Đa hình nucleotid đơn R72P trên gen TP53 và đánh giá nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát ở người nhiễm hepatitis B virus

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ĐA HÌNH NUCLEOTID ĐƠN R72P TRÊN GEN TP53 VÀ ĐÁNH<br /> GIÁ NGUY CƠ MẮC UNG THƯ TẾ BÀO GAN NGUYÊN PHÁT Ở<br /> NGƯỜI NHIỄM HEPATITIS B VIRUS<br /> Trịnh Quốc Đạt, Trần Huy Thịnh<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Đa hình nucleotid đơn (SNP) R72P tại vùng exon 4 của gen áp chế ung thư TP53 liên quan đến sự<br /> hình thành và phát triển nhiều loại hình ung thư, trong đó có ung thư tế bào gan nguyên phát. Với mục đích<br /> tìm kiếm mối liên quan giữa các kiểu gen của SNP R72P và HBV trong sự hình thành khối u gan, chúng<br /> tôi tiến hành đánh giá khả năng mắc ung thư tế bào gan nguyên phát của các kiểu gen R72P ở những<br /> người nhiễm HBV mạn tính. Đối tượng nghiên cứu là 280 bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát trong<br /> đó có 171 trường hợp nhiễm HBV, nhóm chứng 267 đối tượng có 36 trường hợp nhiễm HBV. Sử dụng kỹ<br /> thuật enzym cắt giới hạn (RFLP) để phân tích kiểu gen của R72P, sau đó đánh giá tỷ lệ phân bố và khả<br /> năng mắc bệnh của các kiểu gen. Kết quả cho thấy, kiểu gen P72P của SNP R72P làm tăng khả năng<br /> mắc ung thư tế bào gan nguyên phát cho những người nhiễm HBV. OR = 3,23 ; 95% ; CI (1,12 – 9,45).<br /> Từ khóa: TP53 R72P, HBV, ung thư gan tế bào gan nguyên phát<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> TP53 là gen áp chế ung thư nằm tại vị trí<br /> p13.3 của nhiễm sắc thể số 17, mã hóa protein<br /> p53 có trọng lượng phân tử 53kDa - một<br /> protein trong nhóm điều hòa chu kỳ tế bào.<br /> TP53 hoạt động như một yếu tố phiên mã,<br /> đóng vai trò quan trọng trong các con đường<br /> chuyển hóa và một số quá trình hoạt động tế<br /> bào như: sửa chữa DNA, tạo mạch, kìm hãm<br /> <br /> được xem như gen ức chế khối u.<br /> Gần đây một trong những hướng nghiên<br /> cứu rất được quan tâm là các đa hình nucleotid<br /> đơn của TP53 có liên quan đến bệnh ung thư.<br /> Kết quả các nghiên cứu đã công bố cho thấy<br /> có hơn 200 SNP được tìm thấy trên vùng mã<br /> hóa và không mã hóa của gen TP53 [5; 6]. Các<br /> SNP này tạo ra các kiểu gen khác nhau của<br /> <br /> chu trình tế bào, tế bào chết theo chương trình<br /> [1 - 3]. Khi có tổn thương ở DNA, TP53 làm<br /> ngừng chu trình tế bào cho đến khi DNA bị tổn<br /> thương được sửa chữa hoặc TP53 có thể làm<br /> cho tế bào chết theo chương trình (apoptosis)<br /> nếu không còn khả năng sửa chữa DNA [3; 4].<br /> Chính những đặc tính sinh học này mà TP53<br /> <br /> TP53 trong cộng đồng. Các nghiên cứu cũng<br /> chỉ ra có sự khác nhau trong khả năng mắc ung<br /> thư của các kiểu gen. Đây được coi là những<br /> yếu tố nguy cơ cần được quan tâm. Một trong<br /> những SNP được biết đến nhiều nhất là R72P,<br /> đây là SNP ở vị trí codon 72 trên trên exon 4<br /> của gen TP53. Sự thay thế trình tự nucleotid<br /> tại codon 72 dẫn đến bộ ba CGC mã hóa cho<br /> arginin chuyển thành bộ ba CCC mã hóa cho<br /> prolin [6; 7]. Sự thay thế này dẫn đến có thể<br /> thay đổi khả năng bám của p53 đối với đoạn<br /> trình tự đặc hiệu tại gen đích, thay đổi quá<br /> trình hoàn thiện, tính ổn định của protein cũng<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh,<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn<br /> Ngày nhận: 21/4/2017<br /> Ngày được chấp nhận: 26/6/2017<br /> <br /> 16<br /> <br /> TCNCYH 108 (3) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> như thay đổi khả năng tương tác của p53 với<br /> các protein nội bào [2; 3]. Đây là những yếu tố<br /> nguy cơ cho sự ổn định tế bào và mầm mống<br /> cho sự xuất hiện ung thư.<br /> Virus viêm gan B từ lâu đã được khẳng<br /> định là một yếu tố nguy cơ gây ung thư tế bào<br /> gan nguyên phát [8; 9]. Việt Nam là quốc gia<br /> được WHO xếp vào vùng dịch tễ nhiễm virus<br /> viêm gan B cao nhất thế giới. Các kết quả<br /> nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã công bố<br /> SNP R72P của của gen TP53 liên quan đến<br /> nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát.<br /> Câu hỏi nghiên cứu được đặt ra là những kiểu<br /> gen của đa hình nucleotid đơn này có làm tăng<br /> khả năng mắc ung thư tế bào gan cho những<br /> người nhiễm HBV mạn tính hay không? Do đó<br /> nghiên cứu này được tiến hành nhằm đánh giá<br /> mối liên quan giữa đa hình nucleotid đơn R72P<br /> của gen TP53 với khả năng mắc ung thư tế<br /> bào gan nguyên phát ở bệnh nhân nhiễm HBV<br /> mạn tính.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> - 280 mẫu máu của bệnh nhân ung thư tế<br /> bào gan nguyên phát, đang điều trị tại khoa<br /> Nội Tiêu hoá bệnh viện Bạch Mai và Trung tâm<br /> Ung bướu Thanh Hoá từ tháng 11 năm 2013<br /> đến tháng 9 năm 2015.<br /> - 267 mẫu máu được lựa chọn ngẫu nhiên,<br /> của những người đến khám và điều trị một<br /> số bệnh mạn tính tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh<br /> Thanh Hoá được dùng làm nhóm đối chứng.<br /> Những bệnh nhân này được khám kiểm tra<br /> cận lâm sàng và kết luận là không mắc ung<br /> thư tế bào gan nguyên phát hay bất kỳ một loại<br /> hình ung thư nào khác.<br /> Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm<br /> Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y<br /> Hà Nội.<br /> 2. Phương pháp<br /> TCNCYH 108 (3) - 2017<br /> <br /> 2.1. Quy trình<br /> - Thu thập mẫu máu của bệnh nhân ung thư<br /> tế bào gan nguyên phát và mẫu chứng.<br /> - Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử xác<br /> định kiểu gen của SNP R72P.<br /> - Phỏng vấn tiền sử và hồi cứu bệnh án<br /> điều trị để xác định nhiễm HBV.<br /> - Sử dụng phần mềm thống kê để phân tích<br /> và xử lý kết quả.<br /> 2.2. Tách chiết DNA<br /> - DNA được tách chiết theo phương pháp<br /> phenol/chloroform từ máu ngoại vi của bệnh<br /> nhân Ung thư tế bào gan nguyên phát và<br /> người lành đối chứng.<br /> - Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ của<br /> DNA được tách chiết bằng phương pháp đo<br /> quang, dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8<br /> - 2,0.<br /> 2.3. Xác định kiểu gen TP53 tại codon 72<br /> Arg/72/Pro bằng kỹ thuật RFLP<br /> Khuyếch đại vùng gen chứa SNP R72P của<br /> gen TP53 bằng phương pháp PCR sử dụng<br /> cặp mồi đặc hiệu:<br /> Mồi xuôi:<br /> 5’- CTG GTA AGG ACA AGG<br /> GTT GG - 3’;<br /> Mồi ngược: 5’- ACT GAC CGT GCA AGT<br /> CAC AG - 3’.<br /> Sau khi được khuếch đại bằng cặp mồi đặc<br /> hiệu, sản phẩm PCR được kiểm tra và được<br /> cắt enzym giới hạn BstUI ở điều kiện 37oC<br /> qua đêm. Sản phẩm cắt được điện di cùng<br /> với thang chuẩn 100bp trên gel agarose 2%.<br /> Các băng DNA được nhuộm ethidium bromide<br /> và chụp ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging<br /> system. Đoạn gen được nghiên cứu chứa trình<br /> tự nhận biết của enzyme BstUI (CG CG) tại<br /> vị trí codon 72. Khi BstUI cắt đoạn gen sẽ tạo<br /> ra các đoạn DNA có kích thước 165 bp và 231<br /> bp, tương ứng với allen R72 (wild type-GG).<br /> Khi nucleotid G bị thay thế bởi C sẽ làm mất<br /> trình tự nhận biết của enzym BstUI, do đó đoạn<br /> 17<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> gen sẽ không bị cắt, tương ứng với allen P72<br /> (mutant type - CC). Do vậy, kiểu gen R72R sẽ<br /> có hai băng, kiểu gen P72P có một băng và<br /> kiểu gen R72P có ba băng trên hình ảnh điện<br /> di. Kết quả này, được kiểm tra lại bằng giải<br /> trình tự trực tiếp.<br /> <br /> mắc ung thư tế bào gan nguyên phát của<br /> người nhiễm HBV. Ước tính qua tỷ suất OR,<br /> với khoảng tin cậy ở mức ý nghĩa 95%.<br /> 3. Đạo đức trong nghiên cứu<br /> Đề tài đã được thông qua hội đồng đạo<br /> đức trong nghiên cứu y sinh học của Trường<br /> Đại học Y Hà Nội chấp thuận số 118/HĐĐĐĐHYHN. Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham<br /> gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui<br /> khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham<br /> <br /> 2.4. Phân tích số liệu<br /> Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16,0 để<br /> phân tích số liệu. Dùng kiểm định χ² để so sánh<br /> tỷ lệ kiểu gen SNP R72P giữa nhóm bệnh và<br /> chứng. Phân tích đa biến bằng phương trình<br /> hồi quy logistic đa biến để đánh giá mối liên<br /> quan giữa các kiểu gen R72P và khả năng<br /> <br /> gia vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân sẽ<br /> được đảm bảo bí mật.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> Bảng 1. Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu<br /> Bệnh<br /> <br /> Đặc điểm<br /> Giới<br /> <br /> Chứng<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 239<br /> <br /> 85,4<br /> <br /> 214<br /> <br /> 80,1<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 41<br /> <br /> 14,6<br /> <br /> 53<br /> <br /> 19,9<br /> <br /> Tuổi (năm)<br /> <br /> 57 ± 11,6<br /> <br /> 56 ± 15,5<br /> <br /> p<br /> 0,06<br /> 0,2<br /> <br /> Nghiện rượu<br /> <br /> 23<br /> <br /> 8,2<br /> <br /> 9<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> Nhiễm HBV<br /> <br /> 171<br /> <br /> 61,1<br /> <br /> 36<br /> <br /> 13,5<br /> <br /> Nhiễm HCV<br /> <br /> 12<br /> <br /> 4,3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1,5<br /> <br /> Trong 547 đối tượng nghiên cứu có 280 bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát và 267<br /> người đối chứng. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về độ tuổi trung bình<br /> và tỷ lệ giới tính của nhóm bệnh và nhóm chứng. Điều này đồng nghĩa với việc nhóm bệnh và nhóm<br /> chứng khá tương đồng nhau về tuổi, điều này phù hợp với một nghiên cứu bệnh chứng. Ngoài ra,<br /> kết quả cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ở nam cao hơn nữ rất nhiều, với 5,8 nam trên 1 nữ. Kết quả bảng<br /> 1 cho thấy tỷ lệ bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát có HBV dương tính khá cao, 171/280<br /> bệnh nhân, chiếm 61,1%. Đây là yếu tố được ghi nhận nhiều nhất trong số các yếu tố nguy cơ ung<br /> thư tế bào gan nguyên phát, được chúng tôi tìm kiếm. Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm HCV và nghiện<br /> rượu thấp hơn nhiều. Lần lượt là 4,3% và 8,2%.<br /> <br /> 18<br /> <br /> TCNCYH 108 (3) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> Hình 1. Sản phẩm cắt đoạn gen mang SNP R72P bằng enzym BstUI.<br /> MK: Thang chuẩn 100-1000bp; (+) mẫu đã biết trước kiểu gen dị hợp R72P (GC) làm chứng<br /> dương. Kiểu gen đồng hợp tử P72P (CC) có một vạch, xuất hiện ở mẫu chứng B85 và mẫu bệnh<br /> KG75, KG76. Kiểu gen dị hợp tử R72P (GC) có ba vạch, xuất hiện tại mẫu chứng B31, B33,<br /> B36 và mẫu bệnh KG85, KG87. Kiểu gen đồng hợp tử R72R (GG) có hai vạch xuất hiện tại mẫu<br /> chứng B35 và mẫu bệnh KG86.<br /> Bảng 2. Kiểu gen của SNP R72P và khả năng mắc ung thư tế bào gan nguyên phát<br /> của người nhiễm HBV<br /> Đa hình kiểu gen<br /> TP53<br /> R72P<br /> <br /> HBV (+)<br /> OR*<br /> <br /> CI (95%)<br /> <br /> HBV (-)<br /> OR*<br /> <br /> CI (95%)<br /> <br /> R72R<br /> <br /> 1,00<br /> <br /> 1,00<br /> <br /> R72P<br /> <br /> 1,43<br /> <br /> (0,51 – 4,01)<br /> <br /> 1,07<br /> <br /> (0,95 – 3,31)<br /> <br /> P72P<br /> <br /> 3,23<br /> <br /> (1,12 – 9,45)<br /> <br /> 1,39<br /> <br /> (0,99 – 2,71)<br /> <br /> * OR được điều chỉnh từ các biến: tuổi, giới, HBV, HCV, nghiện rượu, theo mô hình hồi quy<br /> logistic đa biến.<br /> Kết quả tại bảng 2 cho thấy, kiểu gen của SNP R72P của gen TP53 có liên quan với nguy cơ<br /> mắc Ung thư tế bào gan nguyên phát của người nhiễm virus HBV. Đặc biệt là kiểu gen P72P làm<br /> tăng khả năng mắc bệnh của những người nhiễm HBV lên một cách rất có ý nghĩa. OR = 3,23 ;<br /> 95% ; CI (1,12 – 9,45). Khi so sánh giữa nhóm nhiễm HBV với nhóm không nhiễm HBV, thấy có sự<br /> khác biệt tỷ suất OR của các kiểu gen SNP R72P.<br /> Bảng 3. So sánh nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát của các kiểu gen SNP R72P<br /> và các yếu tố nguy cơ<br /> Yếu tố nguy cơ<br /> <br /> OR*<br /> <br /> CI (95%)<br /> <br /> Nam giới<br /> <br /> 1,35<br /> <br /> (0,78 – 2,30)<br /> <br /> > 40 tuổi<br /> <br /> 2,26<br /> <br /> (1,33 - 2,86)<br /> <br /> TCNCYH 108 (3) - 2017<br /> <br /> 19<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> HBV (+)<br /> <br /> 11,67<br /> <br /> (7,48 - 18,23)<br /> <br /> HCV (+)<br /> <br /> 7,15<br /> <br /> (2,10 - 24,3)<br /> <br /> Nghiện rượu<br /> <br /> 3,72<br /> <br /> (1,50 – 9,21)<br /> <br /> Kiểu gen P72P<br /> <br /> 1,77<br /> <br /> (1,03 - 3,14)<br /> <br /> * OR được điều chỉnh từ các biến: tuổi, giới, HBV, HCV, nghiện rượu, theo mô hình hồi quy<br /> logistic đa biến.<br /> Kết quả trên cho thấy tỷ xuất OR của<br /> nhiễm HBV là cao nhất, của nam so với nữ<br /> là thấp nhất và không có ý nghĩa thống kê do<br /> khoảng tin cậy chứa 1. Tỷ suất OR của kiểu<br /> gen P72P cao hơn so với kiểu gen R72P là<br /> 1,77 lần một cách có ý nghĩa. Đây là tỷ suất<br /> OR chung cho cả nhóm đối tượng nghiên cứu.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Virus viêm gan B làm một yếu tố nguy cơ<br /> lớn nhất của ung thư tế bào gan nguyên phát<br /> trên phạm vi toàn thế giới. Việt Nam nằm trong<br /> vùng dịch tễ nhiễm HBV cao, nên số trường<br /> hợp ung thư tế bào gan nguyên phát có tiền<br /> sử nhiễm HBV cũng rất nhiều. Tuy nhiên, trên<br /> thực tế có nhiều trường hợp có tiền sử viêm<br /> gan virus B nhưng không tiến triển thành ung<br /> thư tế bào gan. Hoặc cùng nhiễm HBV nhưng<br /> có người khởi phát ung thư gan rất trẻ nhưng<br /> cũng có những người khởi phát chậm hơn.<br /> Các kiểu gen của TP53 có vai trò gì trong hiện<br /> tượng này không. Nhóm nghiên cứu đã tiến<br /> hành phỏng vấn tiền sử nhiễm virus của các<br /> đối tượng nghiên cứu và kết hợp với hồi cứu<br /> bệnh án điều trị của bệnh nhân ung thư gan.<br /> Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV rất cao trong<br /> nhóm bệnh. Sử dụng phân tích đa biến để tìm<br /> mối tương quan giữa các kiểu gen của SNP<br /> R72P với tình trạng nhiễm HBV trong nguy cơ<br /> mắc ung thư tế bào gan nguyên phát, chúng<br /> tôi đã thu được những kết quả rất đáng chú ý.<br /> Khi phân tích liên quan của các kiểu gen<br /> với khả năng mắc ung thư cho 207 trường<br /> 20<br /> <br /> hợp nhiễm HBV (171 trường hợp thuộc nhóm<br /> ung thư tế bào gan nguyên phát và 36 trường<br /> hợp thuộc nhóm chứng) húng tôi thấy kiểu gen<br /> P72P của SNP R72P gen TP53 làm tăng khả<br /> năng mắc ung thư tế bào gan lên một cách có ý<br /> nghĩa. Chỉ số này cao hơn so với nhóm không<br /> nhiễm HBV và cao hơn so với khi phân tích cả<br /> nhóm 547 đối tượng nghiên cứu (bảng 3). Kết<br /> quả của nghiên cứu phù hợp với một số nghiên<br /> cứu đã công bố. Đặc biệt là các nghiên cứu tại<br /> khu vực Đông Á. [10 - 12]. Một nghiên cứu tại<br /> Hàn Quốc có kết quả, người nhiễm HBV mang<br /> kiểu gen P72P của SNP R72P gen TP53 tăng<br /> khả năng mắc ung thư tế bào gan nguyên phát<br /> cao hơn người mang kiểu gen nguyên thuỷ<br /> R/R [9]. Đặc biệt, một nghiên cứu tại Đài Loan<br /> năm 2005 của Zhu và cộng sự cho thấy, allen<br /> 72P của SNP TP53 R72P làm tăng nguy cơ<br /> mắc bệnh cho những người nhiễm HBV lên 11<br /> lần [12]. <br /> Tuy các kết quả có khác nhau nhưng kết<br /> luận của các nghiên cứu trên và của chúng tôi,<br /> đều khẳng định kiểu gen P72P của SNP R72P<br /> làm tăng khả năng mắc bệnh cho những người<br /> nhiễm HBV. Điều này, cho phép nhóm nghiên<br /> cứu đưa ra nhận định về một sự tương tác<br /> giữa gen TP53 với virus viêm gan B. Sự tương<br /> tác này sẽ đi theo chiều hướng mắc bệnh nếu<br /> đó là các kiểu gen TP53 đột biến. Con đường<br /> tín hiệu p53, dòng tín hiệu nội bào mà ở đó<br /> TP53 là thành tố trung tâm, bị kích hoạt bởi<br /> các yếu tố nguy cơ tổn hại bộ gen trong đó có<br /> TCNCYH 108 (3) - 2017<br /> <br />