Đặc điểm của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương chịu hạn DT2008

Lò Thị Mai Thu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 187(11): 163 - 168<br /> <br /> ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB6 PHÂN LẬP<br /> TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN DT2008<br /> Lò Thị Mai Thu1, Nguyễn Việt Nga2, Nguyễn Thị Ngọc Lan2, Chu Hoàng Mậu2*<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Tây Bắc; 2Trường Đại học Sư phạm- ĐH Thái Nguyên<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loài cây họ Đậu có giá trị dinh dưỡng và hiệu quả kinh tế<br /> cao, nhưng rất mẫn cảm với tác động của hạn. Hạn là yếu tố phi sinh học làm giảm năng suất và<br /> chất lượng hạt đậu tương. Để chống lại stress hạn, cây đậu tương tổng hợp nhiều loại protein,<br /> trong đó có các nhân tố phiên mã kích hoạt hoạt động các gen chức năng. Phân họ protein DREB<br /> (Dehydration Responsive Element Binding) thuộc họ AP2 là nhân tố phiên mã kích hoạt biểu hiện<br /> của một số gen cảm ứng với hạn, làm tăng khả năng chống chịu các stress hạn của cây đậu tương.<br /> Tăng cường biểu hiện gen GmDREB là giải pháp công nghệ nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của<br /> cây đậu tương, trong đó khâu quan trọng là tạo gen nguyên liệu cho chuyển gen. Trong nghiên cứu này,<br /> gen GmDREB6 (cDNA) đã được khuếch đại và tách dòng từ mRNA của giống đậu tương DT2008.<br /> Gen GmDREB6 có kích thước là 693 bp, mã hóa 230 amino acid, sai khác ở 16 vị trí nucleotide và 8 vị<br /> trí amino acid suy diễn so với trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412 trên<br /> GenBank. Trình tự gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương chịu hạn DT2008 được sử dụng để<br /> thiết kế vector chuyển gen nhằm tăng cường khả năng chịu hạn ở cây đậu tương.<br /> Từ khóa: Gen GmDREB6, Glycine max, khả năng chịu hạn, nhân tố phiên mã, vùng AP2<br /> <br /> MỞ ĐẦU*<br /> Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] là cây<br /> thực phẩm dễ trồng và có hiệu quả kinh tế<br /> cao. Hạt đậu tương giàu dinh dưỡng, hàm<br /> lượng protein trong hạt đạt từ 30%-52%, hàm<br /> lượng lipid từ 12%-25%, có nhiều loại<br /> vitamin, khoáng và đặc biệt trong hạt chứa<br /> nhiều amino acid thiết yếu cho người và động<br /> vật. Cây đậu tương không chỉ có giá trị kinh<br /> tế và dinh dưỡng mà còn giữ vai trò quan<br /> trọng trong việc cải thiện độ phì và sử dụng<br /> bền vững tài nguyên đất canh tác do rễ đậu<br /> tương có khả năng cố định đạm [1], [2] [3].<br /> Trong những năm gần đây do biến đổi khí<br /> hậu mà hạn hán đã xảy ra ở nhiều quốc gia<br /> trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Ở một số<br /> vùng ở nước ta như các tỉnh miền Trung, Tây<br /> Nguyên, hạn đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến<br /> sản xuất nông nghiệp, làm suy giảm rõ rệt khả<br /> năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng,<br /> trong đó có đậu tương. Đậu tương được xem<br /> là loại cây trồng rất mẫn cảm với tác động của<br /> hạn và hạn là yếu tố phi sinh học nghiêm<br /> trọng nhất có thể làm giảm năng suất hạt đậu<br /> *<br /> <br /> Tel: 0913 383289; Email: chuhoangmau@tnu.edu.vn<br /> <br /> tương [2]. Câu hỏi đặt ra là, có thể cải thiện<br /> được khả năng chịu hạn của cây đậu tương<br /> hay không và nếu có thì ứng dụng công nghệ<br /> nào để tăng cường khả năng kháng hạn của<br /> loài cây họ đậu này. Cho đến nay các nghiên<br /> cứu đã khẳng định rằng, có thể cải thiện khả<br /> năng chịu hạn của cây đậu tương bằng kỹ<br /> thuật chọn giống truyền thống và công nghệ<br /> sinh học hiện đại.<br /> Để chống lại stress hạn, cây đậu tương tổng<br /> hợp nhiều loại protein, trong đó có các loại<br /> protein là nhân tố phiên mã kích hoạt hoạt<br /> động phiên mã của các gen chức năng [5].<br /> Protein DREB ở đậu tương (Dehydration<br /> Responsive Element Binding) là một phân họ<br /> thuộc họ AP2, có chức năng điều khiển sự<br /> biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn,<br /> tạo ra khả năng chống chịu các stress hạn từ<br /> ngoại cảnh. Một số thành viên của phân họ<br /> gen DREB được xác định có trong hệ gen của<br /> cây đậu tương như: GmDREBa, GmDREBb,<br /> GmDREBc,<br /> GmDREB1,<br /> GmDREB2,<br /> GmDREB3,<br /> GmDREB5,<br /> GmDREB6,<br /> GmDREB7 [7]. Trên bản đồ gen của đậu<br /> tương, gen GmDEB6 có một exon ở vị trí<br /> LOC100101914 thuộc nhiễm sắc thể số 5<br /> 163<br /> <br /> Lò Thị Mai Thu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 187(11): 163 - 168<br /> <br /> (Hình 1) [10]. Tăng cường biểu hiện gen<br /> GmDREB sẽ kích hoạt mạnh sự phiên mã của<br /> nhóm gen chịu hạn, do vậy việc lựa chọn kỹ<br /> thuật biểu hiện mạnh gen GmDREB sẽ là giải<br /> pháp công nghệ nhằm nâng cao khả năng chịu<br /> hạn của cây đậu tương mà khâu quan trọng là<br /> tạo gen nguyên liệu cho chuyển gen.<br /> <br /> thiết kế cặp mồi DREB6-F/DREB6-R để nhân<br /> gen GmDREB6 dựa trên trình tự gen DREB6<br /> đã công bố trên GenBank có mã số EF551166<br /> [6] cặp mồi DREB6-F/ DREB6-R thiết kế có<br /> trình tự là:<br /> <br /> Giống đậu tương DT2008 trồng phổ biến ở<br /> miền Bắc Việt Nam được chọn tạo bằng<br /> phương pháp xử lý đột biến chiếu xạ tia<br /> gamma trên hạt khô dòng 2001HC từ tổ hợp<br /> lai DT2001 với HC100 được đánh giá là<br /> giống chịu hạn [9]. Trong nghiên cứu này<br /> chúng tôi trình bày kết quả tách dòng và phân<br /> tích trình tự nucleotide của gen GmDREB6<br /> phân lập từ mRNA của giống đậu tương chịu<br /> hạn DT2008.<br /> <br /> DREB6-R:5’-TTAATATGATTCCCATAGA-3’.<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Vật liệu: Giống đậu tương DT2008 là giống<br /> chịu hạn do Viện Di truyền Nông nghiệp cung<br /> cấp được sử dụng làm vật liệu để phân lập và<br /> nghiên cứu đặc điểm gen GmDREB6.<br /> Phương pháp<br /> Quá trình thực hiện phân lập gen GmDREB6<br /> từ giống đậu tương DT2008 được thực hiện<br /> theo sơ đồ ở hình 2. Nghiên cứu thông tin và<br /> <br /> DREB6-F:5’ATGGTCATGGAAGAATCTAAC-3’;<br /> Kích thước của đoạn DNA được nhân bản dự<br /> kiến là 693 bp.<br /> Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kit Trizol<br /> Reagents của hãng Invitrogen. cDNA được<br /> tổng hợp từ RNA tổng số bằng bộ KIT<br /> SuperScript™ VILO™ cDNA Synthesis.<br /> PCR được thực hiện theo chương trình:<br /> 95C/5 phút; 30 chu kỳ (95C/30 giây;<br /> 55C/30 giây; 72C/30 giây); 72C/8 phút và<br /> giữ ở 4C. Sản phẩm PCR được điện di trên<br /> gel agarose 1,0% và được tinh sạch theo bộ<br /> kit GeneJET PCR Purification của hãng<br /> Fermentas. Tách dòng gen được thực hiện<br /> theo Sambrook và Russell (2001) [8]. Trình<br /> tự DNA được xác định trên máy đọc trình tự<br /> tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic<br /> Analyzer và trình tự nucleotide của gen được<br /> đọc trên phần mềm BLAST và BioEdit.<br /> <br /> Hình 1. Vị trí của gen GmDREB6 trên NST số 5 của cây đậu tương<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Tách dòng và giải trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008<br /> Mẫu lá non từ giống đậu tương giống DT2008 được sử dụng để tách chiết RNA tổng số, kết quả<br /> điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số được thể hiện trên hình 3A. RNA tổng số sau<br /> khi xử lý bằng DNase được sử dụng để tổng hợp cDNA bằng phản ứng phiên mã ngược. Từ<br /> cDNA, bằng PCR với cặp mồi DREB6-F/DREB6-R đoạn mã hóa của gen GmDREB6 đã được<br /> 164<br /> <br /> Lò Thị Mai Thu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 187(11): 163 - 168<br /> <br /> khuếch đại. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmDREB6 thu được băng DNA đặc hiệu<br /> với kích thước gần 0,7 kb, đúng như tính toán theo lý thuyết (Hình 3B). Sản phẩm PCR nhân bản<br /> gen GmDREB6 đã tinh sạch được sử dụng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT (kích<br /> thước 2705 bp) để tạo vector tái tổ hợp pBT_GmDREB6. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào<br /> E.coli DH5α, các khuẩn lạc được chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh ampicillin, có chất<br /> cảm ứng IPTG và cơ chất X-Gal. Năm dòng khuẩn lạc trắng được lựa chọn để tiến hành phản<br /> ứng colony-PCR nhằm kiểm tra sự có mặt của gen GmDREB6. Kết quả điện di sản phẩm colonyPCR ở hình 3C cho thấy một băng DNA có kích thước gần 0,7 kb là kích thước của gen<br /> GmDREB6. Khuẩn lạc số 2 không xuất hiện đoạn DNA. Các dòng khuẩn lạc cho kết quả dương<br /> tính với colony-PCR được nuôi tăng sinh và sử dụng để tách chiết plasmid phục vụ giải trình tự<br /> nucleotide. Kết quả giải trình tự đoạn DNA từ plasmid tái tổ hợp pBT_GmDREB6 trên thiết bị tự<br /> động thu được trình tự nucleotide có kích thước 693 bp. Kết quả phân tích bằng BLAST trong<br /> NCBI cho thấy, trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 có<br /> độ tương đồng 100% so với hai trình tự gen mang mã số NM_001248412 và EF551166. Kết quả<br /> phân tích BLAST cho phép khẳng định đoạn gen phân lập từ giống đậu tương DT2008 là gen<br /> Glycine max dehydration-responsive element binding protein 6 (GmDREB6) mRNA của cây đậu<br /> tương. Trình tự gen GmDREB6 có kích thước 693 bp mã hóa 230 amino acid (Hình 4).<br /> RNA<br /> tổng số<br /> <br /> GENBANK<br /> cDNA<br /> <br /> Thiết kế<br /> Cặpmồi DREB6F/ DREB6-R<br /> <br /> PCR<br /> <br /> Giải trình tự<br /> nucleotide<br /> <br /> Trình tự nucleotide của gen GmDREB6<br /> <br /> Gen GmDREB6 củađậu tương<br /> <br /> Hình 2. Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm phân lập gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008<br /> <br /> 165<br /> <br /> Lò Thị Mai Thu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 187(11): 163 - 168<br /> <br /> A<br /> B<br /> C<br /> Hình 3. Hình ảnh điện di trên gel agarose. A: Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách từ lá non giống đậu<br /> tương DT2008; B: Sản phẩm PCR nhân gen GmDREB6 (M-thang DNA 1 kb; làn điện di 1, 2, 3- Sản phẩm<br /> PCR nhân gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008); C: Sản phẩm colony-PCR nhân bản gen<br /> GmDREB6 từ 5 dòng khuẩn lạc màu trắng (M: Thang DNA 1 kb; Làn điện di số 1, 3, 4, 5 cho sản phẩm<br /> colony-PCR; làn điện di số 2 không có sản phẩm colony-PCR).<br /> <br /> Hình 4. Kết quả phân tích BLAST gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008<br /> <br /> So sánh trình tự nucleotide và trình tự<br /> amino acid suy diễn từ gen GmDREB6 của<br /> giống đậu tương DT2008 với trình tự<br /> EF551166<br /> và<br /> NM_001248412<br /> trên<br /> GenBank<br /> Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen<br /> GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương<br /> DT2008 với gen GmDREB6 mang mã số trên<br /> GenBank là NM_001248412 [4] và<br /> EF551166 [6], kết quả được thể hiện ở bảng<br /> 1. Bảng 1 cho thấy, trình tự nucleotide của<br /> gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương<br /> DT2008 có 16 vị trí nucleotide sai khác so với<br /> trình tự nucleotide của gen GmDREB6 mang<br /> mã số EF551166 và NM_001248412 trên<br /> GenBank, đó là các vị trí 19, 20, 51, 52, 75,<br /> 197, 319, 320, 408, 409, 580, 581, 635, 636,<br /> 680, 681. Tất cả những sai khác này đều là sự<br /> thay thế cặp A-T bằng G-C hoặc G-C bằng AT. Vấn đề đặt ra là sự thay thế cặp nucleotide<br /> 166<br /> <br /> có làm thay đổi amino acid hay không cần<br /> phải tiến hành so sánh trình tự amino acid suy<br /> diễn của gen GmDREB6.<br /> Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn<br /> của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu<br /> tương DT2008 với hai trình tự amino acid suy<br /> diễn của gen GmDREB6 mang mã số<br /> EF551166, NM_001248412 trên GenBank<br /> cho thấy có 8 vị trí amino acid sai khác, đó là<br /> các vị trí 6, 18, 66, 107, 137, 194, 212, 227<br /> (Bảng 2).<br /> Phân tích vùng AP2 và các điểm liên kết với<br /> sợi DNA, kết quả so sánh ở hình 5 cho thấy,<br /> vùng AP2 của protein suy diễn từ gen<br /> GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương<br /> DT2008 có 2 vị trí sai khác, đó là amino acid<br /> thứ 66 và 107. Hai điểm sai khác về amino acid<br /> không thuộc vào những vị trí DNA binding (60,<br /> 61, 63, 65, 67, 69, 73, 75, 82, 84, 87).<br /> <br /> Lò Thị Mai Thu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 187(11): 163 - 168<br /> <br /> Bảng 1. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương<br /> DT2008 và trình tự mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank<br /> TT<br /> Vị trí nucleotide<br /> DT2008<br /> EF551166<br /> NM_001248412<br /> 1<br /> 19<br /> T<br /> A<br /> A<br /> 2<br /> 20<br /> T<br /> A<br /> A<br /> 3<br /> 51<br /> A<br /> T<br /> T<br /> 4<br /> 52<br /> A<br /> T<br /> T<br /> 5<br /> 75<br /> A<br /> T<br /> T<br /> 6<br /> 197<br /> T<br /> A<br /> A<br /> 7<br /> 319<br /> C<br /> G<br /> G<br /> 8<br /> 320<br /> C<br /> G<br /> G<br /> 9<br /> 408<br /> C<br /> G<br /> G<br /> 10<br /> 409<br /> C<br /> G<br /> G<br /> 11<br /> 580<br /> A<br /> T<br /> T<br /> 12<br /> 581<br /> A<br /> T<br /> T<br /> 13<br /> 635<br /> G<br /> C<br /> C<br /> 14<br /> 636<br /> G<br /> C<br /> C<br /> 15<br /> 680<br /> C<br /> G<br /> G<br /> 16<br /> 681<br /> C<br /> G<br /> G<br /> Bảng 2. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu<br /> tương DT2008 và suy diễn từ trình tự mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank<br /> TT<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> <br /> Vị trí amino acid<br /> 7<br /> 18<br /> 66<br /> 107<br /> 137<br /> 194<br /> 212<br /> 227<br /> <br /> DT2008<br /> F<br /> T<br /> L<br /> P<br /> P<br /> K<br /> G<br /> S<br /> <br /> EF551166<br /> N<br /> S<br /> Q<br /> G<br /> A<br /> L<br /> A<br /> W<br /> <br /> NM_001248412<br /> N<br /> S<br /> Q<br /> G<br /> A<br /> L<br /> A<br /> W<br /> <br /> Hình 5. So sánh trình tự amino acid của vùng AP2 trong protein suy diễn từ gen GmDREB6 của giống đậu<br /> tương DT2008 và EF551166, NM_001248412 trên GenBank<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Gen GmDREB6 (cDNA) đã được khuếch đại và tách dòng thành công từ mRNA của giống đậu<br /> tương DT2008 có kích thước là 693 bp, mã hóa 230 amino acid. Gen GmDREB6 của giống đậu<br /> tương Việt Nam DT2008 có 16 vị trí nucleotide và 8 vị trí amino acid suy diễn sai khác so với<br /> trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank. Trình tự gen<br /> GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen trong mục đích<br /> tăng cường khả năng chịu hạn ở cây đậu tương.<br /> 167<br /> <br />