Đa hình thái đơn gen ADH1C trong ung thư tế bào gan nguyên phát

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ĐA HÌNH THÁI ĐƠN GEN ADH1C<br /> TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN NGUYÊN PHÁT<br /> Uông Thị Thu Hương1, Trần Huy Thịnh1,<br /> Trần Vân Khánh1, Nguyễn Thanh Bình1, Vũ Trường Khanh2<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại Học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Bạch Mai<br /> <br /> Enzyme có liên quan đến chuyển hóa rượu là alcohol dehydrogenase (ADH). ADH có nhiều isozyme<br /> được mã hóa bởi nhiều gen khác nhau. Các alen ADH1C mã hóa cho các enzyme ADH có hoạt tính khác<br /> nhau và kết quả là tốc độ phản ứng từ rượu chuyển thành acetaldehyde sẽ khác nhau. Alen ADH1C*1 của<br /> gen ADH1C mã hóa cho enzym có khả năng tạo nồng độ acetaldehyde rất cao. Hơn nữa, có mối liên quan<br /> giữa alen ADH1C*1 và một số loại ung thư có liên quan đến sử dụng rượu hiện vẫn còn đang bàn cãi.<br /> Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Xác định tỷ lệ kiểu gen và alen của gen ADH1C trên bệnh nhân<br /> ung thư gan nguyên phát. Đa hình ADH1C được xác định bằng kỹ thuật PCR-RFLP (PCR-Restriction<br /> fragment length polymorphism). Kết quả tỉ lệ kiểu gen ADH1C*1/*1, ADH1C*1/*2, ADH1C*2/*2 của nhóm<br /> ung thư tế bào gan nguyên phát là 90%, 8,0%, 2,0% và nhóm chứng là 79,3%, 20,0%,0,7%. Kiểu gen<br /> ADH1C*1/*1 và Alen ADH1C*1 trong nhóm bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát cao hơn trong<br /> nhóm chứng với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với OR 2,34 (CI, 1,2 - 4,55), 1,87 (1,02 - 3,41). Bước<br /> đầu khẳng định kiểu gen ADH1C*1/*1 và Alen ADH1C*1 là yếu tố nguy cơ độc lập với ung thư gan<br /> nguyên phát ở bệnh nhân có sử dụng rượu.<br /> Từ khóa: gen ADH1C, đa hình kiểu gen, ung thư gan tế bào gan nguyên phát<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ung thư gan nguyên phát là một trong<br /> những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế<br /> giới, bệnh thường được phát hiện muộn, tiên<br /> lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao, thời gian<br /> sống của người bệnh kể từ thời điểm phát<br /> hiện bệnh ngắn [1; 2]. Nghiện rượu mạn tính<br /> là nguyên nhân chính gây ung thư gan [3; 4].<br /> Một vài nghiên cứu đã chỉ ra cùng lượng rượu<br /> tiêu thụ nhưng nguy cơ ung thư là khác nhau<br /> giữa mỗi cá thể, vậy ngoài yếu tố rượu tác<br /> động gián tiếp gây ung thư thì yếu tố di truyền<br /> đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành<br /> các loại hình ung thư [5; 6]. Gen ADH1C có<br /> các đa hình thái đơn (SNP) tạo ra các isoenĐịa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường<br /> Đại học Y Hà Nội<br /> Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn<br /> <br /> zym có thuộc tính động học khác nhau. Đa<br /> hình thái của gen mã hóa cho các enzym<br /> ADH1C làm cho các enzym có hoạt tính thay<br /> đổi nên nồng độ acetaldehyde (AA) tạo ra<br /> khác nhau. Chất AA là chất trung gian được<br /> tạo ra trong quá trình chuyển hóa rượu, đây<br /> là chất độc và được chứng minh là chất gây<br /> ung thư [5; 7]. Đã có nhiều nghiên cứu về<br /> các đa hình kiểu gen ADH1C trên các loại<br /> hình ung thư khác nhau, được thực hiện trên<br /> thế giới [8 - 10]. Tại Việt Nam, nghiên cứu đa<br /> hình thái gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư<br /> gan chưa được tìm hiều một cách đồng bộ<br /> và bài bản. Vì vậy, nghiên cứu được thực<br /> hiện với mục tiêu: Xác định tỷ lệ kiểu gen và<br /> alen của gen ADH1C trên bệnh nhân ung thư<br /> gan nguyên phát.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> Ngày nhận: 26/9/2017<br /> Ngày được chấp thuận: 26/11/2017<br /> <br /> TCNCYH 109 (4) - 2017<br /> <br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> 1<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 150 bệnh nhân được chẩn đoán xác định<br /> và được theo dõi điều trị ung thư gan nguyên<br /> phát tại Bệnh viện K Trung ương từ tháng<br /> 1/2014 đến tháng 9/2014.<br /> 150 người mắc một số bệnh mạn tính<br /> khám tại phòng khám Nội tại Bệnh viện Xanh<br /> <br /> của bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên<br /> phát và người lành đối chứng.<br /> - Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ của<br /> DNA được tách chiết bằng phương pháp đo<br /> quang trên máy Nanodrop, dựa vào tỷ lệ<br /> A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0.<br /> <br /> Pôn Hà Nội. Đối tượng này được lựa chọn có<br /> sử dụng rượu được khám kết luận không mắc<br /> ung thư gan nguyên phát hay bất kỳ ung thư<br /> nào khác, tình nguyện tham gia nghiên cứu,<br /> được phỏng vấn và lấy mẫu cùng thời điểm<br /> thực hiện nghiên cứu.<br /> Các đối tượng nghiên cứu đều được khai<br /> thác tiền sử sử dụng rượu. Phương pháp đo<br /> lượng rượu tiêu thụ là hỏi trực tiếp bằng bảng<br /> câu hỏi QF [11].<br /> <br /> 2.3. Kỹ thuật PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism)<br /> Khuyếch đại đoạn gen ADH1C bằng máy<br /> PCR với cặp mồi đặc hiệu.<br /> Mồi xuôi: ADH3 ex8F: AAT AAT TAT TTT<br /> TCA GGC TTT AAG AGT AAA TAT TCT GT.<br /> Mồi ngược: ADH3 ex8R: AAT CTA CCT<br /> CTT TCC AGA GC.<br /> Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích<br /> <br /> Dựa vào số lần sử dụng rượu trong tháng,<br /> <br /> 20μl gồm: 10 μl Taq polymerase, 1μl mồi xuôi,<br /> <br /> thể tích cốc sử dụng, số gram rượu quy đổi<br /> <br /> 1μl mồi ngược, 2μl DNA và 6μl H2O. Chu trình<br /> <br /> của từng loại rượu sẽ tính được lượng rượu<br /> <br /> nhiệt của phản ứng PCR: [94oC/30 giây,<br /> <br /> tiêu thụ trong tháng và theo ngày.<br /> <br /> 54oC/30 giây, 72oC/30 giây] 37 chu kỳ. Bảo<br /> <br /> Mức độ tiêu thụ rượu được phân loại theo<br /> <br /> quản mẫu ở 15oC.<br /> <br /> hàm lượng tiêu thụ trong ngày: uống ít (nam ≤<br /> <br /> Sản phẩm PCR được điện di trên gel<br /> <br /> 40g, nữ ≤ 20g), uống vừa (nam 41 - 60g, nữ<br /> <br /> agarose 3% kiểm tra, sau đó được tiến hành<br /> <br /> 21 - 40g), nghiện rượu (nam ≥ 61g, nữ ≥ 41g).<br /> <br /> giải trình tự theo quy trình thường quy. Kết<br /> <br /> Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm<br /> Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại Học Y<br /> Hà Nội.<br /> 2. Phương pháp<br /> <br /> quả được so với trình tự Genebank.<br /> Đoạn gen được khuếch đại với cặp mồi<br /> đặc hiệu ADH3ex8F và ADH3ex8R là một<br /> đoạn dài 162 bp trên exon 8 của gen ADH1C,<br /> chứa SNP rs698. Vị trí SNP rs698 cách đầu<br /> <br /> Thiết kết nghiên cứu: nghiên cứu bệnh<br /> chứng.<br /> 2.1. Thu thập mẫu<br /> - Thu thập mẫu máu của bệnh nhân ung<br /> thư tế bào gan nguyên phát và mẫu chứng.<br /> <br /> 5' một đoạn 99 bp, cách đầu 3' một đoạn 62bp<br /> và cách vị trí cắt đối chứng của enzym SspI<br /> một đoạn 68 bp. Sản phẩm PCR sau khi<br /> enzym SspI cho hình ảnh đoạn gen trên<br /> điện di.<br /> Alen ADH1C*2: 2 đoạn gen kích thước<br /> <br /> 2.2. Tách chiết DNA<br /> <br /> 31bp và 131bp. Alen ADH1C*1: 3 đoạn gen<br /> <br /> - DNA được tách chiết theo phương pháp<br /> <br /> kích thước 31bp và 68bp, 63bp, trong đó đoạn<br /> <br /> phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi<br /> <br /> 68bp và 63bp trùng nhau cho hình ảnh 1 băng<br /> <br /> 2<br /> <br /> TCNCYH 109 (4) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> điện di.<br /> <br /> hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút khỏi<br /> <br /> Kiểu gen ADH1C*1/*1: 2 băng tương ứng<br /> <br /> nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham<br /> <br /> đoạn gen 63bp, 68bp và 31bp. Kiểu gen<br /> <br /> gia. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo<br /> <br /> ADH1C*1/*2: 3 băng tương ứng đoạn gen<br /> <br /> bí mật.<br /> <br /> 63bp, 68bp và 31bp, 131bp. Kiểu gen<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> ADH1C*2/*2: 2 băng tương ứng đoạn gen<br /> 131bp và 31bp.<br /> <br /> 1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu<br /> <br /> 2.4. Phân tích số liệu<br /> <br /> Đối tượng nghiên cứu gồm 150 bệnh nhân<br /> <br /> Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0<br /> để phân tích số liệu. Dùng kiểm định χ2 để so<br /> sánh tỷ lệ kiểu gen ADH1C của hai nhóm ung<br /> thư tế bào gan nguyên phát và nhóm chứng.<br /> Để ước tính mối liên quan giữa các kiểu gen<br /> và khả năng mắc ung thư tế bào gan nguyên<br /> phát dùng tỷ suất OR với khoảng tin cậy 95%.<br /> <br /> ung thư tế bào gan nguyên phát và 150 người<br /> bình thường làm đối chứng. Kết quả cho thấy<br /> không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê<br /> (p > 0,05) về độ tuổi và giới tính giữa hai<br /> nhóm bệnh và nhóm chứng. Điều này cho<br /> thấy với việc nhóm bệnh và nhóm chứng khá<br /> tương đồng nhau về tuổi và giới.<br /> Trong nhóm bệnh, tỉ lệ nam mắc bệnh cao<br /> <br /> Các kiểm định có ý nghĩa khi p < 0,05.<br /> <br /> hơn nữ (tỉ lệ nam/nữ 4,18/1). Sử dụng rượu<br /> <br /> 3. Đạo đức trong nghiên cứu<br /> <br /> với mức độ vừa và nghiện trong nhóm bệnh<br /> <br /> Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức<br /> <br /> chiếm tỉ lệ cao (tương ứng 40%, 36%). Tỷ lệ<br /> <br /> nghiên cứu trong Y học theo Quyết định<br /> <br /> bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát có<br /> <br /> số<br /> <br /> 188/HĐĐĐ-ĐHYHN,<br /> <br /> ngày<br /> <br /> 31/01/2013<br /> <br /> của Hội đồng Đạo đức Y học Trường Đại học<br /> <br /> HBV dương tính là khá cao chiếm tỉ lệ 66%<br /> (bảng 1).<br /> <br /> Y Hà Nội. Đối tượng tham gia nghiên cứu<br /> Bảng 1. Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu<br /> Bệnh<br /> <br /> Chứng<br /> <br /> Đặc điểm<br /> <br /> p<br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 121<br /> <br /> 80,7<br /> <br /> 131<br /> <br /> 87,3<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 29<br /> <br /> 19,3<br /> <br /> 19<br /> <br /> 12,7<br /> <br /> ≤ 40<br /> <br /> 20<br /> <br /> 13,3<br /> <br /> 11<br /> <br /> 7,3<br /> <br /> 40 - 60<br /> <br /> 93<br /> <br /> 62,0<br /> <br /> 86<br /> <br /> 57,3<br /> <br /> ≥ 60<br /> <br /> 37<br /> <br /> 24,7<br /> <br /> 53<br /> <br /> 35,3<br /> <br /> Nghiện<br /> <br /> 54<br /> <br /> 36,0<br /> <br /> 57<br /> <br /> 38,0<br /> <br /> Uống vừa<br /> <br /> 60<br /> <br /> 40,0<br /> <br /> 53<br /> <br /> 35,3<br /> <br /> Uống ít<br /> <br /> 36<br /> <br /> 24,0<br /> <br /> 40<br /> <br /> 26,7<br /> <br /> 99<br /> <br /> 66,0<br /> <br /> 84<br /> <br /> 56,0<br /> <br /> Giới<br /> <br /> Tuổi<br /> <br /> Sử dụng<br /> rượu<br /> <br /> 0,12<br /> <br /> Nhiễm HBV<br /> <br /> TCNCYH 109 (4) - 2017<br /> <br /> 0,06<br /> <br /> 0,69<br /> <br /> 0,08<br /> <br /> 3<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Đánh giá mối liên quan gen ADH1C với ung thư tế bào gan nguyên phát<br /> Kết quả kiểu gen ADH1C bằng phương pháp PCR-RFLP. Sau khi cắt sản phẩm khuếch đại<br /> của đoạn gen ADH1C, đem điện di trên gel agarose 3% thấy các băng rõ nét và phân tách rõ<br /> ràng, kích thước phù hợp với các đoạn gen bị cắt (hình 1).<br /> K21<br /> <br /> K22<br /> <br /> K23<br /> <br /> K24<br /> <br /> K25<br /> <br /> K26<br /> <br /> K61<br /> <br /> K62<br /> <br /> K63<br /> <br /> K64 K65 K66<br /> <br /> K27<br /> <br /> K28<br /> <br /> K29 K30<br /> <br /> K31<br /> <br /> M<br /> <br /> 131bp<br /> 63 - 68bp<br /> 31pb<br /> <br /> K67<br /> <br /> K68<br /> <br /> K69<br /> <br /> K70 K71<br /> <br /> M<br /> <br /> 131bp<br /> 63 - 68bp<br /> 31pb<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen ADH1C bằng enzym SspI<br /> mẫu bệnh nhân ung thư gan nguyên phát<br /> M: Marker 100bp; kiểu gen ADH1C*1/*1(K21- K29 và K31, K61, K64- K71), kiểu gen<br /> ADH1C*1/*2 (K30), kiểu gen ADH1C*2/*2 (K63).<br /> Sản phẩm cắt đoạn gen ADH1C bởi enzym SspI gồm các đoạn DNA có kích thước khác nhau<br /> gồm 131bp, 63 - 68bp, 31bp chứng tỏ sản phẩm PCR được cắt hoàn toàn bởi enzym SspI. Mẫu<br /> mang kiểu gen ADH1C*1/*1 gồm 2 băng DNA có kích thước 63 - 68bp và 31bp. Mẫu mang kiểu<br /> gen ADH1C*1/*2 gồm 3 băng DNA có kích thước 131bp và 63 - 68bp, 31bp. Mẫu mang kiểu gen<br /> ADH1C*2/*2 gồm 2 băng DNA có kích thước 31bp, 131bp.<br /> Nghiên cứu trên 300 mẫu trong đó 150 mẫu chứng và 150 mẫu bệnh được kết quả như sau:<br /> Kiểu gen ADH1C*1/*1 chiếm tỷ lệ cao trong cả nhóm bệnh (90,0%) và nhóm chứng (79,3%),<br /> trong khi tỷ lệ kiểu gen dị hợp ADH1C*1/*2 kiểu gen đồng hợp ADH1C*2/*2 tỷ lệ thấp. Kiểu gen<br /> đồng hợp ADH1C*2/*2 tỷ lệ rất thấp, nhóm bệnh gặp 3 trường hợp (2,0%) và nhóm chứng 1<br /> trường hợp (0,7%) (bảng 2).<br /> <br /> 4<br /> <br /> TCNCYH 109 (4) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 2. Tỷ lệ kiểu gen ADH1C của nhóm bệnh và nhóm chứng<br /> Kiểu gen<br /> <br /> Nhóm bệnh (n = 150)<br /> <br /> Nhóm chứng (n = 150)<br /> <br /> Nhóm nghiên cứu (n = 300)<br /> <br /> ADH1C*1/*1<br /> <br /> 135 (90,0%)<br /> <br /> 119 (79,3%)<br /> <br /> 254 (84,7%)<br /> <br /> ADH1C*1/*2<br /> <br /> 12 (8,0%)<br /> <br /> 30 (20,0%)<br /> <br /> 42 (14,0%)<br /> <br /> ADH1C*2/*2<br /> <br /> (2,0%)<br /> <br /> 1,0 (0,7%)<br /> <br /> 4 (1,3%)<br /> <br /> Bảng 3. Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C của nhóm bệnh và nhóm chứng<br /> Kiểu gen<br /> <br /> Nhóm bệnh<br /> <br /> Nhóm chứng<br /> <br /> p<br /> <br /> OR<br /> <br /> CI 95%<br /> <br /> ADH1C*1/*1<br /> <br /> 135 (90,0%)<br /> <br /> 119 (79,3%)<br /> <br /> 0,01<br /> <br /> 2,34<br /> <br /> 1,2 - 4,55<br /> <br /> ADH1C*1/*2 và<br /> ADH1C*2/*2<br /> <br /> 15 (10,0%)<br /> <br /> 31 (20,7%)<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 150 (100%)<br /> <br /> 150 (100%)<br /> <br /> ADH1C*1<br /> <br /> 282 (94,0%)<br /> <br /> 268 (89,3%)<br /> <br /> ADH1C*2<br /> <br /> 18 (6,0%)<br /> <br /> 32 (10,7%)<br /> <br /> 300 (100%)<br /> <br /> 300 (100%)<br /> <br /> 1,00<br /> <br /> Alen<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 0,039<br /> <br /> 1,87<br /> <br /> 1,02 - 3,41<br /> <br /> 1,00<br /> <br /> Tỷ lệ kiểu gen ADH1C*1/*1 ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng và có sự khác biệt có ý nghĩa<br /> thống kê với kiểu gen ADH1C*1/*2 và ADH1C*2/*2 với p = 0,01 và OR = 2,34; CI 95%<br /> (1,2 - 4,55).<br /> Alen ADH1C*1 có nguy cơ bị ung thư tế bào gan nguyên phát cao hơn alen ADH1C*2, sự<br /> khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,039; OR = 1,87 CI 95% (1,02 - 3,41).<br /> <br /> Hình 2. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen ADH1C<br /> của bệnh nhân ung thư gan nguyên phát K131 và K132<br /> Đoạn gen được khuếch đại là đoạn dài 162bp trên exon 8 của gen ADH1C, từ nucleotide vị trí<br /> thứ 1033 đến 1195, đa hình thái (SNP rs698) ở vị trí nucleotide 1133 trên phân tử mARN. Tại vị<br /> TCNCYH 109 (4) - 2017<br /> <br /> 5<br /> <br />