intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Cytochrome - P450: Phần 2

Chia sẻ: Hoa La Hoa | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:139

254
lượt xem
51
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phần 2 Tài liệu Cytochrome - P450 tiếp tục giới thiệu đến bạn đọc nội dung phần còn lại tương ứng nội dung từ chương IV đến chương VI về hệ thống cytochrome - P450 ở vi sinh vật và thực vật, những gen Cyt-P450 và sự biểu hiện của chúng, những nghiên cứu ứng dụng cytochrome - P450. Tài liệu là Tài liệu tham khảo bổ ích và thiết thực cho bạn đọc trong việc nghiên cứu về vấn đề này.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Cytochrome - P450: Phần 2

  1. 79 Ch ng IV H TH NG CYTOCHROME-P450 VI SINH V T VÀ TH C V T 4.1. H! th#ng Cyt-450 % n&m men và n&m s,i (Filamentous Fungi) 4.1.1 Tình hình nghiên c u Cyt-P450 n m men và n m s i S� phát hi�n Cytochrome- P450 trong n�m men �ư�c công b� l�n ��u tiên vào n�m 1964 b�i Lindenmayer và Smith. Cùng n�m �ó, Omura và Sato c�ng công b� nh�ng bài báo ��u tiên c�a h�. Tuy nhiên, ngư�c v�i nh�ng hi�u bi�t khá nhi�u v� Cyt-P450 � ��ng v�t có vú thì Cyt-P450 � con men và n�m s�i (filamentous fungi) còn �ư�c bi�t r�t ít. Yoshida và cs �ã kh�ng ��nh �ư�c c�u trúc và ch�c n�ng c�a h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� trong Saccharomyces cerevisiae (hình 4.1) và �ã g�i các h� th�ng này là Cyt-P450(14DM), lanosterol 14 – demethylase. Nghiên c�u v� s� oxy hóa alkan b�i Cyt-P450 c�a con men h�p th� alkan �ư�c ti�n hành b�i m�t s� nhóm nghiên c�u khác nhau �ã cung c�p nh�ng thông tin quan tr�ng liên quan t�i Cyt-P450 � con men. S� có m�t c�a nh�ng Cyt-P450 và nh�ng ho�t tính ph� thu�c Cyt-P450 trong con men và filamentous fungi �ã �ư�c công b� nhưng c�ng m�i ch� d�ng l�i � mô t� s� lư�ng các Cyt-P450 t�n t�i trong các dòng riêng bi�t ho�c các dòng c�a các eukaryote �ơn bào, còn r�t h�n ch� so v�i s� lư�ng này � các karyote b�c cao hơn. Tuy nhiên, có th� là nh�ng cơ th� riêng bi�t t�o ra nh�ng Cyt--P450 nh�t ��nh �� �áp �ng cho nh�ng chuy�n hóa ��c hi�u c�a chúng và b� sung vào danh sách gia �ình c�a Cyt-P450. T�ng s� các Cyt-P450 trong eukaryote b�c th�p là r�t l�n. Cyt-P450 �ã t�o nên m�t ��i gia �ình các gen kh�ng l� trong quá trình ti�n hóa c�a eukaryote ��
  2. 80 Nguy�n Th� Ng�c Dao �áp �ng cho yêu c�u c�a chúng trong s� oxy hóa các h�p ch�t nh�t ��nh. �� gi�i thích s� ti�n hoá và s� khác nhau c�a Cyt-P450 c�n ph�i nghiên c�u tích c�c hơn n�a trên Cyt-P450 c�a eukaryote c�a vi sinh v�t c�ng như c�a th�c v�t b�c cao. - Kh� axít béo bão hòa acyl CoA NADH fP1 B5 C SF8 - Kh� axít béo bão hòa ergostadienol - Kh� methyl c�a sterol - Kh� methyl c�a lanosterrol NADPH fP2 P450s - Kh� bão hòa c�a ergostadienol - Oxy hóa các xenobiotic Squalene epoxidate Hình 4.1. H� th�ng chuy�n �i�n t� � n�m men và ch�c n�ng c�a chúng, fP1= NADH Cyt b5 reductase; b5 = Cytb5; CSF = cyanide senitive factor (y�u t� nh�y c�m v�i cyanide) B ng 4.1. Nh�ng ho�t tính ph� thu�c Cyt-P450 �ã công b� ��i v�i n�m men và n�m s�i Ho t tính P450 Phân b 14 -demethyl hoá các sterol P45014D H�u h�t vi sinh v�t 22 kh� bão hoà ergosterol P45022DS Có th� h�u h�t Thu� phân kh�i mào các alkan P450 alkan N�m men tiêu th� Alkan Thu� phân các axit béo P450 alki,c Candida tropical Chuy�n hoá các xenobiotic B Saccharomyces cerevisiae a Schizoscc pombe a Candida tropical a Cunighamella elegan a Cunighamella baireiri P450 hpha Aspergillus sp. T�o thành isobuten P450RM Rhodotorula minuta
  3. Ch ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 81 Chuy�n hoá nitrat/nitrit P450dNIR Fusarium oxysporum Demethyl hoá pisatin P450(57)d Nectria haematococca Thu� phân m-cresol a Aspergillus parasitous. Sinh t�ng h�p aflatoxin a Claviceps purpurea Sinh t�ng ergot alkaloid a Aspergillus Ocraceousrhizopusnigricas Thu� phân progesterone a Chú thích: a = P450 �áp �ng cho nh�ng ho�t tính chưa �ư�c xác ��nh, b= m�t P450 có ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa �ư�c kh�ng ��nh như m�t loài duy nh�t, c= nh�ng P450 có th� �áp �ng cho ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa kh�ng ��nh v� �óng góp c�a nó cho ph�n �ng, d: gen c�a P450 này �ã �ư�c tách dòng nhưng protein tương �ng chưa tách �ư�c 4.1.2. Cyt-P450 c a n m men Cyt-P450(14DM) (Lanosterol 14 -demethylase) Cyt-P450(14DM) �ã �ư�c tinh s�ch t� S. cerevisiae và C. albicans, trong �ó S. cerevisiae �ư�c nghiên c�u nhi�u nh�t trong các lo�i n�m men. Enzyme này oxy hóa nhóm methyl c�a lanosterol �� b�t ��u s� sinh t�ng h�p ergosterol t� lanosterol và �ư�c phân b� r�ng rãi trong h�u h�t các eukaryote v�i ch�c n�ng chuy�n hoá. Nh:ng thu;c tính sinh lý, hóa sinh Cyt-P450(14DM) tinh s�ch t� S. cerevisiae có TLPT 58.000 khi �i�n di trên PGE có m�t SDS (th�p hơn giá tr� lý thuy�t 60.700). D�ng ferric khi không có cơ ch�t c�a Cyt-P450 này th� hi�n tr�ng thái spin th�p � sóng �� 417nm, không có h�p th� � vùng 650nm, tín hi�u EPR � g = 1,92 ; 2,27; và 2,45. D�ng kh�- CO có b�ng h�p th� � 447nm. Khi liên k�t v�i cơ ch�t, tr�ng thái spin th�p c�a ferric chuy�n thành spin cao v�i thay ��i quang ph� typ I. S� chuy�n d�ng spin này không x�y ra v�i 24, 25-dihydrolanosterol, m�t cơ ch�t khác ít b� �nh hư�ng hơn. B�ng cách s� d�ng s� bi�n ��i quang ph� do cơ ch�t b� kh�, ngư�i ta �ã xác ��nh �ư�c Kd c�a lanosterol là 6,0 µM và giá tr� này trùng kh�p v�i Km c�a h�p ch�t này. Enzyme này tác d�ng v�i nh�ng h�p ch�t ngo�i lai khác như pyridin, d�n xu�t imidazol và triazol, th� hi�n s� bi�n ��i quang ph� ��c trưng cho typ II. Trong s� nh�ng h�p ch�t này, các d�n xu�t
  4. 82 Nguy�n Th� Ng�c Dao azol �ư�c bi�t là nh�ng ch�t kháng n�m (antifungal agent) th� hi�n ái l�c ��c bi�t cao và chúng ho�t ��ng như là nh�ng ch�t �c ch� Cyt-P45014DM. Nh:ng thu;c tính xúc tác Cyt-P45014DM xúc tác s� oxy hóa lanosterol thành 4, demethylcholesta 8, 14, 24-trienol trong s� có m�t c�a NADPH- P450-reductase, O2 và NADPH (hình 4.2). Ph�n �ng này bao g�m 3 quá trình monooxygen hoá và m�t phân t� Cyt-P45014DM riêng l� chuy�n hóa toàn b� quá trình ph�n �ng liên t�c này mà không có s� gi�i phóng ch�t trung gian b� oxy hóa � v� trí 32. H�ng s� Km và Vmax c�a lanosterol 14 -demethylase c�a S. cerevisiae tái t�o �ư�c xác ��nh là 6,25µM và 16nmol s�n ph�m �ư�c t�o thành/phút/nm Cyt-P45014DM, m�t cách tương �ng. Vì s� methyl hóa g�m có 3 quá trình monooxygen hóa nên tr� s� Vmax mô t� � trên kh�ng ��nh r�ng m�t phân t� Cyt-P45014DM lanosterol xúc tác nhi�u quá trình oxy hoá /phút. Ph�n �ng kh� b�i enzyme c�a h�n h�p Cyt-P450 - lanosterol x�y ra v�i m�t h�ng s� bi�u ki�n k = 20min-1 dư�i áp su�t CO, trong khi m�t h�ng s� bi�u ki�n cho s� kh� c�a Cyt-P45014ld không có cơ ch�t là < 0,1min-1. �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P45014DM có m�t cơ ch� �i�u hòa �� h�n ch� s� quay vòng vô ích c�a chu k� oxy hóa kh�. Lanosterol 14 - demethylase tái l�p c�ng xúc tác cho s� th�y phân 14 , 24, 25 dihydrolanosterol v�i ái l�c y�u hơn (km = 16,7µM). Vì không có 24, 25 dihydrolanosterol xu�t hi�n m�t cách t� nhiên � n�m men nên cơ ch�t ��c bi�t này có th� có ý ngh�a v� m�t sinh lý. Thêm vào �ó, enzyme này có kh� n�ng chuy�n hóa m�t s� d�n xu�t lanosterol khác và b� �c ch� b�i m�t s� d�n xu�t lanosterol không b� chuy�n hóa. Tuy nhiên, enzyme này không có tác d�ng v�i cholesterol ho�c ergosterol và bi�u hi�n ho�t tính chuy�n hoá thu�c không �áng k�. Quan sát này cho th�y r�ng Cyt-P45014DM c�a n�m men có tính ��c hi�u cơ ch�t h�p ��i v�i lanosterol và các d�n xu�t c�a nó và ch� ho�t ��ng như enzyme lanosterol 14 -demethylase.
  5. Ch ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 83 HO Hình 4.2. S� demethyl hóa 14 c�a lanosterol �ư�c xúc tác b�i Cyt-P45014DM. C&u trúc bEc 1 C�u trúc b�c 1 c�a Cyt-P45014DM �ã �ư�c suy lu�n t� trình t� nucleotid c�a genomic DNAs dòng hoá t� S. cerevisiae, C.albican và C.tropical. Cyt-P45014DM là tương ��i l�n g�m 530 axit amin v�i tr�ng lương phân t� là 60.700 (S. cerevisiae). Xem xét c�u trúc b�c 1, Cyt-P45014DM c�a n�m men �ư�c coi là t�o thành m�t gia �ình gen riêng bi�t và �ư�c Nebert và cs x�p vào CYP51 như trong trư�ng h�p Cyt-P450 t� microsom c�a ��ng v�t có vú, Cyt- P45014DM có m�t c�u trúc �ư�c cho là m�t vùng g�n màng � ��u N- t�n như là ph�n �ư�c g�ch dư�i trong trình t�. �áng chú ý là m�t �o�n ch�a 30 axit amin �ư�c kéo dài v� phía ��u N-t�n c�a vùng �ư�c cho là g�n màng và �o�n này v�n còn l�i trong phân t� thành th�c ngo�i tr� methionin � ��u. M�c dù ch�c n�ng c�a �o�n này v�n chưa �ư�c làm rõ nhưng �áng chú ý r�ng domain �ư�c gi� ��nh là g�n màng này �ư�c b�o v� bên sư�n b�i các axit amin tích �i�n; ví d�: - QR :::: RK - trong S. cerevisiae Cyt-P45014DM. �i�u �ó g�i ý r�ng �o�n này có th� không �ư�c g�n vào màng cùng v�i �o�n �ư�c cho là g�n màng. S� kéo dài như v�y c�ng �ư�c th�y trong Cyt-P450alk. Nhưng không tìm th�y � Cyt-P450 ��ng v�t có vú. Tóm l�i, s� kéo dài � ��u N- t�n này �ư�c coi là riêng bi�t cho Cyt- P450 � n�m men, và cách th�c g�n màng � Cyt-P450 n�m men có khác gì �ó v�i � Cyt-P450 ��ng v�t có vú. Theo nghiên c�u c�a Chen và cs. nh�ng Cyt-P45014DM t� S. cerevisiae và C.tropicals có 343 (66,6% ) trùng kh�p và 119 (23,1%) các axit amin �ư�c thay
  6. 84 Nguy�n Th� Ng�c Dao th� b�o t�n và 4 vùng tương ��ng cao �ã �ư�c xác ��nh. M�t trong s� �ó là vùng liên k�t �ư�c gach dư�i và nh�ng vùng khác �ư�c coi là liên quan v�i v� trí chính xác m�c dù v�n chưa �ư�c x�p lo�i. �i�u �áng k� là s� thay th� ch� m�t g�c axit amin (310G D) trong vùng �ư�c xác ��nh l�n nh�t (t� 290N ��n 332E trong phân t� S. cerevisiae) �ã t�o ra m�t d�ng không ho�t ��ng c�a Cyt- P45014DM �ư�c g�i là Cyt-P450SGI. Trình t� axit amin c�a Cyt- P45014DM và Cyt-P450cam g�i ý r�ng vùng này bao g�m trình t� �áp �ng cho helix I ho�c helix xa c�a Cyt-P450cam. S� d�ng máy tính có thêm h� th�ng "SCADS" mô hình hóa phân t� �ư�c phát tri�n b�i Vi�n Suntory trong nghiên c�u v� sinh y h�c và s� li�u c�a phân tích tinh th� Cyt-P450cam, ngư�i ta �ã d� �oán r�ng trong phân t� Cyt-P450SGI ��t bi�n không ho�t ��ng, m�t histidin � vùng này (317-H) có th� tác ��ng v�i s�t hem như là ph�i t� th� 6 trans vào thiolate và s� tác ��ng này �ã �ư�c kh�ng ��nh b�i phân tích quang ph� c�a phân t� Cyt-P450SGI �ã tinh s�ch. �i�u �ó g�i ý r�ng vùng này ph�i �ư�c ��nh v� � g�n v�i m�t ngo�i biên c�a hem và có th� bao g�m m�t ph�n c�a v� trí ho�t ��ng. Cyt-P45014DM nh là mFc tiêu cHa nh:ng tác nhân ch#ng n&m Azole M�t s� nh�ng d�n xu�t triazol và imidazol �ã �ư�c s� d�ng như là tác nhân có kh� n�ng ch�ng n�m trong y h�c và l�nh v�c nông hóa, chúng �ư�c g�i là nh�ng tác nhân azole kháng n�m. T�t c� nh�ng h�p ch�t này ��u có th� n�ng �c ch� enzyme lanosterol 14 - demethylase t�o ra h�n h�p l�p th� v�i Cyt-P45014DM. S� �c ch� enzyme Cyt-P450 14-DM gây ra s� �ào th�i ergosterol và làm � ��ng 14-methyl sterol trong các t� bào. Bi�n ��i trong s� t�o thành sterol, ��c bi�t là tích l�y 14-methyl sterol gây ra s� xáo tr�n hàng lo�t v� ch�c n�ng c�a màng, d�n t�i �c ch� t� bào phát tri�n ho�c ch�t. Tóm l�i, Cyt-P45014DM là �ích ��u tiên c�a tác nhân azole kháng n�m. S� phát tri�n nh�ng thu�c có hi�u qu� và an toàn có th� �ư�c áp d�ng m�t cách h� th�ng là m�t trong nh�ng v�n �� quan tr�ng nh�t trong hóa tr� li�u �� h�n ch� s� nhi�m các n�m khác � nh�ng b�nh nhân b� suy gi�m mi�n d�ch. M�c dù nh�ng d�n xu�t azole �ư�c coi là có th� tr� thành m�t trong nh�ng nhóm tri�n v�ng nh�t trong nh�ng tác nhân kháng n�m h� th�ng, v�n còn nguy cơ c�a ph�n �ng có h�i d�n t�i �c ch� các Cyt-P450 c�a v�t ch�. Tuy v�y, s� phát tri�n m�t tác nhân azole kháng n�m có s� l�a ch�n cao
  7. Ch ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 85 ��i v�i Cyt-P45014DM v�n �ư�c ch� ��i m�t cách háo h�c. Cơ s� cho �i�u này là nh�ng phân tích trư�c �ây v� c�u trúc v� trí ho�t ��ng c�a Cyt-P45014DM c�a n�m giúp cho s� thi�t k� nh�ng phân t� tác nhân azole kháng n�m. Cyt-P450(alk) (alkan terminal hydroxylase) cHa n&m men a dMu hNa Bư�c ��u tiên c�a s� chuy�n hóa alkan b�i nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan là s� th�y phân các alkane thành các alkanol. Ph�n �ng này �ư�c xúc tác b�i m�t lo�i Cyt-P450 khác �ư�c g�i là Cyt- P450alk. Cyt-P450alk �ư�c t�o ra ch� trong nh�ng t� bào phát tri�n nh� alkan � nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan và không tìm th�y trong nh�ng n�m men khác như là Saccharomyces sp. ho�c nh�ng t� bào phát tri�n nh� glucose c�a n�m men tiêu hóa alkan. Cyt- P450alk �ã �ư�c tinh ch� t� nh�ng t� bào phát tri�n �ư�c nh� alkan c�a C.maltosa EH15, t� bào này trư�c �ây �ư�c g�i là Lodderomyces elongisporus và �ã �ư�c ��c trưng. Genomic DNA ��i v�i Cyt-P450alk �ã �ư�c dòng hóa t� C.maltosa IAM 12247. C.maltosa EH15 và C.tropicals, s� trùng h�p b�c 1 c�a Cyt-P450alk v�i nh�ng Cyt-P450 khác là th�p và Cyt-P450alk �ư�c x�p lo�i như là m�t gia �ình gen CYP52 riêng bi�t b�i Nebert và cs. Tính không PQng nh&t phân tS Tr�ng lư�ng phân t� c�a các Cyt-P450alk �ư�c tính toán ��a vào c�u trúc b�c 1 là 59838 (523 axit amin) cho C. IAM maltosa 12247, 59705 (521 axit amin) cho C.maltosa EH15 và 63200 (543 axit amin) cho C.maltosa, g�n 60% các axit amin là gi�ng nhau và kho�ng 25% �ư�c b�o t�n. Sanglard và Fiechter phát hi�n gen Cyt-P450 khác có 70% s� ��ng nh�t v�i gen Cyt-P450alk �ã nêu � trên c�a C.tropicals trong cùng m�t thư vi�n gen và phân ��nh rõ enzyme này v�i nh�ng Cyt-P450alk trư�c �ây là Cyt-P450alk2 và - Cyt-P450alk3, m�t cách tương �ng. Seghezzi và cs. công b� r�ng gen Cyt-P450alk2 là m�t protein ch�a 522 axit amin. Kích thư�c phân t� c�a Cyt-P450alk2 có th� so sánh v�i kích thư�c c�a C.maltosa Cyt-P450alk. Sanglard và cs. xác ��nh r�ng TLPT trên �i�n di c�a Cyt-P450alk �ư�c tinh s�ch t� C.tropicals th�p hơn �áng k� so v�i protein c�a Cyt-P450alk1 �ư�c bi�u hi�n trong S. cerevisiae. Tuy nhiên, Cyt-P450alk1 �ư�c bi�u hi�n �ã không xúc tác �ư�c ph�n �ng th�y phân alkan mà l�i th�y phân - laurate,
  8. 86 Nguy�n Th� Ng�c Dao g�i ý r�ng Cyt-P450alk2 xúc tác s� th�y phân alkane. Tóm l�i, Cyt- P450alk2 tương t� v�i Cyt-P450alk chuy�n hóa chính alkane c�a C.tropicals và có th� �ư�c dòng hóa tr�c ti�p t� Cyt-P450 c�a C.maltosa. �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P450alk c�a C.tropicals bao g�m ít nh�t hai thành viên khác nhau. Sanglard và cs g�i ý r�ng chúng có th� �ư�c t�o ra b�i s� c�p �ôi gen m�t cách n�i ti�p vì Cyt-P450alk và alk2 ch� cách nhau m�t Kb trên cùng m�t nhi�m s�c th�. Thu;c tính phân tS và thu;c tính xúc tác Như trong trư�ng h�p c�a Cyt-P45014DM, Cyt-P450alk có m�t nhánh ưa nư�c trư�c �o�n �ư�c cho là g�n màng � vùng N- t�n và �o�n này v�n �ư�c gi� l�i trong phân t� thành th�c ngo�i tr� methionin g�n � ��u. �i�u thú v� là, �o�n �ư�c cho là g�n màng c�a Cyt-P450alk �ã �ư�c chia thành hai nhánh và c� hai �ư�c che ch�n b�i các axit amin tích �i�n . Cyt- P450alk �ư�c tinh ch� t� C.maltosa bi�u hi�n sóng h�p th� ��c trưng c�a m�t Cyt-P450 spin th�p. Sóng h�p th� c�a ph�c h�p kh� v�i CO �ã �ư�c công b� là � 447nm cho Cyt-P450 alk c�a C.maltosa EH15 ho�c 450nm cho Cyt-P450alk t� C.maltosa IAM 12247. Phân tích quang ph� c�a microsome t� nh�ng t� bào C.tropicals m�c trên tetradecane g�i ý r�ng Cyt-P450alk tác ��ng v�i m�t s� ph�i t� ngo�i lai m�c dù không có s� bi�n ��i quang ph� �ư�c phát hi�n d�a trên liên k�t v�i cơ ch�t c�a nó, n- tetradecane. M�c khác, Cyt-P450alk �ư�c tinh ch� m�t ph�n t� C.guilliermondic �ã �ư�c công b� th� hi�n bi�n ��i quang ph� typI d�a trên liên k�t v�i hexadecane. M�t h� th�ng tái l�p ch�a Cyt-P450alk và NADPH-P450- reductase t� C.maltosa EH15 xúc tác s� th�y phân ban ��u c�a hexadecane, s� kh� b�ng enzyme Cyt-P450alk trong h� th�ng tái l�p ph� thu�c vào s� có m�t c�a cơ ch�t như là trong trư�ng h�p c�a Cyt-P45014DM. M�t s� công b� g�i ý kh� n�ng là Cyt- P450alk xúc tác s� th�y phân � ho�c �-1 c�a acid béo b�c cao và chuy�n hóa m�t s� cơ ch�t là thu�c. Tuy nhiên, s� ��c hi�u cơ ch�t c�a Cyt-P450alk không �ư�c nghiên c�u th�t tích c�c và c�n ph�i có nh�ng nghiên c�u chính xác hơn v�i ch�t li�u tinh ch�, b�i vì Cyt-P450alk xu�t hi�n dư�i nhi�u d�ng. Cyt-P450alk1 �ư�c dòng hóa và �ư�c bi�u hi�n và Cyt-P450alk2 t� ra có s� ��c hi�u cơ ch�t khác nhau như ý ki�n �ã nêu � trên.
  9. Ch ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 87 M;t Cyt-P450 Páp Tng cho sU hoVt hóa các ch&t gây P;t biWn hóa hXc Ngư�i ta �ã công b� r�ng, n�m men có th� ho�t hóa m�t s� ch�t gây ��t bi�n hóa h�c. M�t s� Cyt-P450 có th� �áp �ng cho s� ho�t hóa này �ã �ư�c tinh ch� t� S. cerevisiae. Cyt-P450 này (còn �ư�c g�i là P448) �ã có m�t TLPT bi�u ki�n là 55.500. Cyt-P450 này th� hi�n ho�t tính th�y phân benzo(1)pyrene trên h� th�ng tái l�p v�i Cyt-P450-NADPH-Reductase, s� bi�n ��i quang ph� typ I d�a trên liên k�t v�i benzo(a)pyrene, m�t s� cơ ch�t thu�c và lanosterol. M�c dù s� �áp �ng c�a Cyt-P450 ��i v�i chuy�n hóa oxy hóa các ch�t gây ung thư b�i n�m men có th� là ch�c ch�n, s� xác ��nh nó như là m�t lo�i Cyt-P450 riêng bi�t v�n chưa ��t �ư�c. �áng chú ý là hàm lư�ng Met. và Cys c�a Cyt-P450 này khác �áng k� so v�i nh�ng Cyt-P45014DM . Ví d�, hàm lư�ng Met và Cys c�a Cyt- P450 này �ư�c tính toán t� thành ph�n axit amin là 7/407 và 8/407, m�t cách tương �ng, trong khi Cyt-P45014DM �ư�c xác ��nh t� c�u trúc b�c m�t là 18/530 và 4/530, m�t cách tương �ng. M;t Cyt-P450 duy nh&t cHa Phodotorunla minuta xúc tác sU tVo thành isobuten tY isovaleric acid. Fujii và cs công b� r�ng m�t Cyt-P450 �ã �ư�c t�ng h�p b�i phenylalanine trong t� bào c�a R.minuta phát tri�n � �i�u ki�n hi�u khí (60h) v�i ho�t tính t�o thành isobutene. Vì isobutene �ư�c t�o thành t� L-Leu qua axit isovaleric, Cyt-P450 này �ư�c cho là s� �áp �ng ��i v�i s� chuy�n hóa c�a isovaleric axit �� thành isobutence (H.4.7). M�i �ây, các microsome tách t� nh�ng t� bào R.minuta �ư�c kích thích s�n xu�t b�i phenylalanin xúc tác s� chuy�n hóa c�a axit isovaleric thành isobutene trong s� có m�t c�a NADPH và O2, và ho�t tính b� �c ch� b�i CO và VTMK3, do c�n tr� quá trình chuy�n �i�n t� t� Cyt-P450 reductase t�i Cyt-P450. Như v�y, s� có m�t c�a m�t Cyt-P450 trung gian chuy�n hóa axit isovaleric thành isobutene trong microsome c�a t� bào R.minuta �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i phenylalanin �ã �ư�c kh�ng ��nh. M�i �ây, Fujii và cs �ã phân l�p �ư�c Cyt-P450 có m�t d�ng ��ng nh�t khi �i�n di. Cyt-P450 �ư�c tinh ch� �ã � tr�ng thái spin th�p và th� hi�n t�c �� hơi ch�m hơn tr�ng thái spin cao trong s� liên k�t v�i axit isovaleric. Tuy nhiên, chưa có thông tin nào v� thu�c tính xúc tác c�a nó.
  10. 88 Nguy�n Th� Ng�c Dao Trình t� 30 axit amin � ��u N-t�n c�a s�n ph�m tinh s�ch �ã �ư�c xác ��nh là GIVQEAAAFVGSLTQLAGAFAALVLAFH. Trình t� này là hoàn toàn khác v�i trình t� c�a nh�ng Cyt-P450 c�a n�m men �ã �ư�c bi�t. Tuy v�y, c�u trúc b�c 1 c�a vùng này là không b�o toàn gi�a nh�ng Cyt-P450 có cùng ch�c n�ng t� nh�ng ch�ng khác nhau và ngư�i ta không th� xác ��nh �ư�c là li�u Cyt- P450 này có cùng thu�c v� m�t gia �ình gen duy nh�t hay không. Không th�y có tín hi�u c�a búi (cluster) k� nư�c � �o�n liên k�t màng �ư�c tìm th�y trong trình t� axit amin ��u N-t�n � trên. �i�u này g�i ý r�ng m�t ph�n kéo dài trư�c vùng liên k�t vào màng �ư�c tìm th�y trong t�t c� các Cyt-P450 c�a n�m men cho ��n nay �ã �ư�c phân tích trình t� c�ng có th� có m�t trong Cyt-P450 này. S� chuy�n hóa axit isovaleric �� thành isobutene �ư�c coi là ho�c Cyt- P450 xúc tác s� kh� bão hòa v� trí �, � ti�p theo sau s� kh� carboxyl c�a �, � không bão hòa c�a axit carboxylic ho�c oxy hóa liên k�t C-C gi�ng như là bư�c cu�i cùng c�a s� demethyl hóa 14 �-lanosterol. Trong m�i trư�ng h�p, Cyt-P450 này là trung gian cho m�t ph�n �ng m�i chưa t�ng �ư�c công b� ��i v�i Cyt-P450. Cyt-P45022DS chuy[n hóa trung gian cho sU khS bão hòa v^ trí 22 cHa ergostadienol ho_c ergostenol S� t�o ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol là c�n thi�t cho s� sinh t�ng h�p ergosterol. Ph�n �ng này �ư�c xúc tác b�i nh�ng microsome n�m men, c�n có m�t NADPH và O2 và b� �c ch� b�i kháng th� kháng CPR c�a n�m men. Tuy nhiên, ph�n �ng này �ư�c coi là m�t ph�n �ng trung gian b�i m�t d�ng Cyt- P450 �ư�c h�p nh�t vào h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� � microsome. Vì có m�t ch�ng n�m men ��t bi�n ch� thi�u h�t ph�n �ng t�o ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol nên ph�n �ng này �ư�c coi là �ư�c xúc tác b�i m�t d�ng Cyt-P450 riêng bi�t �ư�c g�i là Cyt-P45022DS. Tuy v�y, Cyt-P450 này v�n chưa �ư�c tách chi�t và nh�ng thu�c tính xúc tác và phân t� c�a nó v�n chưa �ư�c làm rõ. 4.1.3. Cyt-P450 c a n m s i (Filamentous Fungi) Cyt-P450 cHa Fusarium oxysporum Shoun và cs �ã công b� r�ng F. oxysporum ch�a Cyt-P450 c� � microsome và phân �o�n hoà tan. �i�u �ó g�i ý r�ng m�t �o�n n�i
  11. Ch ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 89 màng ��nh v� � microsome thu� phân trung gian acid béo và m�t �o�n hoà tan có kh� n�ng do nitrate/nitrite kích thích t�ng h�p có th� là �áp �ng cho s� chuy�n hoá nitrate ho�c nitrite. Thêm n�a, ngư�i ta c�ng công b� r�ng d�ch chi�t không còn t� bào c�a F. oxysporum th� hi�n ho�t tính có th� coi là oxy hoá ��i v�i ch�t ngo�i lai. Cyt-P450 P ,c tinh chW tY phân PoVn hoà tan Hai ch� ph�m Cyt-P450 �ư�c coi là Cyt-P450A và B �ã �ư�c tinh s�ch t� ph�n hoà tan c�a F. oxysporum. Hai s�n ph�m này h�u h�t r�t gi�ng nhau tr� �i�m ��ng �i�n c�a chúng. TLPT bi�u ki�n c�a c� hai Cyt-P450 �ã �ư�c xác ��nh b�ng �i�n di PGE là 48.000 và 43.000 b�ng l�c gel, xác ��nh �ư�c b�n ch�t monomer c�a chúng trong ch� ph�m cu�i cùng không ch�a ch�t t�y. S� lư�ng các g�c axit amin �ư�c tính toán t� vi�c phân tích axit amin c�a Cyt-P450A và B là 427-8 cho TLPT là 48.000. D�ng oxy hoá c�a Cyt-P450A, B là trong tr�ng thái h�n h�p spin th� hi�n � ��nh h�p th� t�i 414nm v�i m�t vai � 390nm. ��nh h�p th� c�a h�n h�p v�i CO d�ng kh� �ư�c th�y � 447nm. C�n ph�i làm rõ li�u nh�ng Cyt-P450 này có ph�i d�ng hoà tan không, vì Shoun và các cs �ã công b� r�ng Cyt-P450 liên k�t microsome �ư�c gi�i phóng m�t ph�n vào phân �o�n hoà tan trong quá trình phân hu� t� bào. Cyt-P450A th� hi�n quang ph� phân bi�t typ I trên liên k�t v�i laurate. M�t cơ ch�t có th� c�a Cyt-P450 microsomal và kháng th� ��i v�i Cyt-P450 này �c ch� ho�t tính thu� phân laurate. M�t khác, ngư�i ta �ã công b� r�ng ��nh h�p th� c�a h�n h�p CO d�ng kh� c�a Cyt-P450 microsomal �ã �ư�c th�y � 450nm, trong khi d�ng hoà tan c�a chúng và ch� ph�m tinh s�ch l�i �ư�c th�y � 448 và 447nm (m�t cách tương �ng). Như v�y, không có m�t ch�ng minh ch�c ch�n nào cho s� trùng l�p c�a Cyt-P450A và Cyt-P450B. SU thu` phân acid béo Nh�ng d�ch chi�t không có t� bào t� F. oxysporum �ã chuy�n hoá thu� phân laurate và palmitate � v� trí -1, �-2 và �-3. S� tái l�p Cyt-P450 và CPR �ã �ư�c g�i ý d�a trên nh�ng tác ��ng �c ch� c�a CO và menadion, ch�t này �ư�c coi là ch�t �c ch� s� v�n chuy�n �i�n t� t� Reductase ��n Cyt-P450. Trên phân �o�n t� bào, ho�t tính này �ư�c tái t�o trong c� phân �o�n microsome và phân �o�n hoà tan. Tuy nhiên, ho�t tính trong phân �o�n hoà tan �ã �ư�c
  12. 90 Nguy�n Th� Ng�c Dao xem như là do s� gi�i phóng h� th�ng emzym t� microsome trong quá trình phân hu� t� bào. Nh�ng lo�i Cyt-P450 �áp �ng cho ho�t tính này v�n chưa �ư�c xác ��nh. Cyt-P450 hoà tan P ,c kích thích tbng h,p b%i Nitrat ho_c Nitrit S� phát tri�n c�a F. oxysporum khi có m�t nitrat ho�c nitrit và m�t ít oxy �ã t�o ra có th� coi là Cyt-P450 trong ph�n hoà tan c�a nh�ng t� bào này (b�ng 4.2). B ng 4.2. S� kích thích t�ng h�p Cyt-P450 hoà tan b�ng nitrat ho�c nitrit trong F. oxysposum ( t� công b� c�a Shoun và các cs) Nitơ vô cơ thêm vào S�c khí Hàm lư�ng Cyt-P450(nmol/mg protein) ( 0,2%) Phân �o�n tan Phân �o�n microsome NO th�p Kph 0,085 NaNO3 th�p 0,288 0,075 NaNO2 th�p 0,685 0,103 NH4CL th�p 0,0035 0,11 NaNO3 cao 0,013 0,014 NaNO2 cao kph 0,012 Chú thích: kph = không phát hi�n Vì s� c�m �ng t�ng h�p là ít �ư�c quan sát � Cyt-P450 microsomal dư�i �i�u ki�n này, nên Cyt-P450 �ư�c t�o ra �ã �ư�c coi là hoàn toàn n�m trong phân �o�n hoà tan. M�i �ây, Kizawa và cs �ã tách chi�t m�t dòng cDNA, �o�n này �ư�c cho là có mang trình t� mã hoá c�a Cyt-P450. cDNA này (CYP55) mã hoá cho m�t protein Cyt-P450 ch�a 403 axit amin và không có búi k� nư�c ��i v�i m�t �o�n liên k�t màng �ã �ư�c tìm th�y trong trình t�. Như v�y, Cyt-P450 mã hoá b�i gen này là tương t� v�i m�t protein hoà tan. S� kích thích t�ng h�p d� thư�ng và s� ��nh v� c�a Cyt-P450 này dư�ng như �ư�c d� �oán trư�c v� ch�c n�ng duy nh�t c�a nó. Shoun và các cs th�y r�ng ho�t tính kh� nitrit không tương t� �ã �ư�c kích thích t�ng h�p c�m �ng song song v�i Cyt-P450 hoà tan, g�i ý s� tham gia có th� c�a Cyt-P450 này vào ho�t tính xúc tác trên.
  13. Ch ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 91 Nh:ng Cyt-P450 khác và hoVt tính liên quan PWn Cyt-P450 cHa n&m s,i (Filamenrtous Fugi): SU demethyl hoá v^ trí 14 trong sinh tbng h,p sterol Tác nhân kháng n�m azole, nh�ng ch�t �c ch� có ti�m n�ng và ��c hi�u c�a lanosterol 14�-demethylase (P45014DM) c�a n�m men, �c ch� s� sinh t�ng h�p ergosterol b�i n�m s�i và tích lu� m�t s� 14- methyl sterol trong t� bào, g�i ý r�ng Cyt-P45014DM tham gia vào s� chuy�n nhóm c�a 14�-methyl trong n�m s�i. S� dư th�a sterol �ư�c tìm th�y trong nh�ng n�m men �ư�c x� lý v�i nh�ng tác nhân kháng n�m là lanosterol, trong khi � n�m s�i ch� có m�t ít lanosterol và m�t s� lư�ng l�n 24-methylne-24, 25-dilydro lanosterol �ã �ư�c tích lu� l�i. �i�u này g�i ý v� tính ��c hi�u cơ ch�t c�a Cyt-P45014DM t� Filamentous Fungi dư�ng như tác ��ng trên 24-methylene-24, 25-dihydro lanosterol như là cơ ch�t tr�i. SU tVo ra ch&t chuy[n hoá thT c&p Ambike và cs g�i ý v� s� tham gia c�a Cyt-P450 vào sinh t�ng h�p alkaloid b�i claviceps purpured d�a trên m�t �i�u là alkaloid �ư�c t�o thành t�ng lên song song v�i s� kích thích t�ng h�p Cyt- P450 b�i Phenobarbital. B�ng cách s� d�ng cùng m�t chi�n lư�c hi�u qu�, s� tham gia c�a Cyt-P450 vào s� t�o thành c�a Aflatoxin b�i Asp.parasiticus NRRL3240 c�ng �ư�c g�i ý. Murphy và cs c�ng công b� r�ng phân �o�n microsomal c�a Penicillum patulum ch�a m�t Cyt-P450 xúc tác s� chuy�n hoá c�a m-cresol thành m-hydroxybenzyl alcohol, ch�t này �ư�c coi là �ư�c t�o ra trong con �ư�ng sinh t�ng h�p c�a Paturin, m�t mycotoxin �ư�c t�o ra b�i n�m này. Phát hi�n này g�i ý r�ng Filamenrtous Fungi có nh�ng Cyt-P450 khác có ch�c n�ng trong s� t�o thành các ch�t chuy�n hoá th� c�p ��c trưng c�a chúng. M;t Cyt-P450 khS P;c cHa Phytoalexin pisatin: Mattheva và Van Etten th�y r�ng m�t n�m b�nh c�a th�c v�t là Nectria haematococca t�o ra Cyt-P450 xúc tác s� O-demethyl hoá c�a pisatin khi nó ti�p xúc v�i pisatin. Pisatin là m�t ch�t ��c do n�m phytoalexin t�o ra khi ��u Hà Lan � vư�n b� nhi�m n�m ngay t�i v� trí b� nhi�m, nhưng s�n ph�m phenolic c�a nó ít ��c hơn. Ho�t tính ��c hi�u c�a c�a pisatin demethyl hoá �ư�c quan sát trong nh�ng microsome tách t� s�i n�m �ư�c x� lý b�i pisatin là r�t cao (20nmol/min/mg protein microsome) và Km c�a nó ��i v�i pisatin
  14. 92 Nguy�n Th� Ng�c Dao �ư�c coi là th�p (
  15. Ch ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 93 4.1.4. +i,u hoà s- t.ng h p Cyt-P450 b i vi khu1n nhân th-c Nh�ng vi sinh v�t thay ��i ch�c n�ng chuy�n hoá ph� thu�c vào �i�u ki�n phát tri�n. Vì h�u h�t các Cyt-P450 c�a vi khu�n �ã bi�t ��u �áp �ng cho s� c�n thi�t chuy�n hoá �� phát tri�n dư�i nh�ng �i�u ki�n ��c bi�t, nên s� t�o thành nh�ng Cyt-P450 như v�y trong vi khu�n �ư�c coi là �ư�c �i�u hoà b�i nhi�u y�u t� khác nhau. Cyt-P450alk c�a Candida sp. �ư�c kích thích t�ng h�p m�t cách ��c hi�u b�i n-alkane. Phương pháp lai Northern xác ��nh rõ ràng r�ng s� t�ng h�p này �ư�c gây ra b�i s� t�ng quá trình sao chép gen P450alk b�i n-alkane. S� c�m �ng c�a Cyt-P450alk b�i n-alkane không �ư�c quan sát th�y khi môi trư�ng có �� glucose cho s� phát tri�n, kh�ng ��nh r�ng m�t cơ ch� �i�u hoà ki�m ch� b�i glucose c�ng x�y ra ��i v�i s� bi�u hi�n c�a gen Cyt-P450alk. S� t�ng h�p c�m �ng c�a Cyt-P450 b�i m�t y�u t� ��c hi�u c�ng �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� Cyt-P450 khác. Cyt-P450 t�o thành isobuten c�a R.minuta �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i phenylalanin và Cyt-P450 kh� methyl c�a pisatin � N. haemadococca �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i cơ ch�t c�a nó. S� thêm nitrat ho�c nitrit vào môi trư�ng nuôi c�y �ã kích thích t�ng h�p m�t d�ng Cyt-P450 hoà tan � F. oxysporum. S� t�ng h�p c�m �ng này c�a Cyt-P450 b�i ch�t ngo�i lai như là hoá ch�t gây ung thư và phenobarbital �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� ho�t ��ng ph� thu�c Cyt-P450 c�a n�m s�i. M�c Cyt-P450 trong t� bào S.cereviseac t�ng lên khi hàm lư�ng O2 th�p và n�ng �� glucose cao trong môi trư�ng nuôi c�y. Vì n�ng �� O2 và glucose �nh hư�ng ��n nhi�u quá trình chuy�n hoá c�a n�m men nên có th� là s� t�ng h�p c�m �ng Cyt-P450 là do �nh hư�ng tr�c ti�p c�a nh�ng y�u t� này. Liên quan v�i �i�u này là nh�ng phát hi�n dư�i �ây: M�c Cyt-P450 t�ng lên khi �c ch� sinh t�ng h�p protein ti th� b�i Chloramphenicol và tương t� như v�y c�ng �ư�c th�y gi�a cAMP và Cyt-P450. Như mô t� trong chương 5, h�u h�t các Cyt-P450 � ��ng v�t có vú là nh�ng enzyme có kh� n�ng �ư�c t�ng h�p c�m �ng và s� hi�u bi�t v� cơ ch� �i�u hoà bi�u hi�n gen c�a chúng �ã có nh�ng bư�c ti�n nhanh chóng. Các Cyt-P450 monooxygenase t�o thành m�t siêu gia �ình kh�ng l� bao trùm t�t c� th� nhân th�t và nhi�u d�ng trong s� �ó có kh� n�ng �áp �ng ��i v�i s� chuy�n hoá nh�ng phân t� th�p khác nhau c�n thi�t cho s� thích nghi v�i stress môi trư�ng. Ti�p �ó, s� �i�u hoà bi�u
  16. 94 Nguy�n Th� Ng�c Dao hi�n gen �� �áp �ng v�i các y�u t� ngo�i lai khác nhau có th� là m�t ��c trưng quan tr�ng. Như v�y nghiên c�u so sánh cơ ch� �i�u hoà bi�u hi�n gen � th� nhân th�t b�c cao và th�p có th� là quan tr�ng cho s� hi�u bi�t v� ti�n hoá c�a h� th�ng Cyt-P450 monooxygenase trong th� nhân th�t. 4.2. Nh:ng enzyme Cyt-P450 cHa vi khufn 4.2.1. Nh4ng enzyme Cyt-P450 c a vi khu1n: Cyt-P450cam Cyt-P450cam là h� th�ng Cyt-P450 vi khu�n �ư�c hi�u bi�t rõ nh�t v� m�i liên quan gi�a c�u trúc và ch�c n�ng (xem chương 1). 4.2.2. Campho 5-exo-hydroxylase: Cyt-P450cam N�m 1959, Gansalus và cs �ã phân l�p �ư�c Pseudomonas putida PPG1 (ATCC17453), ch�ng này phát tri�n trên ��a ch�a Camphor như là ngu�n carbon duy nh�t. S� oxy hoá Camphor �ư�c b�t ��u b�ng s� t�o ra 5-exo-hydroxy Camphor b�i m�t h� th�ng monooxygenase v�i s� k�t h�p nh�ng c�u t� oxy hoá kh�. H� th�ng này ��i v�i ph�n �ng exo-hydroxyl hoá c�a Camphor có 3 enzyme tham gia là: a) NADH-putidaredoxin reductase (PdR), 1FAD-protein (TLPT 45,547: 422 axit amin) �ư�c mã hoá b�i gen Cam A. b) Putidaredoxin (Pd) 1 protein oxy hoá kh� có Fe-S (TLPT 11,418) mã hoá b�i gen Cam B. c) Cyt-P450cam, m�t c�u t� teminal hydroxylase (MW: 46,538; 414 axit amin) mã hoá b�i gen Cam C. S� t�o thành tính enzyme c�a h� th�ng thu� phân Camphor ��u tiên tương t� như h� th�ng Cyt-P450SCC trong ti th� v� thư�ng th�n ��ng v�t tham gia vào s� chuy�n hóa chu�i bên c�a cholesterol. Bư�c ti�p theo là s� kh� hydro c�a 5-OH Camphor �� t�o ra 2,5-diketocamphane (h�p ch�t �ư�c xúc tác b�i F-dehydrogenase (MW: 38,377; 361 axit amin). Sau m�t s� bư�c, cu�i cùng Camphor �ư�c chuy�n hoá thành 3 phân t� acetat và m�t phân t� isobutylate. T�t c� các gen, tr� nh�ng gen cho bư�c cu�i cùng c�a nh�ng ph�n �ng k� trên �ư�c ��nh v� trong m�t plasmid l�n (240 Kb) �ư�c g�i là CAM. 4 enzyme, s�n ph�m c�a các gen cam A, B, C và D �ã �ư�c tìm th�y là �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i Camphor. Nh�ng gen
  17. Ch ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 95 này �ã �ư�c dòng hoá và ��c trình t�, k�t qu� ch� ra r�ng c�u t�o di truy�n c�a các gen Cam, ít nh�t, bao g�m Cam DCAB trong m�t búi gen và t�o thành Cam operon. Cam R, m�t gen �i�u hoà âm, ��ng trư�c gen Cam D và �ư�c phiên mã � v� trí ��i di�n tr�c ti�p v�i Cam operon. Ch�t kìm hãm, m�t protein dimeric (TLPT c�a m�t mer (�ơn phân) là 20,300; 186 acid amin) là �áp �ng cho Camphor, nó t�o ra m�t s� t�ng h�p c�m �ng c�ng h�p c�a các gen Cam DCAB. Ch�t kìm hãm �ã �ư�c tách ra, g�n k�t vào operator và tách r�i ra kh�i nó khi có m�t Camphor. Ngư�i ta nh�n th�y r�ng gen Cam R c�ng �ư�c �i�u hoà t� ��ng b�i chính ch�t �c ch� c�a nó. Nh�ng ch�t c�m �ng t�ng h�p khác nhau ��i v�i h� th�ng này �ã �ư�c công b� và ngư�i ta c�ng bi�t v� s� có m�t c�a m�t ch�t �c ch� chuy�n hoá ��i v�i s� t�ng h�p có tính enzyme . Promotor c�a Cam operon �ư�c xác ��nh gi�a các gen c�a Cam D và Cam R. RNA polymesase c�a E.coli liên k�t v�i vùng mà nơi �y có trình t� nucleotid là -35 (TTGACC) và -10 (TATGCT). Gen �i�u hành (operator) (m�t c�u trúc palindromic - g�p �ôi, ��i x�ng) trên vùng ch�a trình t� -10 và nucleotid b�t ��u (� v� trí: +1) c�a Cam operon, ch�t kìm hãm �ư�c tách ra liên k�t vào vùng operator này in vitro. V� trí liên k�t ribosom �ư�c gi� ��nh, có trình t� Shine -Dargarno, là tương t� trong m�i gen Cam, GAGG c�a Cam D, AGGAG cho Cam C, GGAG cho Cam A, GAGG cho Cam B. Mã kh�i ��u là ATG cho Cam B, C, D và GTG cho Cam A. M�t c�u trúc vòng và hình cu�ng �ã �ư�c tìm th�y � ��u c�a gen Cam A và m�t promoter �i�u hành có th� c�a P.putida trong vùng gi�a các gen A và B. M�t ch�ng E.coli s�n xu�t quá m�c enzyme Cyt-P450cam �ã �ư�c t�o ra và s� lư�ng enzyme trong m�t h� nuôi c�y t� bào có th� �ư�c phát hi�n b�ng quang ph� phân bi�t CO c�a môi trư�ng nuôi c�y s� d�ng ch�ng vi khu�n này. 4.2.3. C u trúc và ch c n8ng c a Cyt-P450cam Cyt-P450cam �ư�c s�n xu�t b�i P. putida �ó là m�t trong nh�ng h� th�ng t�t �� nghiên c�u m�i liên quan c�u trúc-ch�c n�ng c�a Cyt-P450 vì nó không liên k�t màng và có kh� n�ng thu �ư�c m�t lư�ng l�n m�t cách ��c bi�t sau khi gen �ư�c dòng hoá. Nh�ng
  18. 96 Nguy�n Th� Ng�c Dao nghiên c�u c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái P450cam, không và có liên k�t v�i cơ ch�t, liên k�t v�i CO cho phép s� d�ng các ��t bi�n ��c hi�u v� trí c�a protein này. (xem Chương 2). 4.2.4. M:i liên quan gi4a c u trúc và ch c n8ng c a Cyt-P450cam Như �ã nêu � trên, c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái c�a Cyt-P450cam t�o cho chúng ta kh� n�ng s� d�ng s� ��t bi�n v� trí ��c hi�u ��i v�i protein này. Th�c ra, m�t s� nghiên c�u �ã thành công trong vi�c thu nh�n m�t s� ��t bi�n c�a Cyt-P450cam và c�a nh�ng Cyt-P450 khác. Tuy nhiên, Cyt-P450cam �òi h�i nhi�u hơn hai c�u t� Pd và PdR, nhưng nh�ng protein này �ã không k�t tinh �ư�c và liên k�t gi�a ba protein v�n còn chưa �ư�c xác ��nh. �� t�p h�p nhi�u Cyt-P450 ��t bi�n bao g�m nh�ng ��t bi�n không th� liên k�t v�i Pd và (ho�c) PdR, nh�ng ý �� �ã �ư�c th�c hi�n �� phân l�p nh�ng ��t bi�n �ư�c kích thích t�ng h�p b�i hydroxylamine (in vitro x� lý ��i v�i DNA gen c�a Cam C), nh�ng t� bào có ��t bi�n này không th� m�c v�i Camphor nhưng có th� m�c v�i 5-exo-hydroxy Camphor và có kh� n�ng t�o ra protein Cyt- P450cam không có ho�t tính oxygen hóa trong s� có m�t c�a Pd và PdR. Trong trư�ng h�p Cyt-P450d t� microsome chu�t, Shimizu và cs công b� r�ng gi�ng như nh�ng protein Cyt-P450cam bi�n ��i nêu � trên, protein C(456)E và C(456)4 và G(458)E (C(456) �áp �ng cho C537 c�a Cyt-P450cam �ã không tham gia vào vi�c gi� hem. K(452)E th� hi�n m�t quang ph� phân bi�t CO sau khi b� kh� b�i dithionit nhưng không th� hi�n quang ph� b�i s� kh� trong �i�u ki�n tái t� h�p l�i, g�i ý r�ng Lys (453) tham gia vào s� t�o thành m�t h�p ch�t v�n chuy�n �i�n t� n�i phân t� (gi�ng như R112C c�a P450cam. Enzyme Cyt-P450d t� nhiên có c� hai ho�t tính Benzphetamin N-demethylation và 7-ethoxycoumarin O- dealkylation, nhưng m�t �i�u thú v� là, G(450)S protein ch� m�t ho�t tính th� hai trong khi I(457)S ch� m�t ho�t tính th� nh�t. R(455)G protein th� hi�n m�t ho�t tính th�p nh�t ��i v�i c� hai cơ ch�t. Nh�ng ��t bi�n nhân thơm như là F(425)L, P(427)L và F(430)L protein t� ra ho�t tính th� nh�t r�t th�p (10%) nhưng ho�t tính th� hai l�i r�t cao (250%). Như v�y s� bi�n ��i c�a vùng xa có th� �nh hư�ng ��n con �u�ng v�n chuy�n �i�n t� và m�t s� bi�n ��i nh� trong tính ��c hi�u cơ ch�t.
  19. Ch ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t 97 g;t biWn enh h %ng PWn sU vEn chuy[n Pi!n tS tY Pd (putidaredoxin) Enzyme R112C c�a Cyt-P450cam không có ho�t tính xúc tác, nhưng b�o t�n phân t� hem m�c dù hàm lư�ng hem là không bình thư�ng (10-15 nmol/mg protein, kho�ng 75% n�ng �� c�a lo�i enzyme t� nhiên). Quang ph� h�p th� c�a liên k�t CO-liên k�t O2 và d�ng ferric (có camphor ho�c không có camphor) c�a enzyme ��t bi�n là tương t� v�i k�t qu� thu �ư�c t� enzyme typ d�i. K�t qu� này g�i ý r�ng s� chuy�n �i�n t� ��u tiên ��n R112C protein t� Pd �ã b� khóa l�i. B�ng phân tích stopped flow s� d�ng Pd b� kh� và enzyme ��t bi�n cho th�y r�ng giá tr� c�a h�ng s� t�c �� b�c 1 là quá th�p; 0,1/giây ��i v�i ch�t ��t bi�n trong m�c �� phân t� (R>15) c�a Pd b� kh� ��n Cyt-P450cam, trong khi nó là 40/giây ��i v�i Cyt-P450cam typ d�i trong kho�ng R>5. Giá tr� th�p này c�a vi�c chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh� ��n enzyme ��t bi�n có th� là nguyên nhân cho s� m�t ho�t tính enzyme. Th� n�ng trung bình (Em) c�a protein ��t bi�n, s� d�ng safranin (Em = -225 mV) như là m�t ��i ch�ng, là -182mV, th�p �áng k� so v�i protein typ d�i (-138mV). Vì m�t trong nh�ng nhóm -NH2( 2) c�a guanidin và = NH( ) c�a Arg112 (trong helix C) �ư�c ��nh v� g�n m�t bên c�a b� m�t hình tam giác c�a v� trí xa hem, và nhóm -NH2( 1) khác c�a các d�ng Arg112 t�o thành liên k�t v�i OID c�a axit carboxylic c�a nhóm propionat hem, Arg112 có th� là r�t quan tr�ng ��i v�i s� chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh�, và vùng xung quanh nhóm Arg này có th� là m�t trong vùng h�p lý nh�t cho s� ti�p xúc v�i m�t Pd d�ng kh�, và m�t protein acid, qua tương tác axit-bazơ, và ��i v�i vi�c ch�p nh�n m�t �i�n t� t� m�t Pd d�ng kh�. Th�c ra, nhóm c�a Sligars �ã ch� ra r�ng nh�ng axit amin láng gi�ng c�a Arg112, như là Cys344 và Arg72, cùng ��nh v� trên m�t b� m�t, �óng vai trò quan tr�ng trong s� tương tác gi�a Cyt-P450cam và Pd. Ngư�i ta c�ng ghi nh�n r�ng Arg112 là m�t axit amin không bi�n ��i cao c�a gia �ình Cyt-P450. Vì v� trí duy nh�t c�a Arg112 như mô t� � trên, g�c này c�ng �óng m�t vai trò quan tr�ng trong s� chuy�n �i�n t� n�i phân t� ��n s�t hem. S� d�ng ��t bi�n v� trí tr�c ti�p c�a Cyt-P450d, Shimizu và cs �ã xác ��nh r�ng lysin � v� trí (94) (99) (105) (440) (453) và (463), m�t Arginin � v� trí (135) (136) (137) và (455) trong Cyt-P450d có
  20. 98 Nguy�n Th� Ng�c Dao th� tham gia vào s� ti�p xúc v�i m�t s� chuy�n �i�n t� t� reductase c�a nó. Ngư�i ta c�ng nh�n ra r�ng K(94) K(440) K(463) và R(136) c�a Cyt-P450d �áp �ng cho R72, K344 và R112 c�a Cyt-P450cam, m�t cách tương �ng. g;t biWn P#i vhi liên kWt oxygen M�t chuy�n ��ng v�n c�c b� và s� m� r�ng c�a h�c trung tâm (Gly 248-Thr 252) c�a helix I xa t�o nên m�t cái túi cho phân t� oxygen. Chu�i bên, m�t nhóm –OH c�a Thr 252, là không bình thư�ng trong vi�c là nó cho m�t liên k�t hydro v�i nguyên t� Cacbonyl oxygen c�a Gly 287 và psi angle (liên k�t C�-N) và psi angle (liên k�t C�-C) c�a Asp251 là -108 và 5o, m�t cách tương �ng. M�c dù c�u trúc tinh th� c�a d�ng oxy hóa v�n chưa �ư�c bi�t, phân t� oxygen �ư�c coi là �ư�c gói trong túi oxygen b�i nh�ng g�c acid amin � vùng này. Trong s� nh�ng g�c không phân c�c, Asp251 ��ng ra ngoài ch� như m�t g�c ion hóa, và v� trí này ch� y�u là Asp ho�c Glu trong gia �ình Cyt-P450. Thr 252 h�u như không bi�n ��i trong các Cyt-P450 nh�n ch�c n�ng như là m�t ch�t cho proton và/ ho�c m�t ch�t xúc tác acid bazơ trong bư�c chuy�n hóa liên k�t O-O c�a ph�n �ng monooxygenase. Thr 252 �ã bi�n ��i thành A, V ho�c S. T�t c� nh�ng enzyme bi�n ��i trong s� có m�t c�a d-camphor ��u t�n t�i quang ph� h�p th� h�u h�t khác bi�t v�i quang ph� c�a enzyme d�i trong nh�ng d�ng ferric, ferrous, oxygen hóa và CO-ferrous. Trong m�t h� th�ng tái l�p v�i Pd và PdR, enzyme alanin tiêu th� O2 � m�t m�c �� (1100/p'/hem)có th� so sánh v�i t�c �� c�a enzyme d�i (1330/p'/hem) nơi s� lư�ng 5-exo-hydroxycamphor �ư�c t�o thành ít hơn 10% so v�i s� t�o thành b�i enzyme d�i. Kho�ng 85% oxy �ư�c tiêu th� �ã �ư�c tái t�o dư�i d�ng hydroxy peroxide. Enzyme valin th� hi�n nh�ng ��c tính tương t�, nhưng enzyme serin �ư�c t�n t�i th�c t� cùng m�t ho�t tính monooxygenase như là ho�t tính c�a enzyme d�i. Vì t�c �� t� oxy hóa c�a nh�ng (E) ��t bi�n là quá th�p �� tính toán t�c �� tiêu th� oxygen toàn b�, s� t�o thành H2O2 �ư�c coi là không b�i ngu�n này mà do s� phá v� c�u trúc c�a m�t h�n h�p peroxid �ư�c t�o ra b�i s� kh� c�a d�ng b� oxygen hóa t� Pd b� kh�. 252G, P ho�c C enzyme th� hi�n ��c tính tương t� v�i ho�t tính c�a (E) 252A trong khi 252N (E) thì tương t� v�i typ d�i. Như v�y, nhóm OH c�a Thr252 �óng vai trò quy�t ��nh trong s� phân
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
3=>0