Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu bằng chỉ thị phân tử RAPD

Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN CÂY MÃNG CẦU TA<br /> TẠI TỈNH BÀ RỊA - VŨNG TÀU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD<br /> Đỗ Văn Thịnh1, Phạm Thị Mười1, Trương Quốc Ánh2, Bùi Anh Xuân2,<br /> Nguyễn Đắc Thành2, Lương Thế Minh2, Chung Anh Dũng2, Mai Văn Trị1<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu bằng chỉ thị RAPD<br /> đã được thực hiện từ tháng 3/2018 đến tháng 10/2018. Mẫu lá của 40 cá thể mãng cầu ta qua tuyển chọn được thu<br /> thập để ly trích DNA, sản phẩm DNA được khuếch đại bằng 10 chỉ thị RAPD. Kết quả cho thấy, dựa vào sơ đồ quan<br /> hệ di truyền có thể chia 40 cá thể thu thập thành 2 nhóm với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,76 đến 1.<br /> Trong đó, nhóm I gồm 39 cá thể, nhóm II gồm 1 cá thể. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy mức độ đa dạng di truyền<br /> của 40 cá thể thu thập, đồng thời cho thấy sự khác biệt giữa nhóm mãng cầu địa phương và mãng cầu ta du nhập mà<br /> có thể khai thác cho các chương trình chọn tạo giống.<br /> Từ khóa: Mãng cầu ta, đa dạng di truyền, RAPD, Bà Rịa - Vũng Tàu<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Mãng cầu ta (Annona squamosa L.) còn gọi là 2.1. Vật liệu nghiên cứu<br /> na là cây ăn quả được trồng rộng rãi ở nước ta. Bà Vật liệu gồm 40 cá thể mãng cầu ta được tuyển<br /> Rịa - Vũng Tàu là một trong những tỉnh trồng nhiều chọn và thu thập từ một nghiên cứu trước đó của<br /> mãng cầu ta. Loài cây ăn quả này dễ trồng, có giá Nguyễn Tuấn Vũ và cộng tác viên (2018) tại tỉnh Bà<br /> trị kinh tế cao, có tiềm năng xuất khẩu và mang lại Rịa - Vũng Tàu (Bảng 1). Các cây mãng cầu ta được<br /> thu nhập tốt cho người trồng. Qua điều tra cho thấy, sử dụng làm mẫu được kí hiệu lần lượt từ BRVT01<br /> giống sản xuất đại trà hiện nay có nhược điểm là quả đến BRVT40.<br /> nhỏ và nhiều hạt. Do đó việc nghiên cứu chọn tạo<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> giống để cải thiện những tính trạng trên là cần thiết.<br /> Ngày nay, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học Ly trích và kiểm tra DNA: DNA của các mẫu lá<br /> phân tử, nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền sử mãng cầu ta được ly trích theo phương pháp CTAB<br /> dụng chỉ thị DNA đã được ứng dụng rộng rãi trong (Doyle and Doyle, 1990). Sau khi ly trích, DNA sẽ<br /> nghiên cứu và chọn lọc giống cây trồng (Nguyễn được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 2%<br /> (w/v), mẫu có vạch DNA rõ nét, không bị đứt gãy,<br /> Đức Thành, 2014). Trên thế giới, nhiều nghiên cứu<br /> và có độ tinh sạch cao sẽ được sử dụng cho phản<br /> ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD (Random Amplified<br /> ứng PCR.<br /> Polymorphic DNA) phân tích đa dạng di truyền trên<br /> chi na (Annona) đã được thực hiện, trong đó có cây Phản ứng khuếch đại DNA với 10 đoạn mồi<br /> mãng cầu ta (Ronning et al., 1995, Bharad et al., RAPD (Bảng 2), sản phẩm PCR được sử dụng để<br /> chạy điện di trên gel agarose 2%, nhuộm gel bằng<br /> 2009; Ahmad et al., 2010; Guimarães et al., 2013;<br /> ethidium bromide và chụp gel bằng tia UV, kết quả sẽ<br /> Anugari et al., 2016). Ở Việt Nam, chỉ thị phân tử<br /> được sử dụng để xây dựng cây phân nhánh di truyền<br /> RAPD đã được ứng dụng để đánh giá đa dạng di<br /> bằng phần mềm NTSYSpc 2.11a theo phương pháp<br /> truyền của một số cây trồng nhưng chưa thực hiện<br /> UPGMA (Sneath and Sokal, 1973). Phân tích sơ đồ<br /> trên cây mãng cầu ta. Gần đây, nguồn gen cây mãng<br /> hình nhánh và đánh giá mối quan hệ di truyền giữa<br /> cầu ta ở tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu (BRVT) đã được các cây mãng cầu ta dựa trên ma trận hệ số tương<br /> khảo sát với 40 cây cá thể trong quần thể mãng cầu đồng (Nei and Li, 1979). Giá trị PIC (Polymorphic<br /> ta trong sản xuất có những khác biệt hình thái được information content) được sử dụng để đánh giá hiệu<br /> thu thập và bảo tồn (Nguyễn Tuấn Vũ và ctv., 2018). quả của mồi trong việc phân biệt kiểu gen đặc trưng<br /> Nghiên cứu này được tiến hành để đánh giá đa dạng của cây. Giá trị PIC được xác định theo công thức:<br /> di truyền nguồn gen cây mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa PIC = 1 – Σ(Pi2); Trong đó: Pi là tần số của alen i<br /> - Vũng Tàu mà đại diện là 40 cá thể được thu thập của kiểu gene được kiểm tra, phạm vi giá trị PIC từ<br /> nêu trên bằng chỉ thị phân tử RAPD. 0 (không đa hình) tới 1 (đa hình hoàn toàn).<br /> 1<br /> Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn quả miền Đông Nam bộ, Viện Cây ăn quả miền Nam<br /> 2<br /> Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam<br /> <br /> 22<br />  Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019<br /> <br /> Bảng 1. Danh sách địa điểm thu thập 40 mẫu mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu<br /> Mẫu Tên chủ vườn và địa điểm thu thập Tọa độ*<br /> Trần Văn Thêm (Ấp Phước Thới, xã Phước Long Thọ,<br /> 1-3 [N10029’52,6” E107017’10,5”] ± 10 m<br /> huyện Đất Đỏ)<br /> 4-6 Lê Văn Tùy (Khu phố Phước Sơn, T.T. Đất Đỏ, huyện Đất Đỏ) [N10030’19,8” E107017’4,0”] ± 11 m<br /> Huỳnh Văn Tú (Ấp Phước Thới, xã Phước Long Thọ, huyện<br /> 7-8 [N10030’50” E107017’12,4”] ± 15 m<br /> Đất Đỏ)<br /> Nguyễn Văn Hùng (Ấp Phước Thới, xã Phước Long Thọ,<br /> 9 - 10 [N10031’03” E107017’23”] ± 6 m<br /> huyện Đất Đỏ)<br /> Phạm Tuấn Ngọc (Khu phố Thanh Long, TT. Đất Đỏ, huyện<br /> 11 - 13 [N10030’51,9” E107016’25,8”] ± 21 m<br /> Đất Đỏ)<br /> 14 - 17,<br /> Võ Văn Siêng (Ấp Tân Hòa, xã Long Tân, huyện Đất Đỏ) [N10032’15,8” E107017’48,3”] ± 12 m<br /> 29 - 30<br /> Nguyễn Văn Nguyện (Khu phố Thanh Long, TT. Đất Đỏ,<br /> 18 [N10031’16,8” E107016’31,5”] ± 18 m<br /> huyện Đất Đỏ)<br /> 19 - 21 Lý Hùng Cường (Ấp Tân Hòa, xã Long Tân, huyện Đất Đỏ) [N10032’21” E107017’43,2”] ± 6 m<br /> 22 - 24 Phạm Hữu (Ấp Cây Cám, xã Láng Dài, huyện Đất Đỏ) [N10030’53,7” E107020’40,1”] ± 7 m<br /> 25 - 28 Đỗ Sung (Ấp Cây Cám, xã Láng Dài, huyện Đất Đỏ) [N10031’19,3” E107020’40,1”] ± 5 m<br /> 31,<br /> Đào Văn Hiếu (Ấp Phú Lâm, xã Hòa Hiệp, huyện Xuyên Mộc) [N10040’21,0” E107032’12,0”] ± 59 m<br /> 36 - 40<br /> Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn quả miền Đông Nam Bộ<br /> 32** [N10038’5,0” E10708’27”] ± 11 m<br /> (Khu phố Nông Trường, phường Hắc Dịch, Tx. Phú Mỹ)<br /> 33** Đặng Văn Phức (Ấp 2, xã Tóc Tiên, Tx. Phú Mỹ) [N10037’24,9” E10705’35,2”] ± 9 m<br /> 34 - 35 Nguyễn Tiến Hoàng (Ấp 2, xã Tóc Tiên, Tx. Phú Mỹ) [N10035’49,4” E10707’0,2”] ± 10 m<br /> Ghi chú: *: Tọa độ vị trí thu thập được xác định bằng App GPS Map + trên Window phone; **: giống du nhập.<br /> <br /> Bảng 2. Danh sách 10 đoạn mồi RAPD được sử dụng trong phản ứng PCR<br /> STT Tên mồi Trình tự (5’-3’) STT Tên mồi Trình tự (5’-3’)<br /> 1 OPA02 TGCCGAGCTG 6 OPB08 GTCCACACGG<br /> 2 OPA11 CAATCGCCGT 7 OPB10 CTGCTGGGAC<br /> 3 OPB01 GTTTCGCTCC 8 OPB12 CCTTGACGCA<br /> 4 OPB05 TGCGCCCTTC 9 OPB15 GGAGGGTGTT<br /> 5 OPB07 GGTGACGCAG 10 OPB17 AGGGAACGAG<br /> <br /> 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu<br /> Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 3/2018 đến số alen cao nhất là 291 alen và chỉ thị OPB10 cho số<br /> tháng 10/2018 tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh alen ít nhất là 136. Số alen ở từng mẫu qua 10 chỉ thị<br /> học của Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn quả miền RAPD cũng có sự khác nhau đáng kể (Bảng 3).<br /> Đông Nam bộ và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh Tính đa hình của các chỉ thị RAPD còn được<br /> học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam. đánh giá thông qua giá trị lượng thông tin đa hình<br /> (PIC). Giá trị PIC của từng chỉ thị phụ thuộc vào số<br /> III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN lượng alen được phát hiện ở vị trí locus đó và tần số<br /> Kết quả ly trích DNA cho thấy tất cả 40 mẫu DNA của các alen. Giá trị PIC càng lớn thì lượng thông<br /> đều có độ tinh sạch cao đủ điều kiện cho phản ứng tin đa hình mà chỉ thị đó cung cấp càng nhiều và<br /> PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose ngược lại. Trong tổng số 40 mẫu mãng cầu ta thực<br /> 2% của 40 mẫu mãng cầu ta với 10 đoạn mồi RAPD hiện phản ứng PCR với 10 chỉ thị RAPD cho thấy<br /> cho thấy có tổng số 2308 alen được khuếch đại với giá trị PIC biến thiên từ 0,727 - 0,982, cao nhất ở chỉ<br /> sự đa hình rất cao, số alen trung bình của mỗi chỉ thị OPA11 và thấp nhất là chỉ thị OPB07, giá trị PIC<br /> thị RAPD là 230,8. Chỉ thị OPA02 khuếch đại được trung bình là 0,838 (Bảng 3).<br /> <br /> 23<br /> Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019<br /> <br /> Bảng 3. Sự đa hình của 10 đoạn mồi RAPD BRVT14, BRVT15, BRVT16, BRVT29, BRVT19,<br /> trên 40 mẫu mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu BRVT20, BRVT21 và BRVT33. Trong nhóm này<br /> thông qua số alen và giá trị PIC 5 cá thể BRVT03, BRVT04, BRVT05, BRVT06 và<br /> STT Mồi Số alen PIC BRVT07 có quan hệ chặt về mặt di truyền với hệ<br /> 1 OPA02 291 0,874 số tương đồng di truyền là 1; Tương tự các cá thể<br /> BRVT08, BRVT09 và BRVT34, BRVT35 cũng có<br /> 2 OPA11 185 0,982<br /> mối quan di truyền chặt (hệ số tương đồng bằng 1).<br /> 3 OPB01 280 0,835<br /> Nguyên nhân có thể là do các cây này được nhân<br /> 4 OPB05 290 0,878 từ cùng nguồn gốc nên có nền di truyền hoàn toàn<br /> 5 OPB07 226 0,727 giống nhau. Nhóm I.2 có 2 cá thể là BRVT30 và<br /> 6 OPB08 239 0,833 BRVT31, hai cá thể này có mối quan hệ rất gần nhau<br /> 7 OPB10 136 0,841 về mặt di truyền với hệ số tương đồng đạt 0,91.<br /> 8 OPB12 280 0,799 Nhóm II gồm 1 cá thể là BRVT32 có mối quan<br /> 9 OPB15 228 0,749 hệ di truyền với nhóm I ở mức hệ số tương đồng di<br /> 10 OPB17 153 0,860 truyền là 0,76. Do đó, chỉ thị RAPD với 10 đoạn mồi<br /> như Bảng 2 có thể phân nhóm được các cá thể có<br /> Trung bình 230,8 0,838<br /> nguồn gốc địa phương (nhóm I) và cá thể du nhập<br /> Mối quan hệ di truyền của 40 cá thể mãng cầu (nhóm II) cũng như phản ánh được sự đa dạng di<br /> ta nghiên cứu được thể hiện thông qua hệ số tương truyền giữa các cá thể địa phương.<br /> đồng di truyền và sơ đồ quan hệ di truyền ở Hình 1. Ngoài ra, BRVT32 và BRVT33 là hai cá thể du<br /> Kết quả cho thấy hệ số tương đồng di truyền của 40 nhập, tuy nhiên từ kết quả phân tích đa dạng di<br /> cá thể mãng cầu ta nghiên cứu dao động từ 0,76 đến truyền được trình bày trong hình 1 hai cá thể này<br /> 1 và được thành 2 nhóm chính như sau: lại thuộc hai nhóm khác nhau, nguyên nhân có thể<br /> Nhóm I có mối quan hệ gần về mặt di truyền với là do hai cá thể này được nhân giống từ hai nguồn<br /> hệ số tương đồng dao động từ 0,85 đến 1 và có thể có nền di truyền khác xa nhau. Bên cạnh đó, cá thể<br /> chia nhóm này thành 2 nhóm phụ gồm nhóm I.1 có BRVT33 lại thuộc nhóm I (nhóm có nguồn gốc địa<br /> 37 cá thể là BRVT01, BRVT02, BRVT03, BRVT04, phương), có thể nguồn gốc của cá thể này có nền<br /> BRVT05, BRVT06, BRVT07, BRVT08, BRVT09, di truyền tương tự với nền di truyền của các cá thể<br /> BRVT40, BRVT10, BRVT39, BRVT11, BRVT34, địa phương và mặc dù thuộc nhóm I nhưng cá thể<br /> BRVT35, BRVT36, BRVT37, BRVT38, BRVT22, BRVT33 được tách thành 1 nhánh riêng với hệ số<br /> BRVT24, BRVT23, BRVT25, BRVT26, BRVT27, tương đồng di truyền đạt 0,86 so với các cá thể mãng<br /> BRVT28, BRVT12, BRVT17, BRVT18, BRVT13, cầu ta địa phương.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Kết quả phân nhóm di truyền của 40 cá thể mãng cầu ta<br /> dựa trên hệ số tương đồng di truyền (coefficient) của 10 đoạn mồi RAPD<br /> <br /> 24<br />  Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019<br /> <br /> Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen mãng TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> cầu dựa vào chỉ thị phân tử RAPD đã được nhiều Nguyễn Đức Thành, 2014. Các kỹ thuật chỉ thị DNA<br /> nghiên cứu sử dụng. Bharad và cộng tác viên (2009), trong nghiên cứu và chọn lọc thực vật. Tạp chí Sinh<br /> đã sử dụng 26 chỉ thị phân tử RAPD để đánh giá học, 36(3): 265-294.<br /> đa dạng di truyền 11 mẫu thuộc chi Annona gồm Nguyễn Tuấn Vũ, Lê Thị Huyền, Phạm Thị Mười, Đỗ<br /> AKCa01, AKCa02, AKCa03, AKCa04, AKCa05, Văn Thịnh, Huỳnh Kỳ và Mai Văn Trị, 2018. Kết<br /> AKCa06, AKCa07, AKCa08, AKCa09, AKCa10 và quả điều tra, thu thập và bảo tồn nguồn gen cây<br /> Balanagar thu thập tại Ấn Độ, kết quả có 19 chỉ thị mãng cầu ta tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu. Tạp chí Khoa<br /> phân tử RAPD là đa hình và 3 mẫu AKCa05, AKCa07 học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 4(89): 92-98.<br /> và AKCa10 là hoàn toàn khác nhau về kiểu gen, Ahmad I., S. Bhagat, T.V.R.S. Sharma, K. Kumar,<br /> 8 kiểu gen còn lại là tương tự nhau. Kết quả nghiên P. Simachalam and R.C. Srivastava, 2010. ISSR<br /> cứu của Ahmad và cộng tác viên (2010), cho thấy and RAPD marker based DNA fingerprinting<br /> trong tổng số 20 chỉ thị RAPD sử dụng có 14 chỉ thị and diversity assessment of Annona spp. in South<br /> khuếch đại được DNA với 48 băng, trong đó có 25 Andamans. Indian Journal of Horticulture, (67):<br /> băng đa hình (52%) trong tổng số 17 kiểu gen thu 147-151.<br /> thập và được chia thành 2 nhóm chính với các mức Anugari, H., H.L. Dhaduk, S. Kumar, J.J. Dhruve, M.J.<br /> độ di truyền khác nhau. Tương tự, từ 20 kiểu gen Parekh and A.A. Sakure, 2016. Molecular diversity<br /> thu thập thuộc chi Annona, Anugari và cộng tác viên of Annona species and proximate fruit composition<br /> (2016), sử dụng 11 chỉ thị RAPD sử dụng để đánh of selected genotypes. Biotech., (6): 204-214.<br /> giá đa dạng di truyền cho kết quả có 152 băng được Bharad S.G., P.L. Kulwal and S.A. Bagal, 2009.<br /> khuếch đại (80,01% đa hình), hệ số tương đồng di Genetic diversity study in Annona squamosa by<br /> truyền từ 0,44 đến 0,92 và phân thành 7 nhóm, giá morphological, biochemical and RAPD markers.<br /> trị PIC biến động từ 0,86 đến 0,92. Như vậy, kết quả Acta Hort., (839): 615-623.<br /> phân tích đa dạng di truyền 40 cá thể mãng cầu ta Doyle J.J. and J.L. Doyle, 1990. A rapid DNA isolation<br /> trong nghiên cứu này cũng phù hợp với nghiên cứu procedure for small quantities of fresh leaf material.<br /> của Bharad và cộng tác viên (2009), Ahmad và cộng Phytochemical Bulletin, (19): 11-15.<br /> tác viên (2010), Anugari và cộng tác viên (2016). Guimarães J.F.R., S. Nietsche, M.R. Costa, G.B.R.<br /> Moreira, M.C.T. Pereira and W. Vendrame, 2013.<br /> IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Genetic diversity in sugar apple (Annona squamosa L.)<br /> 4.1. Kết luận by using RAPD markers. Revista Ceres, 60(3):<br /> 428-431.<br /> Kết quả nghiên cứu thể hiện mức độ đa dạng di<br /> truyền của 40 cá thể thu thập tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Nei M. and W.H. Li, 1979. Mathematical models for<br /> Tàu với hệ số tương đồng di truyền dao động từ studying genetic variation in terms of restriction<br /> 0,76 - 1 và phân thành hai nhóm chính, đồng thời endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (76):<br /> cho thấy sự khác biệt giữa nhóm mãng cầu địa 5269-5273.<br /> phương và mãng cầu ta du nhập. Dù sự khác biệt Ronning C.M., R.J. Schnell and S. Gazit, 1995. Using<br /> không lớn nhưng có thể ứng dụng khác biệt này randomly amplified polymorphic DNA (RAPD)<br /> trong các chương trình chọn tạo giống. markers to identify Annona cultivars. J. Amer. Soc.<br /> Hort. Sci., 120(5): 726-729.<br /> 4.2. Đề nghị Sneath P.H. and R.R. Sokal, 1973. Numerical<br /> Ứng dụng kết quả nghiên cứu này làm cơ sở cho taxonomy - The principles and practice of numerical<br /> chương trình chọn tạo giống mãng cầu mới theo các classification. W.H. Freeman and Company, San<br /> mục đích khác nhau. Francisco, USA.<br /> <br /> Evaluation of genetic diversity of sugar apple<br /> in Ba Ria - Vung Tau province by RAPD markers<br /> Do Van Thinh, Pham Thi Muoi, Truong Quoc Anh, Bui Thi Xuan,<br /> Nguyen Dac Thanh, Luong The Minh, Chung Anh Dung, Mai Van Tri<br /> Abstract<br /> Study on the genetic diversity of sugar apple in Ba Ria - Vung Tau province was carried out from March - October,<br /> 2018 by using RAPD markers. Leaf samples of 40 selected sugar apple genotypes were collected for DNA extraction<br /> and DNA extracts were amplified by 10 RAPD primers. The results showed that these selected sugar apple genotypes<br /> were divided into two main groups with the genetic similarity coefficient from 0.76 to 1. The first group consisted of<br /> <br /> 25<br />