CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 9

Chia sẻ: Afsjkja Sahfhgk | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:21

Thêm vào BST

Báo xấu

167
lượt xem 52
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D. Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là TDNA (Transferred DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc (oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự phân chia tế bào liên tục. Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 9

182 Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D. Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là T- DNA (Transferred DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc (oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự phân chia tế bào liên tục. Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amine hay đường gọi là opine. Hai loại enzyme đã được nghiên cứu kỹ nhất là octopine synthetase và nopaline synthetase. Vùng B có liên quan đến sự tái sinh Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế bào thực vật Ngoài ra mỗi Ti-plasmid còn chứa các gene nằm ngoài vùng T-DNA mã hoá cho các enzyme phân giải ocpine để làm nguồn dinh dưỡng cacbon và nitrogen cho vi khuẩn. 2.1.1.2. T-DNA và các trật tự biên 25 bp Vùng T-DNA có kích thước từ 10 kb đến 20 kb, nằm kẹp giữ hai trật tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border – LB) và biên phải (right border – RB). Toàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biên này đều được chuyển sang tế bào thực vật. LB và RB là những yếu tố cần thiết để định hướng cho sự chuyển DNA. Việc mất đi 6 bp đầu tiên hoặc 10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA. Quá trình chuyển của T-DNA được bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB. Sự định hướng này là rất quan trọng nếu không việc chuyển sẽ kém hiệu quả. Trong các gene được mã hoá ở vùng T-DNA có 3 gene rất quan trọng trong việc phát triển khối u: một gene mã hoá cho việc chuyển enzyme AMP-isopentonyl transferase và 2 gene mã hoá cho enzyme tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane-2 mono oxygenase và acetamid hydrolase). Sự hoạt động của các gene này tạo điều kiện cho sự phát triển của tế bào thực vật có sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin. Đặc điểm này được sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong phần lớn các tế bào không được biến nạp. 2.1.1.3. Vùng vir Chính hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Nó có kích thước khoảng 40 kb và gồm 6 operon: virA, B, D và G là toàn toàn cần thiết cho việc tạo ra độc tính, còn virC và E có liên quan với việc hình thành khối u. Trừ virG và A, các operon khác đều là đa cistron. Nói chung gene virA biểu hiện ở mọi điều kiện, gene virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng thể hiện rất mạnh ở các dịch chiết từ các mô bị tổn thương. Hoạt động của các operon này có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các hợp chất phenol được tiết
183 ra từ vết thương của cây. Từ vết thương của cây thuốc lá người ta đã t inh chiết và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và alpha hydroxyacetosyringon. 2.1.1.4. Quá trình chuyển T-DNA Đoạn T-DNA muốn được chuyển, trước tiên nó cần phải được hoạt hoá nhờ hoạt động của các gene vir. Hoạt động này xảy ra khi Agrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được chiết ra từ vết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hoặc protoplast. Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gene virA (protein virA). Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium, đóng vai trò như là một chất thụ cảm đối với acetosyringon có trong môi trường. Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (có lẽ bằng việc phosphoryl hoá) gene virG. Protein virG sau đó lại gắn vào gene chỉ huy nằm sát gene khởi động thuộc các gene vir khác. Bằng cách như vậy, protein của gene virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình phiên mã của chính nó, đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E. Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, ở vị trí base thứ ba và thứ tư của mạch đơn phía dưới mới được tổng hợp. Từ đó, một mạch T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo hướng 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải. Điều này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA. Operon D chủ yếu mã hoá cho một loại endonuclease tạo ra các vết cắt nói trên tại hai trật tự biên. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gene virC mã hoá. Protein gene vir E2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật. Phức hợp protein-mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T- DNA sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium. Gene virB mã hoá cho ít nhất 11 protein để hình thành nên một cầu nối, cho phức hợp trên chuyển từ Agrobacterium sang tế bào thực vật. Tế bào thực vật bị thương tổn là nơi chuyển gene T-DNA. Trong các mô được sử dung để chuyển gene, lá là nguồn tốt nhất cho tái sinh (Hình 9.4). Những tế bào ở mép lá bắt đầu tái sinh và khi những đĩa lá này được nuôi cấy trên môi trường chứa Agrobacterium, những tế bào này rất hiệu quả cho tác nhân chuyển gene. Kỹ thuật đĩa lá được sử dụng hiệu quả cho chuyển gene vào thực vật nhờ sử dụng Ti-plasmid của Agrobacterium. 2.1.2. Chuyển nạp gene trực tiếp vào protoplast Hầu hết các tế bào thực vật được bao bọc bởi thành cellulose nên khó để hấp thụ các phân tử DNA ngoài vào tế bào. Tuy nhiên thành tế bào có thể làm tan nhờ xử lý tế bào với enzyme cellulase (Hình 9.5). Kết quả thu được các protoplast chỉ còn màng sinh chất rất thuận lợi cho các thao tác
184 thí nghiệm. Protoplast có thể hấp thụ các đại phân tử như DNA và chúng có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua sự tạo thành callus. Hình 9.4 Tái sinh cây từ đĩa lá nhiễm Agrobacterium Mặc dầu protoplast đã được sử dụng thành công cho nhiều loài, tuy nhiên hầu hết các cây nông nghiệp quan trọng như ngũ cốc là rất khó tái sinh từ protoplast. Gần đây đã thu được một vài thành công trong sinh trưởng ở lúa và ngô từ protoplast của nuôi cấy tế bào phát sinh phôi. Phôi thực vật sinh trưởng in vitro là nguồn tế bào quan trọng cho nuôi cấy. Các cây lúa và ngô hữu thụ được tạo thành từ những tế bào được thao tác di truyền thu được từ nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi. 2.1.2. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng xung điện Tế bào được đặt ở trong một thiết bị có hiệu điện thế cao, xung điện
185 tạo các lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) ở trên màng tế bào và DNA có thể xâm nhập vào chất nguyên sinh. Bên cạnh những phương pháp biến nạp, người ta còn sử dụng các phương pháp vật lý để đưa DNA vào trong tế bào. 2.1.3. Chuyển gene bằng phương pháp bắn gene Hinh 9.5 Tái sinh cây từ protoplast
186 Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới. Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu tiên vào năm 1987. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng viên đạn có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào. 1-1,5 μm được dùng làm vi đạn (microprojectile). Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quang vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với nòng súng. Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Ra khỏi đầu nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào. Một tỷ lệ nhất định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gene (Hình 9.6). Hình 9.6 Sơ đồ súng bắn gene 2.1.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm (microinjection) ông ở khá nhiều đối tượng thực vật (Hình 9.7). Tuy nhiên, kỹ thuật này hiện nay ít được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác (micromanipulator) cực nhạy, thiết bị kéo và mài kim tiêm từ các ống thủy tinh (puller) rất đắt tiền. Ngoài ra, nó còn đòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên. vào tế bào Hình 9.7
187 2.2. Biến nạp toàn bộ cơ thể Ở động vật và thực vật sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên có vấn đề với phương pháp tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác. T ừ một tế bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gene, trong đó mỗi tế bào của nó mang DNA tạo dòng và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau, sau khi nở hoa và tạo hạt. Tế bào động vật không thể tái sinh từ tế bào nuôi cấy, vì vậy người ta cần một phương pháp khác cho biến nạp động vật. Phương pháp tiêu chuẩn ở động vật có vú (ví dụ như chuột) là những trứng đã được thụ tinh được lấy ra từ ống dẫn trứng, DNA được đưa vào bằng phương pháp vi tiêm và tế bào biến nạp sau đó được nuôi cấy trở lại trong bộ phận sinh sản của cơ thể mẹ. 2.3 Một số thành tựu của việc tạo các cây trồng biến đổi gene trên thế giới và ở Việt nam 2.3.1. Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công Nói chung, hầu hết các loài thực vật đều có thể biến nạp được gene. Bảng 9.1. trình bày các loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công. Thông thường hiệu quả biến nạp gene khác nhau tuỳ thuộc vào thừng loại cây trồng và quá trình biến nạp gene vẫn còn bị hạn chế ở nhiều loài. Ở đây chỉ minh hoạ các kết quả biến nạp gene thành công ở các giống cây trồng quan trọng. - Cây ngô: 1988). Tuy nhiên, có thể dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh các cây hữu thụ mang gene biến nạp, sử dụng phương pháp bắn gene và chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát sinh các phôi được biến nạp gene. Các cây biến nạp gene hữu thụ đã được tái sinh, ổn định di truyền và biểu hiện gene bar ) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau. Hiện nay biến nạp gene ở ngô bằng phương pháp bắn gene đã được sử dụng rộng rãi. Gần đây các kết quả biến nạp gene gián tiếp ở ngô nhờ Agrobacterium cũng đã được thông báo. Các thể biến nạp gene của dòng ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung (cocultivation) giữa vector “super-binary” với phôi non. Tần số được thông báo ở dòng A188 là khoảng 5-30%. Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,4- 5,3% (tính theo số cây biến nạp gene độc lập/phôi).
188 9.1. Phương pháp biến nạp gene Thử nghiệm đồng ruộng TT Loài Chuối Bắn gene/Agrobacterium 1 - Luá mạch Bắn gene 2 Kháng virus Đậu tây Bắn gene 3 - Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ, 4 Canola điều khiển sự thụ phấn Sắn Bắn gene/Agrobacterium 5 - Bắn gene/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống 6 Ngô chịu chất diệt cỏ Bắn gene/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống 7 Bông chịu chất diệt cỏ Đu đủ Bắn gene/Agrobacterium 8 Kháng virus Đậu phụng Bắn gene/Agrobacterium 9 Kháng virus Bạch dương Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 10 11 Khoai tây Agrobacterium Kháng côn trùng, virus, chống chịu chất diệt cỏ Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 12 Lúa Đậu tương Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 13 Bắn gene/Agrobacterium 14 Bí Kháng virus Củ cải đường Chống chịu chất diệt cỏ 15 Agrobacterium Bắn gene 16 Mía - Hướng Bắn gene 17 - dương Quả chín muộn, kháng 18 Cà chua Agrobacterium virus Bắn gene 19 Lúa mì - - Cây lúa: đây chưa đến 10 năm. Các nghiên cứu sau đó cũng đã sử dụng hai kỹ thuật này để biến nạp gene vào protoplast và phục hồi các : Taipei 309) nhưng hầu hết các giống japonica ưu tú cũng như phần lớn các giống indica là khó tái sinh cây từ protoplast. Phương pháp bắn gene cho phép thực hiện biến nạp gene hiệu quả ở lúa trong các kiểu gene độc lập. Hiện
189 nay, hơn 40 giống đã được biến nạp gene thành công. Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành. Hygromycin B là marker chọn lọc thường dùng cho lúa. Tần số biến nạp có thể cao tới 50% (tính theo số cây biến nạp gene có nguồn gốc độc lập/ số mẫu được bắn gene). Gần đây, kỹ thuật biến nạp gene ở lúa thông qua Agrobacterium cũng đã có những cải tiến có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gene. - Cây lúa mì: Phương pháp bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene ở lúa mì. DNA ngoại lai được bắn vào trong vảy nhỏ (scutellum) của phôi non của hai giống lúa mùa xuân và một giống lúa mùa đông. Các callus chống chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố ức chế trao đổi chất tương tự như basta, bialaphos hoặc glufosinate ammonium. Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và kết quả là một số lớn cây thất thoát. Phân tích di truyền và phân tử đã xác nhận sự hợp nhất ổn định của các gene biến nạp. Nói chung công nghệ di truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gene. - Cây lúa mạch: Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn các cây lúa mạch biến nạp gene độc lập, tự thụ phấn. Các phôi hợp tử non, các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc từ tiểu bào tử hạt phấn đã được dùng để bắn gene với plasmid mang gene bar gus lùn vàng ở lúa mạch. Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để phân lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của gene. - Cây đậu tương: Những cố gắng đầu tiên của cây đậu tương biến nạp tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi. Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc này vẫn còn chậm và việc phục hồi các cây biến nạp gene vẫn đang còn gặp nhiều khó khăn. Công nghệ biến nạp gene ở đậu tương đã có triển vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hoá của kỹ thuật bắn gene. Thực tế, đậu tương đã được dùng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền. Kết quả đầu tiên ở đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gene nhờ Agrobacterium. Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate. Có thể biến nạp gene hiệu quả vào dụng nhưng rất khó tái sinh được cây. Để biến nạp gene vào các giống đậu tương khác nhau, người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản - phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh c
190 đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai. Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho nhiều phenotype khác nhau. Nói chung ở các dòng đậu tương biến nạp gene có nhiều bản sao của các gene biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50 nhưng thường thay đổi từ 2-10). Phân tích DNA (southern blot) ở thế hệ sau của các bản sao gene phức cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời, như thế mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên. - : Phaseolus thành công rất ít. Hai hướng được ứng dụng trong công nghệ di truyền ở đậu tây là kỹ thuật xâm nhiễm bằng Agrobacterium và bắn gene. Tuy nhiên, chỉ có kỹ thuật sau mới có khả năng phục hồi các cây biến nạp. Cây đậu tây biến nạp biểu hiện các gene gusA, bar và protein vỏ của virus khảm màu vàng đã được phục hồi. Các cây biến nạp gene qua năm thế hệ tự thụ phấn vẫn không mất các gene biến nạp hoặc khả năng biểu hiện. Kỹ thuật bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene gusA được điều khiển bằng promoter concanavalin A, hoạt tính gus đã biểu hiện trong lá mầm và vỏ hạt của các cây biến nạp. - Cây bông: Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gene vào cây bông giống Coker 312 (Umbeck 1987). Cây bông biến nạp gene cũng của giống t 1990). Hầu hết các giống bông có giá trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus. Một số ít các giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô tính (somaclonal variation). Phương thức phân phối gene ngoại lai trực tiếp vào mô phân sinh của trụ phôi cũng đã được phát triển và đã phục hồi cây biến nạp gene. 2.3.2 sống tự do hoặc cộng sinh tồn tại phương thức biến đổi nitơ phân tử của khí trời thành dạng NH3. Nitrogenease N2 ... NH3 nif) chỉ tồn tại ở - một số loài tảo lam và vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với các loài họ đậu (Fabaceae). Dùng kỹ thuật tách gene nif từ các cơ thể cố định đạm chuyển sang các cây trồng quan trong như lúa, ngô là một mô hình lý tưởng của các nhà tạo giống (Hình 9.8).
191 Hình 9.8 Mô hình biến nạp gene nif Quá trình cố định đạm thông qua enzyme nitrogenease phải xảy ra trong điều kiện yếm khí nghĩa là không có mặt O2 ở vùng phản ứng. Điều kiện này được thực hiên ở các nốt sần của cây họ đậ 2 được vùng phản ứng sạch O2 hoặc đưa vào tế bào một cơ chế bảo vệ như legoglobin. Đó là mộ ) đang tìm cách giải quyết. III. Kỹ thuật RFLP 1 Đại cương về kỹ thuật RFLP Kỹ thuật này dựa trên cơ sở đặc hiệu trong việc cắt đoạn DNA của một loại hình enzyme đặc hiệu gọi là enzyme giới hạn. Khi sử dụng một hay nhiều enzyme giới hạn, chúng sẽ tìm đúng vị trí đặc hiệu để cắt và cho những đoạn DNA dài ngắn khác nhau. Bất kỳ có sự biến đổi nào trong hệ gene (sự đảo gene, đột biến điểm, tăng giảm các cấu trúc lặp...) đều dẫn đến sự thay đổi các điểm cắt và do vậy, khi dùng phương pháp RFLP sẽ cho bản đồ enzyme giới hạn khác biệt. Cá thể đã có sự biến đổi di truyền nhất định, hay nói cách khác đã có thể thuộc biến chủng khác. Kỹ thuật RFLP dễ làm, có độ chính xác cao và có thể thực hiện trên DNA của nhiều cá thể trong thời gian ngắn. Sau khi xử lý kết quả nhiều lần bằng phương pháp RFLP, mỗi một hệ gene của mỗi cá thể thuần chủng sẽ cho một bản đồ gene xác định và giống nhau. Ngược lại khi bị biến đổi, các cá thể biến chủng sẽ cho bản đồ RFLP khác nhau. Độ sai khác càng xa thì sự biến chủng càng lớn. Khi độ sai khác cao hơn mức xác định, các cá
192 thể này đã có thể thuộc về chủng khác khi xem xét phân loại. 2. Thư viện chỉ thị (marker) phân tử DNA marker là những marker phân tử được tạo ra nhờ k ỹ thuật phân cắt DNA bằng các enzyme giới hạn (restriction endonuclease). Khi tạo ra những đọan DNA mới, người ta đã cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa marker và gene định vị trên nhiễm sắc thể nào đó. Bản đồ di truyền đơn giản của ruồi giấm đã được phát hiện từ năm 1925. Những tính trạng có biểu hiện giống nhau về di truyền được xếp vào cùng một nhóm liên kết gene, trên cùng một nhiễm sắc thể. Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo đếm được, gene đó được xem là marker gene. Ví dụ liên kết gene giữa lá mầm có màu tím và tính kháng rầy nâu của một vài giống lúa ở Đông bắc Ấn độ. Khi giống kháng có lá mầm màu tím được lai với giống nhiễm có lá mầm màu xanh, ở thế hệ F2 có xuất hiện con lai có lá mầm màu tím. Như vậy lá mầm màu tím được xem như marker đối với tính kháng rầy nâu. Việc lập bản đồ gene và chọn lọc nhờ marker như vậy rất chậm. Mặt khác số marker quá ít và chỉ có ở quy mô hình thái. Việc áp dụng isozyme marker có ưu điểm hơn, nhưng số marker cũng quá ít, không đáp ứng được nhu cầu nghiên cứu. DNA marker đã được chứng minh là có tầm quan trọng hơn về lâu dài, do số lượng của nó lớn hơn rất nhiều lần isoenzyme marker. Việc áp dụng DNA marker dễ dàng hơn và trong tương lai sẽ rẽ hơn. Muốn phát hiện ra chuỗi mã DNA đặc biệt nào đó, người ta phải áp dụng một kỹ thuật lai DNA-DNA. Các đoạn DNA được tách riêng ra nhờ kỹ thuật điện di sẽ biến tính trước khi nó được chuyển qua màng lọc. Như vậy các DNA trên màng lọc là DNA ở dạng sợi đơn. Để tìm một đoạn DNA đặc biệt nào đó trên màng lọc cần phải có một DNA thăm dò, lai với DNA đặc hiệu, thông qua các liên kết base. Nếu DNA thăm dò đã được đánh dấu bằng chất đồng vị hay hoá chất nào đó thì sẽ xác định được một chuỗi mã di truyền DNA cần nghiên cứu. Về căn bản, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể được xem như một DNA marker. Các DNA marker có thể được chia thành hai nhóm như sau: - PCR-based: ALP, AFLP, SSR, SSCP - DNA/DNA hybridization-based: RFLP, minisatellite Các marker thuộc nhóm PCR-based có thể chia thành: + Marker ngắn, có tính ngẫu nhiên: RAPD, AP-PCR, ADF, AFLP + Amplicon đơn: ALP, SSR, SSCP Những ưu điểm của DNA-marker so với marker hình thái và isozyme marker là:
193 - Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền - Có nhiều marker trong quần thể - Đo lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển. Bảng 9.2 Các loại DNA marker Tên đầy đủ Marker RFLP Restriction fragment length polymorphism ALP Amplicon fragment length polymorphism AFLP Amplified fragment length polymorphism RAPD Random amplified polymorphic DNA DAF DNA amplification fingerprinting SSR Simple sequence repeat (microsatellite) AP-PCR Arbitrary primer-PCR SSCP Single strand conformation polymorphism MRHDV-DNA Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA (minisatellite) RFLP maker Trong các DNA marker, RFLP là marker được dùng phổ biến và được biết nhiều nhất. Để tạo ra chất thăm dò RFLP marker và thể đa hình DNA gồm nhiều giai đoạn: - Phân lập DNA Trước hết phải chuẩn bị chất thăm dò của marker và bộ lọc DNA lai. Đó là giai đoạn có tính chất quyết định trong phân tích RFLP. Ví dụ cần có DNA từ mô lúa với số lượng nhiều và chất lượng tốt. Mô lúa được nghiền trong nitơ lỏng. Chất đệm khi ly trích DNA có chứa SDS, chất này có thể phân giải màng tế bào và màng nhân, phóng thích DNA vào dung dịch. SDS là chất tẩy khá mạnh, có thể làm biến đổi protein ở nhiệt độ 650C. Sự biến đổi này làm cho DNA gắn với protein bị tách rời ra khỏi DNA cần nghiên cứu. Protein và chất cặn của tế bào được tách rời ra khỏi DNA bằng phenol/chloroform hoặc bằng phương pháp kết tủa chọn lọc của những chất cặn tế bào với potasium acetate. DNA ở pha lỏng sẽ được kết tủa bằng cách thêm isopropanol. Phân lập DNA bằng phương pháp này chỉ áp dụng đối với DNA có kích thước lớn hơn 30 kb và có ít tạp chất polysaccharide. Lượng nhỏ của tạp chất này sẽ gây khó khăn khi chạy điện di trên gel, do đó phải hết sức thận trọng khi tách DNA. Nguồn gốc mô cũng ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng DNA. Mô cây khỏe và trẻ cho kết quả phân lập DNA tốt hơn từ mô già hoặc từ các loài lúa hoang dại do bị lẫn tạp polysaccharide.
194 DNA được phân lập có thể tồn trữ trong điều kiện -200C. Phải chú ý rằng đông lạnh nhiều lần hoặc làm tan băng nhiều lần cũng có thể làm phân huỷ DNA. Trong quá trình phân lập phải sử dụng nhiều dung môi. Có hai dung môi quan trọng là EDTA và Tris. - Tris (Trima, base) được sử dụng với khả năng đệm rất có hiệu quả trong dung môi. Ở pH 8.0, DNA rất ổn định. Trong điều kiện môi trường axit, purine rất dễ bị loại thải (được gọi là “depurination”) do cầu nối phosphodiester dễ bị phá vỡ. Do đó, người ta phải kiểm soát pH của dung môi ở mức 8.0 khi dùng Tris. - DNA có thể bị hỏng bởi các enzyme. Enzyme này có thể truyền từ tay người làm thí nghiệm, hoặc từ không khí. Để ngăn ngừa khả năng DNA bị thuỷ phân bởi enzyme, người ta phải sử dụng thêm EDTA. Tất cả các enzyme thuỷ phân DNA được biết hiện nay đều cần Mg++ làm cofactor. EDTA có thể kìm giữ Mg++ và làm bất hoạt nó trong dung môi. Không có Mg++, enzyme không thể hoạt động. Tiến trình thuỷ phân DNA được thực hiện bằng restriction endonuclease. DNA sẽ được đưa về một bộ sưu tập DNA thống nhất sau khi hoàn tất việc phân cắt các chuỗi mã thành những đoạn (DNA fragment) riêng biệt. Độ lớn của các đoạn này sau khi tiêu hoá khoảng 30 kb, có khi nhỏ hơn 100 bp. Để xác định các DNA fragment thông qua kỹ thuật phân tích Southern, người ta điện di các DNA trên agarose gel. Sau khi điện di, các đoạn DNA được phân ra tùy theo trọng lượng phân tử. Người ta có thể quan sát chúng bằng mắt, nhờ kỹ thuật nhuộm màu DNA với ethidium bromide và xác định dưới tia cực tím. Khi phân tích Southern, các đoạn DNA được chuyển vào các tấm lọc, nhờ lực mao dẫn. Ở giai đoạn prehybridization (trước khi lai DNA) người ta khóa các vị trí trên màng- nơi quá trình lai sẽ xảy ra, các DNA (gene liên kết với marker) sẽ gắn với nucleic acid thăm dò (RFLP-marker) được đánh dấu bằng phóng xạ. Sau khi hybridization, tấm lọc hay màng lọc được rửa để loại bỏ các RFLP-marker không gắn hoặc gắn yếu với DNA đang nghiên cứu. Tiếp đó nó tự ghi trên biểu đồ phát xạ. Sau khi điện di, gel được chụp dưới tia cực tím. Các đoạn DNA xuất hiện thành các đốm liên tục. Nó sẽ cho tín hiệu khi thể hiện ra trên phim X-quang. Các vạch có tính đa hình (polymorphism) có thể được quan sát để đánh giá. Có hàng triệu đoạn DNA sau khi phân cắt bằng một restriction endonuclease nào đó. Nhưng chúng không thể được sử dụng như RFLP marker, nếu từng đoạn này chưa được thanh lọc làm cho thuần khiết và chưa được khuếch đại nhằm có đủ số lượng các đoạn DNA đồng nhất, thuần chủng. Theo ý nghĩa này, RFLP phải có tính chất như sau: - Có số lượng cao trong mỗi quần thể
195 - Đồng trội (Codominant ) - Đo trực tiếp DNA - Không bị ảnh hưởng của môi trường - Không bị ảnh hưởng do yếu tố có tính chất phát triển RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhưng qui trình thực hiện rất phức tạp, nguy hiểm đến sức khoẻ người thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lượng và chất lượng cao. Do đó người ta có xu hướng áp dụng các marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở của phản ứng chuỗi polymerase. 3.3. Lập bản đồ di truyền bằng chỉ thị RFLP Việc lập bản đồ gene cũng như việc chọn lọc giống cây trồng trên cơ sở DNA marker phát triển nhanh, nhờ sự khám phá ra phản ứng chuỗi trùng hợp PCR và một dạng polymerase có tính chịu nhiệt. Xây dựng bản đồ di truyền thường căn cứ trên sự xuất hiện của các biến dị có tính chất nền tảng di truyền của quần thể. Phương pháp phân tích đa hình về chiều dài các đoạn DNA (RFLP) bằng kỹ thuật enzyme giới hạn, là cắt rời DNA hệ gene thành nhiều đoạn ngắn dài khác nhau, từ đó lập nên bản đồ hệ gene, gọi là bản đồ enzyme giới hạn của mỗi cá thể. 3.4. Ứng dụng kỹ thuật RFLP trong chọn giống thực vật Trước đây người ta đã sử dụng các dị thể đánh dấu đơn lẽ trong thực vật bậc cao để xem xét các đặc tính hình thái. Ví dụ, gene gây tính lùn, gene tạo ra sự thiếu lục lạp hoặc làm biến dạng lá cây. Mặc dù các marker rất có ích trong nhiều nghiên cứu ứng dụng cũng như cơ bản, nhưng nó rất hạn chế trong chọn giống cây trồng. Những năm gần đây, có hai loại marker mới đã được phân lập, chúng có nhiều triển vọng trong việc ứng dụng vào công tác chọn giống. Đó là protein marker và DNA marker. Những marker phân tử này khác với marker hình thái ở 5 đặc điểm di truyền như sau: - Kiểu gene của các locus phân tử có thể được xác định ở khắp cây trồng, ở mức độ tế bào, mô. Kiểu hình của tất cả marker hình thái có thể chỉ được phân biệt ở mức độ ở dạng cây bên ngoài. - Một số tương đối lớn các allele được tìm thấy ở các locus phân tử. Trong khi các gene ở các locus chứa marker hình thái, xuất hiện với tần số thấp hơn và thường bị kích thích tạo ra các đột biến gene. - Không ảnh hưởng gây hại đi kèm theo các gene của marker phân tử. Trong khi ở marker hình thái, nó thường kết hợp với ảnh hưởng do kiểu hình bất lợi gây ra. - Alelle của marker phân tử thường là đồng trội, do đó nó cho phép tất cả các kiểu gene được thể hiện trong mọi thế hệ phân ly giữa tính trội và lặn.
196 - Đối với marker hình thái, ảnh hưởng mạnh mẽ của tính lấn át (epistasis) làm hạn chế số marker đang phân ly, do đó nó có thể được đánh giá như một thế hệ phân ly. Trong khi có rất ít ảnh hưởng lấn át hoặc đa tính trạng (pleiotropic) được quan sát ở marker phân tử, cho nên số marker đang phân ly có thể được theo dõi ở từng quần thể. Các ứng dụng thông thường của marker phân tử là: - Xác định mức độ phong phú di truyền - Xác định độ chính xác về di truyền của con lai - Ước đoán mức độ tạp giao - Phát hiện sự du nhập gene hoang dại. Nhiều gene đơn như tính bất dục đực, gene phục hồi phấn hoa, gene kháng bệnh được chuyển nhiều lần từ một vật liệu di truyền vào vật liệu khác. Ở đây tính trạng trội lặn được sử dụng và yêu cầu thời gian cần thiết để chuyển nạp. Các quy trình chọn lọc này cồng kềnh, đắt tiền và yêu cầu ruộng thí nghiệm quá lớn. Marker phân tử đánh dấu các gene có tầm quan trọng về kinh tế. Nếu các gene đơn được đánh dấu bằng liên kết gene chặt chẽ với các marker phân tử, chúng ta sẽ tiết kiệm được tiền của, thời gian để chuyển các gene này vào vật liệu di truyền mà chúng ta mong muốn. Marker phân tử cho phép xác định ở giai đoạn rất sớm sự có mặt hay không của gene mong muốn. Tính chất đồng trội của các marker phân tử cho phép tất cả các kiểu gene được xác định trong lai tạo, ngay cả trong trường hợp gene đơn khó có thể được xác định trực tiếp. Ứng dụng tiến bộ này được thể hiện ở cà chua, gene Mi (kháng tuyến trùng) liên kết chặt chẽ với một alen hiếm Aps-1 (acid phosphatase) - locus định vị trên nhiễm sắc thể số 6. Nhiều chương trình lai cà chua đã ứng dụng để chọn lọc con lai với sự hiển diện của alen Aps-1 thay vì tính kháng tuyến trùng. Ở lúa đã tìm thấy gene cảm quang có liên quan chặt chẽ với Est-2 và Pgi-2 trên nhiễm sắc thể số 3. Bởi vì các giống cảm quang trồng được mỗi năm một lần trên ruộng, sự phát triển của các thế hệ rất chậm. Do đó lợi dụng đặc tính liên kết gene này với 2 locus isozyme, quần thể phân ly sẽ được đánh giá và các cá thể có tính cảm quang có thể được tuyển chọn. Tuy nhiên phương pháp isozym marker là không đủ isozyme locus để bao trùm lên toàn bộ bản đồ nhiễm sắc thể. Số isozyme markers quá ít là hạn chế chính trong việc ứng dụng với quy mô lớn các isozyme marker để cải tiến giống cây trồng. Ngược lại, RFLP markers có rất nhiều và bản đồ của nó có thể được chuẩn bị khá đầy đủ. Ở ngô và cà chua có hơn 500 locus RFLP đã được sản xuất. Hiện nay đang thực hiện đánh dấu các gene kháng sâu bệnh với các locus RFLP đánh dấu gene kháng bệnh bạc lá, đạo ôn, rầy nâu và rầy lưng trắng. Sự hữu thụ của của RFLP lớn hơn rất nhiều trong khi đánh dấu
197 các locus điều khiển tính trạng số lượng (QTLs). Thông qua phân tích này, QPLs được ứng dụng đối với tính kháng hạn và kháng mặn ở cây lúa. Các nhà chọn giống có thể áp dụng marker trong nhiều tính trạng khác nhau. Rõ ràng nhất là khi tính trạng mong muốn khó có thể tìm thấy vì nó liên quan đến đặc tính của giống cây trồng như tính kháng sâu bệnh, tính chống chịu hạn, ngập, nhiệt độ cao, mặn ....Những tính trạng này đòi hỏi một quy trình và điều kiện môi trường đặc biệt để đánh giá. Chọn lọc gián tiếp nhờ marker phân tử sẽ làm cho tiến độ chọn giống tiến hành đúng như kế hoạch, hơn nữa có thể kết hợp nhiều tính trạng chọn lọc cùng một lúc. Nhờ đánh dấu được các gene, nhà chọn giống có thể theo dõi tính chất di truyền trong một cặp lai thông qua phân tích RFLP trong quần thể phân ly. Ứng dụng RFLP marker để nghiên cứu bệnh đạo ôn trên lúa đã được công bố. Để đánh dấu được gene kháng, người ta đã sử dụng một bộ giống gần như đẳng gene (nearly isogeneic lines = NIL) từ giống rất nhiễm CO39, và phân tích bằng RFLP cho thấy gene kháng Pi-z(t) liên kết với dòng DNA sao chụp RG64 trên nhiễm sắc thể số 3. Khoảng cách giữa Pi- z(t) và RG64 là 4,2 ± 1,7 cM. Gene kháng đạo ôn của Tẻ Tép (Pi-3) liên kết với dòng DNA sao chụp RG869 trên nhiễm sắc thể số 6. Khoảng cách giữa Pi-3 và RG64 là 10,6 ±3,8 cM. Mc Couch và cs (1990) đã công bố gene đánh dấu đối với tính kháng bệnh cháy bìa lá và rầy lưng trắng. Gene đánh dấu thông qua RFLP là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính trạng chống chịu sâu bệnh hại lúa. Tất cả các giống lúa đều có thể được phân chia thành nhiều kiểu gene khác nhau khi phân tích RFLP. Tanksley và cs (1990) nghiên cứu tại Đại học Cornell về các marker dùng trong bản đồ gene của cây lúa. Có hơn 1000 RFLP marker đã được xác định trên bản đồ gene của cây lúa (Bennett, 1994) thông qua phân tích tính chất đồng phân ly và con số này sẽ dự kiến tăng lên 2000. Các kết quả này với những thông tin cần thiết về bản đồ gene, tạo ra khả năng rất to lớn áp dụng các markers trong chương trình lai tạo giống (Abenes và cs, 1993). Nhiều côn trùng gây hại, nấm, vi khuẩn... gây hại trên cây lúa có tính đa dạng về địa lý và thời gian. Tính đa dạng này thường biểu hiện thông qua sự khác biệt về độc tính và sự khác biệt về cây chủ có tính kháng. Phương pháp phân tích RFLP và RADP đã được ứng dụng giúp hiểu rõ hơn sự biến động của sâu bệnh hại lúa, cũng như để khai thác tốt nhất các giống lúa kháng sâu bệnh. - Rầy nâu: Sử dụng RFLP để lập bản đồ gene kháng với rầy nâu đã được ghi nhận thông qua trường hợp thu nhận gene kháng từ lúa hoang dại Oryza australiensis vào lúa trồng Oryza sativa (Ishii và cs, 1994). Gene kháng rầy nâu được xác định là định vị trên nhiễm sắc thể số 12. Chỉ có marker RG457 trong 14 marker thăm dò có tính đa hình đã phát hiện được
198 trên nhiễm sắc thể 12, tại đây gene kháng rầy nâu của Oryza australiensis đã du nhập vào con lai của tổ hợp lai nói trên. Căn cứ vào tính chất đồng phân ly giữa tính kháng rầy nâu và RG457, cho thấy gene kháng rầy nâu có liên kết với RG457, khoảng cách giữa chúng là 3.68 cM. Với một liên kết chặt chẽ như vậy, nó rất hữu ích khi chúng ta áp dụng phương pháp chọn lọc với sự trợ giúp của marker (MAS: marker aided-selection) để có các giống lúa kháng rầy nâu. Nghiên cứu bản đồ RFLP nhằm mục đích phân lập các QTL điều khiển tính kháng bệnh đạo ôn, đã được thực hiện tại IRRI (Wang và cs, 1992). Nghiên cứu này đã tìm hiểu di truyền tính kháng bệnh đạo ôn trên giống Moroberekan, một giống lúa rẫy địa phương ở Tây phi có tính kháng ổn định với bệnh đạo ôn (Bonman và Mackill, 1988). Một gene thể hiện tính kháng hoàn toàn ký hiệu là Pi-5(t) đã được lên bản đồ. - Bệnh bạc lá: Các phân tích di truyền đã chứng minh có sự hiển diện của ít nhất 19 gene kháng bệnh bạc lá lúa (Ogawa và Khush, 1989; Kinoshita, 1991). Cho đến nay 7 gene kháng bệnh bạc lá đã được lập bản đồ bằng RFLP (Mc Couch và c, 1991; Ronald và Tanskley, 1991; Yoshimura và cs, 1992). Người ta đã sử dụng quần thể phân ly để xác định tính chất đồng phân ly giữa RFLP marker và các gene Xa -1, Xa-2, Xa-3, Xa-4, Xa-5, Xa-10 và Xa-21. Gene Xa-1, Xa-5, Xa-21 là những “gene tags” (vật đánh dấu gene) rất hữu dụng trong chọn lọc một chương trình lai tạo có hiệu quả. Muốn biết marker có phải là công cụ hữu ích trong chọn lọc giống lúa hay không, người ta nghiên cứu bản chất của sự kết hợp gene trong một nền tảng di truyền nào đó. Các marker cung cấp ngay những thông tin về cây lúa nào mang gene gì và nó thể hiện trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử. Các markers cho phép khẳng định chính xác kiểu gene trong đó hai gene hoặc nhiều hơn hai gene kết hợp với nhau. Mối tương tác chưa chắc chắn giữa các gene đơn, cũng có thể được đánh giá bằng phương pháp này. Ví dụ, giống mang cả hai gene Xa-5 và Xa-4 được tìm thấy kháng mạnh hơn đối với một isolate của dòng số 4 so với giống láu mang từng gene này đơn độc (Nelson, 1993). IV. Kỹ thuật PCR 1. Đại cương về kỹ thuật PCR Phát triển phương pháp cho tạo dòng DNA trong những năm bảy mươi đã có bước nhảy, vì lúc này gene và hoạt tính của gene được nghiên cứu theo dạng mà trước đó không thể có được. Có cái gì đó tương tự xảy ra trong những năm tám mươi là đã tìm ra phương pháp có tính cách mạng: phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction, PCR). PCR làm khuếch đại một đoạn nào đó trong phân tử DNA. Người ta có thể chọn bất kỳ đoạn nào đó với điều kiện là đã biết trình tự ở những đầu cuối. Điều này rất cần thiết vì để bắt đầu PCR mỗi đoạn ngắn
199 oligonucleotide (một mồi) phải lai với một đầu sợi đơn của phân tử DNA (hình 9.9). Đoạn oligonucleotide này là mồi cho phản ứng tổng hợp DNA và giới hạn đoạn cần khuếch đại. Hình 9.9 Phản ứng PCR khuếch đạị trình tự đích Để thực hiện phản ứng PCR người ta cho enzyme vào DNA nguồn và
200 mồi và ủ hỗn hợp này, như vậy những sợi bổ sung được tổng hợp. Sau đó đun nóng hỗn hợp ở 940C để cho những sợi mới tạo nên tách ra từ sợi khuôn và làm nguội chúng trở lại để cho các phân tử mồi gắn vào vị trí của nó, cả những sợi mới tạo thành. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose. Lượng DNA mới tạo nên đủ để nhận ra vạch sau khi nhuộm ethidiumbromide. Người ta có thể gắn sản phẩm PCR với một vector plasmid hoặc phage để tạo dòng nghiên cứu ví dụ xác định trình tự DNA. 1.1. Nguyên tắc của PCR Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus 4 loại deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) và 2 primer, , nhờ vậy có thể đủ số lượng 3’ - 5’ (reverse primer-ký hiệu là R). Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 9.10 và 9.11. Theo đó, từ chu kỳ thứ 2 Taq polymerase bắt đ (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide. Nếu biết trình tự của đoạn gene cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng đ 25-35 chu kỳ, qua đó từ 10-6 g DNA ban đầu có thể khuếch đại (amplification) lên tới trên 1 g (khoảng 2 kb). . Mỗi chu kỳ PCR bao gồm 3 giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: - Gây biến tính ở 90-95oC trong vài giây cho đến vài phút Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành 2 sợi đơn (single strands) dùng làm khuôn cho các đoạn mồi bám và enzyme RNA polymerase xúc tác tổng hợp. Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó). - Ủ với mồi (annealing) ở 50-55oC Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các primer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơn t đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu. 70-72oC trong vài chục giây cho đến - Tổng hợp (synthesis) ở
201 vài chục phút. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’ 3’. Các primer ơ t gãy. Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do nhiệt đ . Enzyme Taq polymerase bổ sung các dNTP từ 5’ 3’. Hình 9.10 Sơ đ phản ứng trùng hợp DNA polymerase (PCR) Hình 9.11 Các chu kỳ phản ứng PCR Phản ứng PCR về nguyên tắc là đơn giản, nhưng để đạt được kết quả tốt cần phải thực hiện rất cẩn thận. Trình tự của đoạn mồi đối với kết quả thí nghiệm cũng quan trọng như đảm bảo đúng nhiệt độ trong từng giai đoạn của chu kỳ phản ứng. Cuối cùng là những vấn đề quan trọng sau khi sử dụng sản phẩm khuếch đại PCR. - Cấu trúc của mồi oligonucleotide cho phản ứng PCR Mồi quyết định sự thành công hay thất bại của thí nghiệm PCR. Khi nó được thiết kế đúng thì xảy ra sự khuếch đại đoạn DNA mong muốn. Nếu đoạn mồi được thiết kế sai không xảy ra phản ứng vì không xảy ra sự tổng hợp hoặc tổng hợp đoạn không mong muốn, thậm chí nhiều đoạn