CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 8

Chia sẻ: Afsjkja Sahfhgk | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:21

Thêm vào BST

Báo xấu

213
lượt xem 73
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong đó, các thể đột biến bán lùn thường gắn chặt với khả năng chống đổ và kiểu cây cũng như thích nghi với chế độ phân đạm cao, nên chúng có tiềm năng năng suất cao. Vì vậy, việc gây tạo các thể đột biến bán lùn luôn là mục tiêu quan trọng trong chương trình chọn giống đột biến lúa... Nhiều nghiên cứu cho thấy hầu hết các giống hay dòng bán lùn đều có chứa cùng một gen bán lùn bắt nguồn chủ yếu từ giống bán lùn địa phương Đài Loan có tên Dee - geo...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 8

153 lùn hay siêu lùn (extra dwarf). Trong đó, các thể đột biến bán lùn thường gắn chặt với khả năng chống đổ và kiểu cây cũng như thích nghi với chế độ phân đạm cao, nên chúng có tiềm năng năng suất cao. Vì vậy, việc gây tạo các thể đột biến bán lùn luôn là mục tiêu quan trọng trong chương trình chọn giống đột biến lúa... Nhiều nghiên cứu cho thấy hầu hết các giống hay dòng bán lùn đều có chứa cùng một gen bán lùn bắt nguồn chủ yếu từ giống bán lùn địa phương Đài Loan có tên Dee - geo - woo - gen (DGWG). Điều đáng nói ở đây là, việc chấp nhận sử dụng rộng rãi cùng một gen bán lùn như vậy có thể đưa lại hậu quả xói mòn di truyền, làm giảm tính đa dạng di truyền vốn có ở cây lúa. Từ quan điểm này, nhu cầu về khai thác sử dụng các nguồn đa dạng về tính bán lùn được nhấn mạnh (IAEA, 1982; Maluszynski và cs, 1986). Công cuộc tìm kiếm các gen bán lùn mới không alen với gen sd-1 được tiếp diễn theo hai hướng: (1) thu thập bảo tồn và đánh giá quỹ gen; và (2) phát hiện các gen bán lùn mới bằng phương pháp đột biến. 6. Một số thành tựu của phương pháp chọn giống đột biến trên thế giới và ở Việt Nam Thành tựu chọn giống đột biến lúa trên thế giới Gần đây, theo số liệu của FAO/IAEA, tính đến 12/1997, trên toàn thế giới đã có 1847 giống đột biến, trong đó có 1357 giống cây trồng và 490 giống cây cảnh. Trong số 1357 giống cây trồng các loại thì riêng lúa có 333 giống, trong đó 67,6% được phát triển trực tiếp từ các thể đột biến và 32,4% qua lai tạo. Trong tốp 7 nước đứng đầu về số giống lúa đột biến, Việt Nam xếp thứ bảy (Maluszynski và cs, 1998). Thành tựu chọn giống đột biến lúa ở một số quốc gia tiêu biểu ở Trung Quốc và Đài Loan, hai giống lúa lùn đầu tiên được tạo ra ở Đài Loan năm 1957, một giống thông qua sử dụng trực tiếp thể đột biến là Shuang Chiang 30 - 21 và giống LH1 qua chọn giống lai giữa thể đột biến này với Taichung Native 1 (Hu, 1986). Trường hợp thành công nhất trong số các giống đột biến với tính chín sớm nhờ cải tiến là Yuangfen Zao, được phóng thích năm 1971. Từ năm 1985 đến nay, nó được xếp vào một trong số ba giống lớn nhất ở Trung Quốc, được trồng trên 1 triệu hecta dọc theo Dương Tử Giang (Ukai, 1997) Một giống chín sớm nổi tiếng khác là Zhefu 802 được trồng trên 1.400.000 ha năm 1989. Trung Quốc luôn là nước đứng đầu về số lượng các giống lúa và cây trồng đột biến. Ở Nhật Bản, các dòng đột biến Sakai 64 và Fukei 53 được tạo ra đầu
154 tiên trong các năm 1958 và 1959, sau đó là Sakai 65 và Fukei 54. Từ năm 1966, Futsuhara và cs cho phóng thích giống lúa đột biến đầu tiên ở Nhật là giống bán lùn Reimei bắt nguồn từ Fujiminori do chiếu xạ gamma. Giống nổi tiếng này được trồng ở miền Bắc, trên diện tích 1.410.000ha năm 1969. Hơn nữa, nó cũng được sử dụng làm bố mẹ rất thành công trong các chương trình chọn giống lai. Theo Sato (1982, 1983), trong số 9 giống được tạo ra bằng cách này, đáng kể nhất là giống Akihikari (=Reimei x Toyonisiki) được trồng tới 136.375 ha năm 1970, xếp hàng thứ tư về diện tích trồng trọt ở Nhật. Ấn Độ là quốc gia đứng hàng thứ nhì trong top 6 nước dẫn đầu về số lượng giống cây trồng đột biến, và hàng thứ ba về số lượng giống lúa đột biến. Mặc dù chưa có giống lúa đột biến nào đạt mức kỷ lục như Reimei, Zhefu 802... nhưng sự thành công trong chọn giống lúa đột biến và lai tạo giống năng suất cao ở nước này đạt được trong những năm 1970 đến nay rất to lớn. Gần đây, nhờ sự giúp đỡ tích cực của chương trình chọn giống đột biến từ IAEA, sự nghiên cứu cải tiến giống lúa ở nhiều quốc gia châu Á và Mỹ La tinh đã đạt được những tiến bộ đáng kể. Ơ nước ta, những nỗ lực nghiên cứu theo hướng này, theo các tác giả Lê Duy Thành và Trịnh Bá Hữu (1986), được bắt đầu từ 1966 ở Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay là Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc Gia Hà Nội) và sau đó mở rộng sang các đơn vị khác như: Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (nay là Viện Di truyền Nông nghiệp), Trường Đại học Sư phạm Hà Nội I, Viện Cây Lương thực và Thực phẩm, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa học - Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. Một số công trình khoa học có giá trị trong lĩnh vực này đã góp phần xác định tính quy luật của PSĐB ở giai đoạn tiền phôi, cơ chế phân tử của quá trình đột biến, hiệu quả của các tác nhân gây đột biến lên tần sốvà các phổ đột biến ở lúa cũng như nghên cứu và sử dụng PSĐB thực nghiệm trong chọn giống lúa. Kết quả là, cho đến nay đã có hàng chục giống cây trồng mới được tạo ra bằng phương pháp đột biến. Chẳng hạn, ở ngô có DT6 và DT8; ở đậu tương có M103, V48, DT84, DT90, DT95...; ở cây lạc có V79, 4329, DT322, DT329... Đối với cây lúa, bằng phương pháp gây đột biến, nhiều giống mới đã được tạo trong một thập kỷ qua. Chẳng hạn, bằng cách xử lý DMS các thể tái tổ hợp thu được từ các tổ hợp lai (Xuân số 2 x 2765) và (NN8 x Xuân số 2), GS.VS.Vũ Tuyên Hoàng và cs đã tạo ra các giống Xuân số 5 và Xuân số 6. Các giống này được phóng thích năm 1991 (Trần Đình Long,
155 chủ biên - 1997). Ở Viện Di truyền Nông nghiệp (DTNN), nhiều giống lúa mới được chọn trực tiếp từ các thể đột biến hoặc qua lai tạo. Chẳng hạn, bằng chiếu xạ tia γ vào hạt của giống lúa địa phương C4-63 đã tạo được các giống DT10 và DT11 có chiều cao 90-100cm, năng suất cao, chống đổ tốt, chịu rét. Các giống này được phóng thích năm 1990 và 1995 (Trần Duy Quý và cs, 2000). Sau đó, DT10 được dùng làm mẹ để lai với CR203 và kết quả là chọn tạo được giống DT13 (Bùi Huy Thuỷ và Trần Duy Quý, 1999). Bằng phương pháp chiếu xạ tia γ 20 krad, các giống DT33 và CM1 đã được tạo ra và phóng thích năm 1994 và 1999. Giống A20 được phóng thích năm 1993 là kết quả của xử lý NMU 0,015% và chọn giống lai giữa các thể đột biến thu được (H20 x H30). Giống này có đặc tính thấp cây, kháng rầy, chịu khô hạn và đất phèn. Nhờ sử dụng A20 làm mẹ trong chọn giống lai, Bùi Huy Thuỷ và Trần Duy Quý đã chọn được các giống có triển vọng DT16 và DT17. Kết hợp chiếu xạ tia γ và lai hữu tính, sau nhiều thế hệ chọn lọc, Nguyễn Văn Bích và Trần Duy Quý đã tạo được các giống nếp mới DT21 và DT22 cho năng suất cao, chất lượng tốt. Bằng chứng sinh động và hiệu quả của việc chiếu xạ tia γ 15 krad vào hạt nảy mầm ở thời điểm 69 giờ là sự biến mất tính cảm quang ở các giống lúa Tám thơm Hải Hậu, Tài nguyên đục và Tép Hành. Nhờ vậy, các thể đột biến tạo ra có thể trồng hai vụ trong năm. Cụ thể "Tám thơm đột biến" (giống quốc gia năm 2000) hoàn toàn mất cảm quang, có TGST ngắn hơn nhưng vẫn giữ được mùi thơm, chịu rét và cho năng suất tương đương giống gốc. Hơn nữa, giống này có khả năng thích ứng rộng (Nguyễn Minh Công và cs, 1999; Đỗ Hữu Ât và cs, 2000), "Tép hành đột biến" (giống quốc gia năm 1999) có nhiều ưu điểm như mất cảm quang, TGST và chiều cao cây đều rút ngắn gần 50% của giống gốc nhưng năng suất cao gấp đôi ... "Tài nguyên đột biến" (giống quốc gia năm 1997) có nhiều ưu điểm nổi bật so với Tài nguyên đục cũng được tạo ra bằng cách trên. Tóm lại, tình hình nghiên cứu và chọn giống đột biến lúa ở nước ta trong 10 năm qua đã đạt được những thành tựu to lớn. Việt Nam được IAEA/FAO xếp vào một trong bảy quốc gia đứng đầu thế giới về số lượng giống lúa đột biến và đứng thứ tư trong khu vực Châu á - Thái Bình Dương (sau Trung Quốc, Nhật Bản và ấn Độ), với 40 giống bao gồm: lúa- 27, ngô-2, lạc-2. đậu tương-5, cà chua-2 và táo-2 (Trần Duy Quý, 1997). Trong sự tiến bộ vượt bậc ấy, Viện DTNN đóng góp thật đáng kể, với 17 giống lúa và hơn 8 giống cây trồng khác được tạo ra bằng phương pháp đột biến. Với kết quả đó, từ 1995 đến nay, nước ta trở thành thành viên chính thức của Hiệp hội Chọn giống Đột biến ở Khu vực Châu Á mà Viện
156 DTNN là cơ quan đầu mối. Điều này khẳng định hướng đi đúng đắn và có hiệu quả trong lĩnh vực khoa học này. Tài liệu Tham khảo Tiếng Việt Nguyễn Văn Hiển (chủ biên, 2000): Chọn giống cây trồng. NXB Giáo Dục, Hà Nội. Trần Đình Long (chủ biên, 1997): Chọn giống cây trồng (Giáo trình cao học nông nghiệp). NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Trần Duy Quý (1997): Các phương pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp. Lê Duy Thành (2000): Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB KH & KT, Hà Nội. Tiếng Anh Chopra, V.L. (Ed., 1989): Plant Breeding: Theory and Practice. Oxford & IBH Publishing Co. PVT, Ltd. Falconer D.S. and Mackay T.F.C. (1996): Introduction to Quantitative Genetics. 4th edn. Longman Group, Harlow. Hayward MD, N.O. Bosemark, I. Ramagosa, Coordinating ed. M.C. Cerezo (1994): Plant Breeding: Principles and Prospects. 2nd ed. Chapman & Hall, Inc., London. Matsuo Y., Futsuhara F., Kikuchi F., Yamaguchi H. (Eds., 1997): Science of The Rice Plant, Volume Three: Genetics. FAPRC, Tokyo, Japan. Murray, D.R. (1991): Advanced Methods in Plant Breeding and Biotechnology. C-A-B International Publisher, London.
157 Chương 8 Lai Tế bào Soma I. Vấn đề lai ghép ở thực vật Lai ghép hay là lai dinh dưỡng từ lâu đã được thực hiện ở thực vật và có ý nghĩa trong thực tiễn trồng trọt các cây ăn trái, cây cảnh …Lai dinh dưỡng bằng ghép là lai soma, nhưng thực chất thì cây lai dinh dưỡng là một loại cơ thể khảm vừa mang các tế bào và mô của gốc ghép và cành ghép. Giữa các tế bào của mô gốc ghép và cành ghép có thể có sự trao đổi thông tin điều chỉnh sự trao đổi chất tạo cho cành ghép có một số tính chất của gốc ghép, nhưng không xảy ra sự hợp nhân. Vì vậy các tính trạng trung gian chỉ có ở thế hệ cành ghép, khi đem gieo các hạt của cành ghép thì thế hệ sau không còn có tính trạng trung gian vì hạt được hình thành từ hệ gene của cành ghép. Khác với tế bào động vật, tế bào thực vật có thành tế bào là lớp bao ngoài cùng. Thành tế bào gồm cellulose, hemicellulose và pectin. Nếu thành tế bào bị tách bỏ, tế bào thực vật chỉ còn lớp màng sinh chất bọc ngoài gọi là tế bào trần hay protoplast. Khi các protoplast tiếp xúc nhau thì chúng có thể hợp nhất lại làm một. Vì tế bào thực vật có thành tế bào, nên trước đây trong môt thời gian dài,người ta cho rằng kỹ thuật dung hợp protoplast chỉ giới hạn ở các tế bào động vật. Mãi cho đến năm 1960, sau những nghiên cứu thành công của Cocking với việc dung một hỗn hợp các enzyme để tách bỏ thành tế bào thực vật, thì kỹ thuật dung hợp protoplast mới được áp dụng ở thực vật. Tuy nhiên, nó chỉ thực sự phát triển mạnh mẽ và có xu hướng được ứng dụng trong chọn giống chỉ sau khi các kết quả nghiên cứu về việc tái sinh hoàn chỉnh cây thuốc lá từ protoplast của Takebe (1971) và việc tái sinh cây thuốc lá lai do dung hợp protoplast giữa 2 loài N. tabacum và N. langsdorffi của Carlson (1972). II. Đại cương về lai tế bào soma và công nghệ tế bào thực vật Tế bào thực vật khác biệt với tế bào động vật về nhiều đặc tính trong đó có đặc tính là tế bào thực vật có thành cellulose bao quanh (cell wall) sau đó đến màng nguyên sinh (membrane). Thành cellulose giữ cho tế bào thực vật có hình dáng nhất định, còn các hợp chất pectin nằm trong thành có nhiệm vụ liên kết gắn các tế bào với nhau thành mô. Màng nguyên sinh cho phép protoplast có thể hấp thu vào tế bào các đại phân tử (acid nucleic, protein) thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể. Nếu để các
158 protoplast cạnh nhau, chúng có thể hòa làm một, đó là hiện tượng dung hợp tế bào. Nếu các protoplast có nguồn gốc từ các tế bào soma thuộc các giống, loài hoặc chi dung hợp lại thì có thể dẫn đến hiện tượng lai tế bào soma. Sự ra đời của kỹ thuật protoplast cho phép tạo ra những tái tổ hợp di truyền giữa các đơn vị phân loại xa (loài hay chi) mà mà bằng phương pháp lai hữu tính khó hoặc không thể đạt được. Trong quá trình dung hợp, bên cạnh sự kết hợp của các genome nhân, còn có thể xảy ra sự hợp nhất tế bào chất giữa các protoplast. Nhờ vậy, một số tính trạng do các gene trong tế bào chất kiểm soát như tính bất thu, có thể chuyển từ cây này sang cây khác nhờ kỹ thuật này. III. Phương pháp tạo tế bào trần Có một số phương pháp phân lập protoplast sau đây: 1. Phương pháp cơ học Cho miếng mô vào dung dịch ưu trương để khối tế bào chất cùng màng sinh chất tách khỏi vỏ cellulose. sử dụng kim nhọn và dao phẩu tích để cắt các mô cùng lớp vỏ, sau đó ngâm vào môi trường nuôi cấy pha loãng, tế bào chất sẽ phồng to và tách khỏi vỏ cellulose ra ngoài, tạo thành các protoplast tự do. Phương pháp này cho hiệu suất thấp. Sự phân lập protoplast của thực vật bậc cao bằng phương pháp cơ học được Klercker tiến hành đầu tiên vào năm 1892. Nói chung, các protoplast được phân lập từ các tế bào không bào hóa cao của các mô dự trữ như chồi hành (bulbs) và vảy hành (scales) của các loài thân hành, rễ củ cải, vỏ quả giữa của dưa chuột và rễ củ cải đường. 2. Phương pháp sử dụng enzyme Phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp cơ học. Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast. Do vách tế bào có thành phần gồm pectin, cellulose, hemicellulose, nên sử dụng enzyme pectinase, cellulase, hemicellulase để phân hủy lớp vỏ tạo tế bào trần. Tùy theo loại mô và cây được sử dụng, người ta thay đổi nồng độ enzyme thích hợp. Protoplast thực chất là tế bào trần không có thành nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây (lá, rễ, hạt phấn …), callus, tế bào đơn,… Để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy, phải bổ sung những chất tăng áp lực vào dung dịch enzyme để duy trì thẩm thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài.
159 Hình 8.1. Protoplast thuốc lá IV. Liên kết và dung hợp tế bào trần 1. Dung hợp protoplast và lai vô tính tế bào thực vật 1.1. Xử lý bằng NaNO3 Năm 1970, Power và cs. Đã dung NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast. Carlson và cs. (1972) cũng dung phương pháp này để sản xuất cây lai đầu tiên (Nicotiana glance × N. langsdorffii). Tuy nhiên phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hoá mạnh như protoplast từ nhu mô lá. 1.2. Xử lý bằng PEG Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylene glycol). Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (
160 (1981) cũng đã chứng minh rằng các protoplast có thể dung hợp bằng điện trường và đưa ra một protocol có thể sử dụng rộng rãi. Quá trình dung hợp bao gồm hai bước: Đầu tiên các protoplast được đưa vào một ngăn dung hợp nhỏ có 2 dây kim loại song song với nhau đóng vai trò là các điện cực. Tiếp theo, sử dụng điện áp thấp và trường AC dao động nhanh, kích thích các protoplast sắp xếp thành chuỗi tế bào giữa các điện cực. Phương pháp này cho phép tế bào tiếp xúc hoàn toàn với nhau trong một vài phút. Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh, quá trình dung hợp được thực hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao. Xung DC điện áp cao tạo ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất ở vị trí tiếp xúc của các tế bào, tạo ra sự dung hợp và tái tổ chức lại màng một cách hợp lý. Quá trình bắt đầu từ lúc đưa các protoplast vào bên trong ngăn và chuyển chúng lên môi trường nuôi cấy, có thể được hoàn chỉnh trong 5 phút hoặc ít hơn. Các thể dị nhân hình thành nhờ dung hợp bằng điện đã phân chia trong môi trường nuôi cấy và có khả năng tái sinh chồi hoặc cây lai soma. Hình 8.2 Dung hợp protoplast và cytoplast
161 Hình 8.3 Dung hợp tế bào V. Nuôi cấy tế bào lai và tái sinh cây 1. Nuôi cấy protoplast 1.1. Thành phần dinh dưỡng Môi trường nuôi cấy protoplast tương tự với môi trường nuôi cấy dịch huyền phù và callus. Tuy nhiên, nồng độ của Fe, Zn và ammonium dùng trong môi trường nuôi cấy mô ở thực vật có thể là quá cao đối với nuôi cấy protoplast. Hầu hết muối của môi trường B5 (Gamborg và cs, 1968) và MS (Murashige và Skoog, 1962) cải biến một ít là thích hợp. Tăng nồng độ Ca trong môi trường nuôi cấy protoplast từ 2-4 lần so với bình thường là có lợi cho việc duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào (Torres 1989). Nồng độ sucrose thích hợp thường từ 3-5%, ở một số loài như thuốc lá, sucrose được sử dụng ở nồng độ thấp hơn chỉ khoảng 1,5%. Các vitamin dùng trong nuôi cấy protoplast cũng giống như trong môi trường nuôi cấy mô tiêu chuẩn. Auxin và cytokinin sử dụng ở các tổ hợp nồng độ khác nhau để cảm ứng tạo vách tế bào và kích thích phân chia các protoplast phân lập. Protoplast ngũ cốc đòi hỏi cung cấp 2,4-D riêng rẽ hoặc tốt hơn là phải phối hợp với cytokinin. Tuy nhiên 2,4-D cũng như các auxin khác (NAAA, IAA) được sử dụng riêng rẽ thường làm mất tiềm năng phát sinh hình thái ở các callus có nguồn gốc protoplast. Các cytokinin thường được sử dụng là BAP, kinetin, 2-iP hoặc zeatin. Mặc dù tổ hợp hai loại hormone trên thay đổi tùy từng loài, nhưng nói chung trong nuôi cấy protoplast thì tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho phân chia tế bào, trong khi các protoplast có nguồn gốc từ những tế bào phân hóa cao
162 lại cần tỷ lệ kinetin/auxin cao để tái sinh cây. 1.2 . Áp lực thẩm thấu của môi trường Trong quá trình phân lập và nuôi cấy, các protoplast cần được duy trì cân bằng áp lực thẩm thấu giữa môi trường và nội bào cho tới khi tái sinh được vách tế bào vững chắc. Trong cả hai trường hợp chênh lệch áp lực thẩm thấu giữa môi trường và nội bào theo hướng môi trường nhược trương hoặc ưu trương sẽ dẫn đến tình trạng protoplast bị vỡ hoặc teo lại. Các chất điều chỉnh áp lực thẩm thấu (thông thường là để tăng áp lực thẩm thấu) trong môi trường nuôi cấy protoplast và trong hỗn hợp enzyme là sorbitol, mannitol, glucose, hoặc sucrose. Các protoplast sẽ sinh trưởng ổn định hơn trong trong dịch được tăng nhẹ áp lực thẩm thấu. Đối với các protoplast thịt lá của ở ngũ cốc và đậu thì mannitol hoặc sorbitol là các nhân tố ổn định áp lực thẩm thấu thích hợp hơn cả, trong khi sucrose lại thích hợp hơn glucose hoặc mannitol trong nuôi cấy protoplast của khoai tây, đậu hoa (sweet pea), tước mạch (brome grass) và sắn. Trong nuôi cấy dịch huyền phù thuốc lá, galactose và fructose đã được sử dụng để điều chỉnh áp lực thẩm thấu. Các chất phân ly ion (KCl 335 mmol/L và MgSO4.7H2O 40 mmol/L) cải thiện tốt khả năng sống sót của protoplast. Thông thường các dung dịch enzyme được bổ sung các muối nhất định (CaCl2 5-100 mmol/L) song song với các nhân tố ổn định thẩm thấu không phân ly ion. Cocking và Peberdy (1974) đã phát triển dung dịch rửa protoplast (cell-protoplast washing, CPW) chứa muối và các nhân tố ổn định thẩm thấu thích hợp. Dung dịch CPW có thể được dùng trong suốt quá trình ủ enzyme và rửa protoplast. Thời gian ủ enzyme tùy thuộc vào nồng độ của nó trong dung dịch và loại nguyên liệu được sử dụng. 1.3 . Mật độ dàn trải protoplast Mật độ protoplast tối ưu là từ 1 × 104 đến 1 × 105/mL. Tuy nhiên, các thí nghiệm lai soma (somatic hybridization) và phát sinh đột biến (mutagenesis) cần tạo dòng tế bào riêng rẽ, do đó phải dàn trải protoplast ở mật độ thấp hơn (100-500 protoplast/mL). Nuôi cấy ở mật độ thấp giúp dễ dàng phân lập và xác định các khuẩn lạc lai khi có mặt của hệ thống chọn lọc. Kao và Michayluk (1975) đã xây dựng môi trường nuôi cấy protoplast (KM 8p) (Bảng 6.2) trong đó các protoplast được nuôi cấy riêng rẽ (ví dụ: Vicia hajastana) có khả năng phân chia cho tới khi tạo thành callus. Môi trường này còn kích thích phân chia nhanh hơn ở các protoplast thịt lá của cỏ linh lăng (alfalfa), đậu (pea), khoai tây, và sản phẩm dung hợp khai tây + cà chua ( potato + tomato ) được nuôi cấy dàn trải ở mật độ thấp. Các protoplast nuôi cấy trên môi trường này được đặt trong tối vì môi trường
163 1.3.1. Kỹ thuật tầng nuôi dưỡng Một hướng khác trong nuôi cấy protoplast ở mật độ thấp là kỹ thuật tầng nuôi dưỡng (feeder layer technique). Raveh và cs (1973) đã chuẫn bị tầng tế bào nuôi dưỡng bằng cách chiếu xạ tia X (2 × 103 R) lên các protoplast dịch huyền phù tế bào của thuốc lá, khi đó sự phân chia của tế bào bị ức chế nhưng vẫn cho phép chúng duy trì các hoạt động trao đổi chất. Các protoplast bị chiếu xạ sẽ được rửa sạch ba lần và sau đó dàn trải chúng trên môi trường có agar mềm (soft agar) ở mật độ 2,4 × 104/mL. Nuôi cấy trải (plating) các protoplast không qua chiếu xạ ở mật độ thấp (10-100 protoplast/mL) trên tầng nuôi dưỡng này. 1.3.2. Đồng nuôi cấy các protoplast Các protoplast của 2 loài khác nhau được nuôi cấy chung (co-culture) để kích thích sự sinh trưởng của chúng hoặc của tế bào lai. Nói chung, phương pháp đồng nuôi cấy được sử dụng trong những thí nghiệm mà các callus hình thành từ 2 loại protoplast có thể phân biệt hình thái được. Ví dụ: Các tế bào lai phân lập một cách cơ học (mechanically isolated hybrid cells) được nuôi cấy cùng với các protoplast phân lập từ chủng bạch tạng (albino strain) sẽ phát triển thành các khuẩn lạc màu xanh là loại khuẩn lạc dễ phân biệt với các khuẩn lạc không có màu xanh của chủng bạch tạng. 1.3.3. Nuôi cấy vi giọt Kỹ thuật nuôi cấy vi giọt (microdrop culture) đã thành công ở trường hợp nuôi cấy các tế bào lai của Thuốc lá + đậu tương ( Nicotiana glauca + Glycine max ) và Arabidopsis thaliana + Brassica campestris. Kỹ thuật này cần đĩa nuôi cấy Cuprak được thiết kế đặc biệt gồm có một ngăn bên ngoài nhỏ và một ngăn bên trong lớn hơn. Các protoplast riêng rẽ hoặc các thể dị nhân trong giọt môi trường dinh dưỡng (khoảng 0,25-25 µL) được chuyển bằng pipette Drummond vào mỗi ngăn bên trong của đĩa Cuprak. Ngăn bên ngoài chứa đầy nước vô trùng để duy trì độ ẩm bên trong đĩa. Sau khi đậy nắp, đĩa được quấn giấy parafilm, giữ ở điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tối thích. Tỷ lệ tế bào/dung tích môi trường nuôi cấy thích hợp tương đương mật độ 2-4 × 103/mL. Nếu tăng kích thước giọt (~ 25 µL), tức là giảm mật độ dàn trải sẽ cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn. 2. Tái sinh cây từ protoplast 2.1. . Tạo vách tế bào Quá trình hình thành vách tế bào có thể hoàn chỉnh trong vòng hai đến một vài ngày mặc dù các protoplast trong nuôi cấy thường bắt đầu tái sinh vách tế bào ngay sau khi phân lập một vài giờ. Vách tế bào được tạo thành
164 2.2 . Phát triển callus/cây hoàn chỉnh Ngay sau khi tạo vách tế bào chung quanh protoplast, các tế bào được tái cấu trúc đã tăng kích thước và sau một tuần xuất hiện sự phân chia tế bào đầu tiên. Sau 2-3 tuần, các khuẩn lạc tế bào có kích thước lớn (macroscopic) được tạo thành và có thể cấy chuyển chúng lên môi trường không có sự điều chỉnh áp lực thẩm thấu (osmotic-free) để phát triển callus. Các callus này được cảm ứng để phân hóa cơ quan, hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh. Hình 8.4 Protoplast sau khi dung hợp được tái sinh (màu sáng) Kể từ khi các loài thuộc họ Solanaceae được phân lập và tái sinh cây thành công đầu tiên ở cây thuốc lá (Takebe 1971), đến nay người ta đã thành công ở nhiều họ khác nhau như các loài legume, các cây trồng ăn quả và lấy sợi (fibre and pulp crops), các loài cây gỗ, và thậm chí các loài ngũ cốc như Pennisetum, lúa và lúa mì. VI. Chọn lọc các tế bào lai và xác định các dòng tế bào lai và callus 1. Chọn lọc các thể lai soma 1.1. Phương pháp mẫn cảm với dược phẩm Power và cs. (1976) ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của protoplast phân lập từ Petunia parodii và P. hybrida đối với actinomy cin D. Trên môi trường MS (Murashige Skoog, 1962), các protoplast tế bào thịt lá của P. hybrida phát triển mạnh tạo thành khối callus lớn, trong khi P. parodii các protoplast tạo thành khuẩn lạc bé. Bổ sung actinomycine D vào môi trường nuôi cấy có hiệu quả đối với khả năng tái sinh của protoplast P. paraodii, nhưng ở hybrida các protoplast lại mất khả năng phân chia
165 Mặc dù môi trường nuôi có bổ sung dược phẩm, các thể dị nhân vẫn có thể sinh trưởng và sau cùng phân hóa thành các cây lai soma. 1.2. Các đột biến khuyết dưỡng Chọn lọc các thể lai soma nhờ sự bổ sung di truyền của các đột biến khuyết dưỡng. Phương pháp này chỉ thích hợp khi các dòng lai mong muốn sống sót trên môi trường tối thiểu. Mặc dù phương pháp này ứng dụng cho thực vật bậc cao có một số khó khăn, nhưng Glimelius và cs (1978) đã thành công trong việc chọn lọc một số lượng lớn các thể lai soma bằng cách sử dụng các protoplast khuyết tật enzyme nitrate reductase và các dòng đột biến thuốc lá kháng chlorate. Các protoplast của hai đột biến khác nhau này đã được dung hợp và nuôi cấy trên môi trường chứa nitrate. Trong thí nghiệm đối chứng, các protoplast bố mẹ không sinh trưởng khi có mặt nitrate trong khi các sản phẩm dung hợp đã tái sinh cây 1.3. Chọn lọc bổ sung di truyền Dùng phương thức chọn lọc bằng mắt để phân lập các tế bào lai phát triển trên môi trường nuôi cấy có thành phần gây mẫn cảm đối với các protoplast bố mẹ. Trong nghiên cứu của Cocking (1977), khi dung hợp protoplast giữa dạng hoang dại của Petunia parodii với protoplast bạch tạng albino phân lập từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của P. hybrida, P. inflata và P. parviflora trong các thí nghiệm riêng rẽ. Trong tất cả các tổ hợp này, protoplast màu xanh của parodii bị đào thải ở giai đoạn khuẩn lạc có kích thước nhỏ, trong khi các protoplast của các loại bố mẹ khác lại phát triển thành các khuẩn lạc không màu. Trong khi đó, các thể lai sinh sản thành các callus màu xanh và sau đó thành cây lai soma. Phương pháp này cũng dùng để lai soma khác loài ở các chi Daucus, Datura và các chi khác. Hiện tượng bổ sung di truyền trong quá trình dinh dưỡng được dùng rộng rãi và có hiệu quả để nhận biết các sản phẩm dung hợp, như sử dụng các đột biến bạch tạng hay thiếu hụt diệp lục, các gen đánh dấu có liên quan đến tính kháng các chất kháng sinh (Hamil, 1984) hoặc kháng chất diệt cỏ (Evola, 1983). Có trường hợp, khi được nuôi cấy trong môi trường thiếu hormon ngoại sinh thì các tế bào lai có khả năng cho callus và tái sinh cây, còn các tế bào của từng dạng bố mẹ lại không có khả năng ấy (Power, 1977; Shenck, 1982). 1.4. Sử dụng các đột biến bach tạng có các gene không allele cho chọn lọc bổ sung di truyền. Melchers và Labib (1974) đã tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng
166 protoplast của hai giống thuốc lá Nicotiana tabacum: giống s (sublathal) không tổng hợp được diệp lục bình thường nên rất mẫn cảm với ánh sáng cường độ cao. Giống v (virescent) cũng không tạo được lục lạp bình thường, lá non trắng hoàn toàn và mẫn cảm với ánh sáng cường độ cao. Hai giống này là hai dạng đột biến có thể bổ sung cho nhau khi lai tạo, nghĩa là nuôi cấy ở ánh sáng 800 lux cho tới giai đoạn ra hoa, sau đó thụ phấn chéo sẽ được cây lai F1 có lá xanh bình thường và chịu ánh sáng cao. 2. Chọn lọc tế bào lai Bình thường các tế bào lai được tạo thành trong quá trình dung hợp protoplast từ hai loài xa nhau về quan hệ họ hàng. Cây tái sinh từ tế bào lai như thế sẽ có hệ gene lục lạp (plastome) từ cả hai loài bố mẹ, nhưng hệ gene chức năng chỉ của một loài do có sự đào thải một bộ nhiễm sắc thể. Vì thế, cây có nguồn gốc từ những cây tái sinh đó sẽ là thể lai di truyền chỉ cho các tính trạng tế bào chất. Để chuyển gene tế bào chất một cách hiệu quả, các tế bào của loài cho tế bào chất sẽ được chiếu xạ. Chiếu xạ bằng tia X hoặc γ từ 50-300 Gy có hiệu quả từng phần hoặc bất hoạt hoàn toàn các tế bào cho. Xử lý theo phương thức này ngăn chặn hoàn toàn sự phân chia của các tế bào không dung hợp và có vai trò như một nhân tố chọn lọc để sàng lọc các tế bào lai. Phương thức dung hợp dùng tia γ được ứng dụng thành công trong lai khác loài, khác chi ở cả hai mức độ nhân và cơ quan tử (Nigrutin và cs, 1989). Tác động qua lại giữa nhân và tế bào chất có thể xuất hiện ngay cả trong những sản phẩm dung hợp dùng tia γ khi chúng được xuất phát từ những protoplast thuộc những loài hữu tính không tương hợp nhau. Sự phân chia ở các sản phẩm dung hợp và các tế bào tiếp theo sau sẽ làm tăng khuẩn lạc tế bào mà ở đó sự đào thải không định hướng nhiễm sắc thể đã xuất hiện từ phần cho. Tuy nhiên, giới hạn đào thải phụ thuộc vào hệ gene cho và các điều kiện nuôi cấy xác định. 3. Con lai do sự dung hợp nhân Nhiều dạng con lai soma do kết quả của sự hợp nhất nhân (nuclear hybrid) đã được tạo ra giữa loài cây trồng với loài hoang dại ở chi cải dầu. Ví dụ lai giữa loài B. nigra chứa 1 bộ gene (B) với loài B. napus chứa 2 bộ gene (AC). Bằng phương pháp dung hợp protoplast giữa hai loài này đã tạo ra dạng con lai chứa 3 bộ gene (ABC) Khi dung hợp protoplast giữa Eruca sativa với B. napus người ta đã chuyển được gene kháng côn trùng và chịu khô có ở Eruca vào con lai. Ở khoai tây (Solanum tuberosum), khả năng ứng dụng kỹ thuật dung hợp protoplast là rất lớn. Khi dung hợp protoplast giuwz S. tuberosum
167 (4n) với loài S. brevidens (2n) không cho củ, người ta đã thu được dạng con lai khác loài (6n) cho củ, hữu thụ và có khả năng lai được với S. tuberosum. Con lai này nhận được các gene quý từ loài hoang dại là gene kháng virus gây bệnh xoắn lá ở khoai tây trồng và gene kháng bệnh vi khuẩn ở củ. Cần lưu ý, mặc dù sự dung hợp protoplast giữa các cây thuộc các loài, thậm chí các chi khác nhau xảy ra bình thường nhưng việc tái sinh cây có thể không xảy ra hoặc con lai có sức sống thấp hoặc bất thụ. Trong nhiều trường hợp, gần như toàn bộ hoặc một phần nhiễm sắc thể của một trong hai dạng bố mẹ bị mất đi.. Con lai chỉ nhận được một số nhiễm sắc thể hay một đoạn nhiễm sắc thể của một trong hai dạng bố mẹ, nhưng chúng lại chứa những gene có ích cho mực đích chọn giống. 4. Con lai do sự dung hợp tế bào chất Ty lạp thể chứa bộ gene tương đối nhỏ so với hệ gene trong nhân. Chúng chứa lượng DNA mã hóa cho khoảng 10% polypeptid đảm bảo cho chức năng của các cơ quan tử, 90% còn lại là do các gene nhân mã hóa và được chuyển qua màng của các cơ quan tử. các cơ quan tử được phân bố một cách ngẫu nhiên vào các tế bào con qua các thế hệ tế bào. Trong sinh sản hữu tính, các cơ quan tử gần như chỉ được chuyển qua giao tử cái. Trong khi đó nhờ sự dung hợp protoplast, có hiện tượng đóng góp như nhau của các cơ quan tử có trong tế bào chất từ hai dạng bố mẹ. Sản phẩm dung hợp có thể chứa nhân, ty thể và lạp thể từ cả hai dạng bố mẹ. Nhưng nó cũng có thể chứa nhân của một dạng bố mẹ còn tế bào chất thì lại của cả hai. Dạng con lai như vậy có tên là con lai tế bào chất hay cybrid VI. Ưu thế của lai soma và một số thành tựu của kỹ thuật này trên thế giới và ở Việt Nam Trong hơn hai thập kỷ qua, người ta đã đạt được nhiều tiến bộ trong kỹ thuật dung hợp protoplast, từ việc tách, dung hợp protoplast đến tái sinh cây ở nhiều loài cây trồng. Dung hợp protoplast là con đường hiệu quả để khắc phục nhiều khó khăn gặp phải trong quá trình lai hữu tính khác loài hoặc khác chi. Kỹ thuật này cũng cho phép tạo ra những thể tái tổ hợp gene ở những loài đa bội hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính phát triển kém. Một số thành tựu của việc ứng dụng kỹ thuật dung hợp protoplast đối với việc cải tiến giống cây trồng: - Ở chi cải Brassica, nhờ dung hợp protoplast, đã tổng hợp được loài Brassica napus từ hai loài B. oleracea và B. campestris. - Ở thuốc lá, loài Nicotiana tabacum dễ lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh
168 đốm lửa và nấm đen, trong khi đó loài N. rustica chống được các bệnh trên. Con lai hữu tính giữa hai loài này bất thụ, nhưng con lai soma giữa chúng lại hữu thụ và có khả năng kháng các bệnh trên. - Ở các cây họ cà, nhờ kỹ thuật dung hợp protoplast người ta đã tạo ra được con lai giữa khoai tây với các loài khác của chi Solanum có tính kháng bệnh cao, vốn không lai được với nhau bằng phương pháp hữu tính. - Ở cây họ đậu, bằng kỹ thuật dung hợp protoplast người ta đã tạo ra được con lai soma giữa cỏ ba lá (Trifolium repens) với cây Medi (Medicagosativa) và sử dụng chúng trong việc sản xuất chất tanin từ lá. Tương tự như vậy, con lai soma giữa đậu tương trồng với các loài hoang dại, như giữa Glycine max với G. tomentella, cũng đã được tạo ra. - Ở cây lúa, trong chương trình hợp tác giữa IRRI với Trường Đại học Nottingham, nhờ sử dụng kỹ thuật protoplast người ta đã tạo được một số giống lúa có tính bất dục tế bào chất nhưng lại có khả năng chống chịu sâu bệnh và nhiệt độ thấp. Riêng đối với lúa mì, mặc dầu người ta đã bỏ ra nhiều công sức nhưng cho đến nay những kết quả thu được trong lĩnh vực này còn rất hạn chế. Câu hỏi ôn tập 1. Nêu các phương pháp phân lập protoplast. 2. Hãy cho biết các ưu điểm của phương pháp dung hợp protoplast bằng điện. 3. Trình bày các giai đoạn của quá trình tái sinh cây từ protoplast. 4. Hãy nêu các phương pháp được sử dụng trong chọn lọc các thể lai soma. 5. Hãy cho biết một số thành tự về kỹ thuật dung hợp protoplast. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Như Hiền. 2002. Di truyền và công nghệ tế bào soma. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 2. Trần Đình Long. 1997. Chọn giống cây trồng. NXB Nông nghiệp. 3. Nguyễn Hoàng Lộc. 1998. Bài giảng nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Đại học Khoa học Huế. 4. Lê Duy Thành. 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa học và Kỹ thuật.
177 Chương 9 Kỹ thuật Di truyền trong Chọn giống Thực vật I. Mở đầu bào thực vật là biến nạp và biểu hiện các gene ngoại lai trong tế bào thực vật. Biến nạp của các tế bào vi khuẩn được thự . Tuy nhiên, việc cải biến di truyền ở thực vật bậc cao bằng cách đưa DNA ngoại lai vào trong các tế bào của chúng là một quá trình rất phức tạp. Sử dụng enzyme hạn chế (restriction endonucleases) để cắt phân tử DNA sợi đôi thành những đoạn nhỏ riêng rẽ, phát triển kỹ thuật lai DNA-DNA và các gene chỉ thị (marker genes) cho phép chọn lọc các tế bào , động vật và thực vật bậc cao. Những nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin di truyền mới được biến nạp vào các thực vật eukaryote biểu hiện không chỉ ở mức độ tế bào và sau đó mức độ cơ thể hoàn chỉnh mà còn có thể truyền lại cho các thế hệ sau của chúng. Ý nghĩa thực tiễn của quá trình biến nạp là tạo ra những tính trạng mới hoặc cải tiến những tính trạng đã có. Về một số phương diện nào đó, kỹ thuật này có ưu điểm hơn so với phương pháp chọn giống bằng lai hữu tính. Nếu ở phương pháp lai hữu tính, để chuyển được một gene hay một số gene từ một giống này, qua một giống khác người ta phải tiến hành một quy trình lai trở lại tốn rất nhiều thời gian và công sức. Trong khi đó kỹ thuật chuyển gene không những cho phép vượt qua được những trở ngại do sự xa cách về quan hệ họ hàng giữa thể cho gene và nhận gene mà còn cho phép cây trồng tiếp nhận một cách nhanh chóng những gene mới do con người thiết kế. Có thể thực hiện được điều này bằng cách sử dụng các hệ thống vector sinh học, nhưng không phải đều có thể thực hiện được với bất kỳ cây trồng nào. Việc tái sinh các cây được chuyển gene chủ yếu phụ thuộc vào các tế bào soma có tính toàn thể, mà không phải là tế bào soma nào cũng có khả năng đó. Thành tựu nổi bậc của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là tái sinh được cây biến nạp gene đầu tiên vào đầu thập niên 1980. Đến nay, các kỹ thuật phân tử đã được ứng dụng thành công ở nhiều loài khác nhau. Lúc đầu người ta sử dụng các gene chỉ thị để biến nạp, nhưng nay đã thay thế bằng các gene quan trọng có giá trị kinh tế.nhằm mục đích cải thiện phẩm chất cây trồng. Hai nhân tố then chốt thúc đẩy sự phát triển của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là: các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ những tế bào biến nạp và các phương pháp đưa DNA ngoại lai vào các
178 loài thực vật khác nhau. Muốn chuyển một gene thành công cần phải chứng minh hiệu quả của phương pháp biến nạp gene, nhưng đôi khi các loài nghiên cứu hoặc không thể tái sinh được cây từ các mô không phân hoá, hoặc có thể tái sinh nhưng sau đó khó phát triển thành cây hoàn chỉnh. Do đó hai nhân tố nói trên thường được nghiên cứu phát triển song song. Các chỉ thị biến nạp gene đầu tiên đã sử dụng Agrobacterium tumefaciens để đưa vào cây thuốc lá các gene kháng kháng sinh. Agrobacterium là vật truyền hữu hiệu để đưa các DNA ngoại lai vào trong các loài thuộc họ Solanaceae, nhưng ở một số cây trồng khác quan trọng hơn, việc sử dụng nó còn gặp nhiều hạn chế. Trở ngại lớn nhất là tính đặc trưng vật chủ của Agrobacterium, mặc dù những tiến bộ gần đây đã cho phép ứng dụng thành công trên một số giống cây trồng. Sự phát triển của các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ callus và protoplast đã mở ra một hướng mới cho công nghệ di truyền thực vật thông qua các phương pháp biến nạp gene trực tiếp. Nhờ sự phát triển của phương pháp bắn gene (particle bombardment) dựa trên cơ sở tăng gia tốc của các hạt kim loại nặng mang nguyên liệu di truyền vào trong mô thực vật. Việc biến nạp ở các loài cây trồng gặp nhiều thuận lợi hơn. Các phương pháp biến nạp khác cũng có hiệu quả đối với các trường hợp đặc biệt, nhưng khả năng ứng dụng rộng rãi của chúng bị hạn chế. Chẳng hạn các phương pháp biến nạp gene bằng xung điện (electroporation) vào các mô được cắt nhỏ từng phần, phương pháp xử lý hoá học bằng PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection) đưa DNA ngoại lai trực tiếp vào tế bào, phương pháp dùng silicon carbide lắc với tế bào có tác dụng như các mũi kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào, phương pháp biến nạp gene qua ống phấn.... Kể từ khi tạo được cây chuyển gene đầu tiên, đến nay kỹ thuật này đã có những bước tiến rất lớn. Những thành công của nó không chỉ giới hạn ở những cây mang tính chất mô hình như thuốc lá và các cây họ cà, mf còn đạt được những kết quả ứng dụng ở một số cây trồng quan trọng. Vì thế chúng ta có cơ sở để hy vọng rằng trong tương lai kỹ thuật gene sẽ trở thành một công cụ hỗ trợ không thể thiếu được của chọn giống thực vật. II. Kỹ thuật chuyển gene 1. Những nguyên tắc chung của kỹ thuật chuyển gene Có một số yếu tố sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gene. Không phải tất cả các tế bào trong cơ thể đều có tính toàn thể, các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gene lạ. Một loại cây nào đó có thể được biến nạp khi nó có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Mô tế bào là một tập hợp của nhiều tế bào có phản ứng khác nhau khi gặp một yếu tố tác động đến. Một số ít tế bào trong cây có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Những tế bào
179 khác chỉ có một trong hai khả năng ấy. Một số lớn các tế bào trong cơ thể có khả năng điều chỉnh được khả năng đó, một số khác ngược lại không thể làm được. Tương quan giữa các quần thể tế bào kiểu như vậy phụ thuộc vào loài, kiểu gene, cơ quan, thậm chí tùy từng vùng trong một cơ quan. Một trong các cơ chế có thể chuyển các tế bào từ trạng thái tiềm ẩn sang trạng thái thực sự có khả năng tái sinh là sự xuất hiện thương tổn trên cơ thể. Phản ứng với sự thương tổn có lẽ là cơ sở sinh học cho sự tăng sinh và tái sinh của các tế bào soma. Tuy nhiên phản ứng này khác nhau giữa các loài cây, cũng như giữa các nhóm tế bào trong cùng một cây. Nói chung các cây hòa thảo và các cây họ đậu phản ứng này xảy ra rất yếu. Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA. Vì thế gene chỉ có thể được đưa vào tế bào thông qua Agrobacterium, virus, bằng phương pháp vi tiêm hay bằng súng bắn gene. Việc chuyển gene chỉ thành công khi đưa được gene vào nhóm tế bào có khả năng tái sinh và tiếp nhận gene lạ. Tuy nhiên, khả năng biến nạp không có liên quan chặt chẽ với khả năng biểu hiện của gene được biến nạp. DNA không phải của virus có thể liên kết với hệ gene của vật chủ và không di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác. Trong khi đó các DNA của virus có thể không liên kết với hệ gene của vật chủ, thậm chí cả khi có rất nhiều bản sao trong tế bào chủ. DNA, RNA của virus di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và có thể lan truyền khắp trong cây trừ vùng mô phân sinh. - Phản ứng của các loại tế bào thực vật với quá trình chuyển gene Mục đích chính của một quy trình chuyển gene là đưa một cách ổn định một đoạn DNA vào hệ gene nhân của các tế bào có khả năng phát triển thành một cây biến nạp. Ở nhiều loài thực vật, sự xác định kiểu tế bào nào trong cây có khả năng tiếp nhận sự biến nạp là điều khó khăn. Hạt phấn hay tế bào trứng sau khi được biến nạp có thể được dùng để tạo ra cây biến nạp hoàn toàn thông qua quá trình thụ tinh bình thường. Hạt phấn thường được coi là đối tượng lý tưởng để gây biến nạp. Trong khi đó, việc biến nạp gene vào hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn. Trong trường hợp này, thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi. Việc biến nạp đối với các tế bào đơn của các mô phức tạp như phôi hay mô phân sinh thường cho ra những cây khảm. Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi. Các chồi bất định hay các phôi được hình thành từ các tế bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh. 2. Các phương pháp chuyển gene ở cây trồng Khi sử dụng nấm men, nấm, động vật hoặc thực vật như là vật chủ cho tạo dòng, cần có phương pháp đưa DNA vào trong tế bào của những sinh
180 vật này. Nói chung ở một số loài vi khuẩn tế bào được xử lý bằng dung dịch muối. Ở tế bào nấm men, sự tiếp nhận DNA tăng lên khi tiếp xúc với lithium chloride hoặc lithium acetat. Vì vậy người ta sử dụng phương pháp này thường xuyên khi biến nạp nấm men (Saccharomyce cerevisiae). Đối với phần lớn sinh vật bậc cao hơn đòi hỏi phương pháp tinh vi hơn. 2.1. Biến nạp vào tế bào riêng lẻ Cản trở lớn nhất ở sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế bào. Tế bào động vật không có thành. Trong nuôi cấy, chúng được biến nạp dễ dàng, đặc biệt khi DNA gắn trên bề mặt của tế bào nhờ kết tủa với calcium phosphat (hình 9.1a). Các enzyme được sử dụng làm mất thành tế bào của nấm men, các loại nấm khác, tế bào thực vật, và dưới những điều kiện thích hợp, người ta có thể tạo ra tế bào trần (hình 9.1b). Tế bào trần tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng. Có thể thực hiện chuyển nạp bằng những phương pháp khác nhau: Hình 9.1 Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào 2.1.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes mang các gene ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn có kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây (Hình 9.2).