỗng, vỏ mềm, cơ thể có mầu nhợt nhạt, đặc<br /> biệt ở phần ở giáp đầu ngực (hình 1). Tuy nhiên,<br /> tất cả những con tôm chân trắng thí nghiệm bị cảm<br /> nhiễm GAV đều còn sống và không bộc lộ các dấu<br /> hiệu đặc trưng của bệnh đầu vàng (YHD) do virus<br /> YHV type 1 ở tôm sú (P. monodon) như thông báo<br /> của nhiều tác giả (Wijegoonawamdane et al., 2008;<br /> Lightner et al., 1996), và cũng không xuất hiện các<br /> dấu hiệu như tôm sú ở Úc bị nhiễm GAV theo thông<br /> báo của Spann et al. (1997).<br /> <br /> Hình 1. Một số dấu hiệu bộc lộ ở tôm chân trắng khi bị nhiễm GAV (YHV type 2)<br /> a. Tôm bị nhiễm GAV (ở trên) có ruột rỗng do bỏ ăn so với tôm ở nhóm đối chứng (ở dưới)<br /> b. Tôm nhiễm GAV (ở trên) có cơ thể nhợt nhạt, đặc biệt ở phần đầu ngực so với tôm ở nhóm đối chứng (ở dưới)<br /> <br /> 2. Xác định các loại mô đích của GAV ở tôm chân trắng<br /> Bằng phương pháp hóa mô miễn dịch, đã xác định được rằng, tôm chân trắng bị nhiễm GAV (YHV type 2)<br /> đã thể hiện bệnh lý không đặc thù của tôm sú bị nhiễm loại virus này như: phần giáp đầu ngực có màu vàng hay<br /> cơ thể có màu hồng đỏ. Tuy nhiên, sự cảm nhiễm và sao chép của virus này trong tế bào đã được phát hiện<br /> thấy ở 3 loại mô cơ bản của tôm: mô liên kết, biểu mô và mô tim (hình 2).<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 15<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 1/2014<br /> <br /> Hình 2. Các loại mô đích của GAV khi cảm nhiễm vào tôm chân trắng bằng cách tiêm cơ<br /> Biểu mô (a & b); mô liên kết (c & d); mô tim (e)<br /> (Chú thích: các vùng mô có màu nâu thể hiện nhiễm GAV; Độ phóng đại 200-400x)<br /> <br /> 3. Xác định các cơ quan đích của GAV ở tôm chân trắng<br /> Ở mục III.2 đã xác định được 3 loại mô cơ bản ở tôm chân trắng là mô đích của GAV, nên hàng loạt các cơ<br /> quan nội tạng khác nhau của loài tôm này đã được xác định là cơ quan đích của virus này (hình 3). Dưới kính<br /> hiển vi quang học, sắc tố màu nâu - thể hiện sự tồn tại kháng nguyên của GAV- được quan sát thấy rõ ràng ở<br /> nhiều nội quan khác nhau của tôm bị cảm nhiễm, là căn cứ để xác định cơ quan đích của GAV (YHV type 2) ở<br /> tôm chân trắng (hình 3). Phản ứng dương tính với GAV được tìm thấy ở cơ quan lympho ở 100% tôm bị cảm<br /> nhiễm virus.<br /> <br /> 16 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 1/2014<br /> <br /> Hình 3. Các cơ quan đích của GAV ở tôm chân trắng bị cảm nhiễm<br /> Ruột tịt (a, b); Cơ quan tạo máu (c, d); Cơ quan lympho (e, f); Hạch thần kinh (g, h); Thành của mạch máu (i, k); Mang (l, m);<br /> Cơ quan sinh dục (n, o); Gan tụy (p, q ) và dạ dày (r, s); Tuyến angten (t, u); Tim (v, w) và Biểu mô của phụ bộ (x, y)<br /> (Chú thích: Virus nhiễm thể hiện ở các vùng mô có màu nâu; mẫu mô được nhuộm IHC; độ phóng đại 200x và 400x)<br /> <br /> 4. Thảo luận<br /> Như đã trình bày ở trên, khi cảm nhiễm<br /> virus GAV (YHV type 2) vào cơ thể tôm chân trắng<br /> (L.vannamei) bằng phương pháp tiêm cơ, sau 7<br /> ngày cảm nhiễm, tôm thí nghiệm không có hiện<br /> tượng chết và các dấu hiệu bệnh bộc lộ không<br /> thật sự rõ ràng như đã được thông báo ở tôm sú<br /> (P. monodon) khi nhiễm GAV (Spann et al., 1997),<br /> hay tôm sú nhiễm chủng YHV type 1 (Lightner, 1996,<br /> <br /> Flegel, 2005). Kết quả của thí nghiệm này hoàn toàn<br /> khác với những báo cáo đã được thông báo trước<br /> đây, ví dụ như Tang et al (2002) thông báo rằng GAV<br /> có khả năng gây bệnh và chết cho tôm chân trắng<br /> (1-2g) với tỷ lệ chết gần 70% sau 14 ngày thí nghiệm.<br /> Tuy nhiên, bằng phương pháp hóa mô miễn dịch<br /> (IHC) đã chứng tỏ rằng, GAV (YHV type 2) đã cảm<br /> nhiễm và sao chép trong tế bào của 3 loại mô cơ<br /> bản ở tôm chân trắng khi bị cảm nhiễm virus này là:<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 17<br /> <br />