Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro của quy trình sản xuất cao khô lá Neem (xoan chịu hạn) (Azadirachta indica A.Juss Meliaceae)

Chia sẻ: Bigates Bigates | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Lá Neem (xoan chịu hạn) Azadirachta indica A.Juss Meliaceae được chiết siêu âm với các dung môi có độ cồn khác nhau, lọc, cô dịch chiết đến cao đặc, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao đặc bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar). Từ kết quả hiệu suất chiết và hoạt tính kháng khuẩn, xây dựng quy trình sản xuất cao khô lá xoan thu mua tại Ninh Thuận với dung môi cồn 25% có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus (MIC=80 mg/ml).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro của quy trình sản xuất cao khô lá Neem (xoan chịu hạn) (Azadirachta indica A.Juss Meliaceae)

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN IN VITRO CỦA QUY TRÌNH SẢN XUẤT CAO KHÔ LÁ NEEM (XOAN CHỊU HẠN) (AZADIRACHTA INDICA A.JUSS MELIACEAE) Phạm Vi Minh Ngọc, Nguyễn Trọng Nhân, Phan Thị Anh Thư Khoa Dược, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: ThS.DS. Thái Hồng Đăng, ThS. Dương Minh Trí TÓM TẮT Lá Neem (xoan chịu hạn) Azadirachta indica A.Juss Meliaceae được chiết siêu âm với các dung môi có độ cồn khác nhau, lọc, cô dịch chiết đến cao đặc, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao đặc bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar). Từ kết quả hiệu suất chiết và hoạt tính kháng khuẩn, xây dựng quy trình sản xuất cao khô lá xoan thu mua tại Ninh Thuận với dung môi cồn 25% có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus (MIC=80 mg/ml). Từ đó cho thấy tác dụng kháng khuẩn của lá Neem phụ thuộc vào dung môi chiết, nguồn nguyên liệu và vẫn duy trì hoạt tính trong suốt quá trình sản xuất chế phẩm cao khô. Từ khóa: azadirachta indica, hiệu suất chiết xuất, hoạt tính kháng khuẩn, lá xoan chịu hạn, Neem 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Neem Azadirachta indica A.Juss., họ Xoan Meliaceae là loài thực vật thường xanh phân bố châu Á, châu Phi và các vùng có khí hậu nhiệt đới; thường được gọi là Xoan chịu hạn, Xoan Ấn Độ, Neem,…[11] nhưng Neem là tên thường được sử dụng nhiều nhất. Thành phần hóa học chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm alkaloid, flavonoid, triterpenoid, phenol, carotenoid, steroid và ceton; về mặt sinh học thì hợp chất có hoạt tính mạnh nhất là azadirachtin. Dược liệu này có tác dụng như: chống dị ứng, chống nhiễm trùng, kháng virus, kháng nấm, chống viêm, hạ sốt, tẩy giun, lợi tiểu, diệt côn trùng, diệt ấu trùng, diệt tinh trùng và các tác dụng sinh học khác [7], [9], [11], [12]. Các hoạt chất trong Neem tác động đến rất nhiều loài dịch hại theo các phương thức: gây ngán ăn xua đ ổi, làm chết côn trùng qua đường tiếp xúc và đường miệng, ức chế sự sinh trư ng và gây đột biến, ảnh hư ng đến khả năng giao phối, ảnh hư ng khả năng đẻ trứng và làm thối trứng động vật [1]. Trên thế giới, nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cây Neem nói chung và lá Neem nói riêng khá đã được công bố, tập trung vào dịch chiết từ các dung môi chiết xuất như hexane, methanol, chloroform, ethyl acetate, petroleum ether [8],[10], [13]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về các dạng bào chế từ lá Neem chưa nhiều, tập trung vào các hợp chất phân lập từ trong cây Neem [1], [6] và một vài nghiên cứu khảo sát về hoạt tính kháng khuẩn của cao đặc chiết với dung môi như cồn 96% hay nước [4], [5]. Cao khô lá Neem sản xuất tại Trung tâm nghiên cứu và sản xuất dược liệu miền Trung (TTNCSXDLMT) được sử dụng trong ngành nuôi trồng thủy hải sản tại Phú Yên nhằm mục đích phòng và điều trị các 639
vi sinh vật gây bệnh cho thủy hải sản với vai trò là kháng sinh sinh học. Tuy nhiên trong thực tế sử dụng đã ghi nhận sự khác nhau về tác dụng kháng khuẩn của cao khô lá Neem từ nguyên liệu mẫu lá thu mua và nguồn cây trồng. Chính vì thế, đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro của quy trình sản xuất cao khô lá Neem (xoan chịu hạn) (Azadirachta indica A.Juss Meliaceae)” đã được thực hiện nhằm đánh giá sự ảnh hư ng của nguồn nguyên liệu, dung môi chiết xuất và quy trình sản xuất đến hoạt tính kháng khuẩn của cao khô lá Neem. Từ đó xây dựng quy trình sản xuất cao khô lá Neem quy mô phòng thí nghiệm và duy trì hoạt tính kháng khuẩn trong suốt quy trình. Đề tài sẽ cung cấp cơ s khoa học cho trung tâm để ứng dụng sản xuất sản phẩm mới trong tương lai. 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng Mẫu lá Neem (6 tháng tuổi) thu hái tại TTNCSXDLMT- Đ ng Hòa, Phú Yên vào tháng 12/2020, lô 010321 (hình 1) và mẫu lá được thu mua tại Ninh Thuận, lô 020920, ngày 07/09/2020 (hình 2). Bảo quản: nhiệt độ 20-25 oC trong túi kín khí. Môi trường: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), NaCl 0,9%. Chủng vi sinh vật thử nghiệm: Staphylococcus aureus và Escherichia coli cung cấp b i khoa Sinh học – Trường đại học Khoa học tự nhiên TPHCM. Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau Hình 1. Lá thu hái tại TTNCSXDLMT Hình 2. Lá thu mua tại Ninh Thuận 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chuẩn bị mẫu Lá được sấy khô nhiệt độ 60 oC và xay đến kích thước 1-3 mm. 2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng dung môi chiết xuất đến hoạt tính kháng khuẩn - Dung môi chiết xuất được nghiên cứu là dung môi thường sử dụng trong sản xuất công nghiệp để dễ dàng nâng cấp cỡ lô. - Chiết riêng lẻ mỗi 30g nguyên liệu với 150 ml ethanol 96%, 70%, 50%, 25% và nước, siêu âm 30 phút, lặp lại 2 lần với 100 ml dung môi và lọc qua bông [14]. 640
- Hiệu suất chiết xuất của các dung môi được tính theo công thức sau: trong đó: M1: khối lượng bột lá nguyên liệu (g); M2: khối lượng cao (g). A1: độ ẩm bột lá nguyên liệu (%); A2: độ ẩm cao (%). - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) [5] như sau:  Chuẩn bị dịch kháng khuẩn: • Đối chứng âm: dung dịch DMSO 5% vô trùng. • Đối chứng dương: kháng sinh Ciprofloxacin (1 mg/ml pha trong DMSO 5%) [14]. • Cao lá Neem được pha trong dung dịch DMSO 5% vô trùng thành các nồng độ sau: 800 mg/ml, 400 mg/ml, 200 mg/ml, 100 mg/ml.  Số liệu thống kê được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statgraphics centurion xv version 15.1.02. Sự khác biệt có ý nghĩa được xác định mức tin cậy ≥ 99%. - Nguyên liệu và dung môi chiết xuất trong quy trình sản xuất cao khô được lựa chọn dựa trên hiệu suất chiết và hoạt tính kháng khuẩn. 2.2.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của quy trình sản xuất cao khô lá Neem Hình 3. Sơ đồ quy trình sản xuất cao khô lá Neem 641
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Hiệu suất chiết Bảng 1. Hiệu suất chiết xuất các loại dung môi Dung Khối lượng bột lá thực Khối lượng cao thực Hiệu suất chiết môi (M1 g) (M2 g) (%) 96% 26,35 4,18 15,85 Lá thu mua 70% 26,37 5,56 21,08 (cao đặc) 50% 26,33 3,99 15,17 25% 25,80 6,37 24,69 Nước 128,71 33,27 25,85 96% 28,26 3,63 12,85 Lá tại 70% 28,22 6,11 21,64 trung tâm 50% 28,27 6,55 23,16 (cao đặc) 25% 28,24 5,92 20,97 Nước 141,17 22,67 16,06 Kết quả việc khảo sát dung môi chiết xuất cao lá Neem được trình bày Bảng 1: đối với cao chiết từ lá Neem thu mua, hiệu suất chiết với dung môi nước là cao nhất (%H = 25,85), kế đến là cồn 25% (%H = 24,69) và thấp nhất là cồn 50% (%H = 15,17). Đối với cao đặc từ lá thu hái tại trung tâm, hiệu suất chiết với dung môi cồn 50% là cao nhất (%H = 23,16), kế đến là cồn 70% (%H= 21,64) và thấp nhất là cồn 96% (%H = 12,85). Như vậy, nhìn chung không có sự khác biệt đáng kể giữa các dung môi, cồn 96% cho hiệu suất chiết thấp hơn các dung môi phân cực còn lại nên có thể sử dụng các loại dung môi này cho các thử nghiệm tiếp theo. 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của cao đặc từ lá thu mua và lá thu hái tại trung tâm khi so sánh với đối chứng âm DMSO trên các chủng vi khuẩn E. coli, S. aureus (Bảng 2) đều có hoạt tính kháng chủng S. aureus và không kháng chủng E. coli. Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn kém hơn so với kháng sinh ciprofloxacin 1 mg/ml (chứng dương). Kết quả của thử nghiệm ghi nhận trong Bảng 2 cho thấy đường kính vòng kháng khuẩn với vi khuẩn S. aureus mẫu cao đặc từ lá thu mua gần tương đương với cao đặc từ lá tại trung tâm cả 4 nồng độ 800 mg/ml, 400 mg/ml, 200 mg/ml, 100 mg/ml, tốt nhất cao đặc chiết với cồn 25% (được xếp hạng b i phần mềm Statgraphics centurion). Kết quả bảng 2 được phân tích theo phương pháp Anova bằng phần mềm Statgraphics cho thấy: với giá trị p
Bảng 2. Đường kính vòng kháng khuẩn theo từng nồng độ Đường kính vòng kháng khuẩn d (mm) Staphylococcus aureus Lá Nồng độ DMSO Ciprofloxacin Cồn 96% Cồn 70% Cồn 50% Cồn 25% Nước thu (mg/ml) (5%) (1 mg/ml) mua b cd d bc a (cao 800 19,2 ± 0,76 16,0 ± 1,73 13,7 ± 1,16 17,7 ± 0,76 - - 39,3 ± 0,29 đặc) b c c b - - a 400 13,7 ± 1,15 9,8 ± 2,02 8,2 ± 0,76 15,7 ± 1,26 39,3 ± 0,29 b bc c b a 200 11,0 ± 1,73 9,5 ± 2,60 6,8 ± 0,29 12,5 ± 0,50 - - 39,3 ± 0,29 b c b a 100 8,5 ± 1,32 6,5 ± 0,00 - 9,7 ± 0,58 - - 39,3 ± 0,29 b c bc b a Lá tại 800 19,0 ± 2,65 13,7 ± 1,15 14,8 ± 3,75 19,3 ± 1,15 - - 39,3 ± 0,29 TT b c c b a (cao 400 14,7 ± 0,58 9,3 ± 1,15 7,7 ± 1,04 15,0 ± 2,00 - - 39,3 ± 0,29 đặc) b c c b - - a 200 12,5 ±1,32 5,8 ± 0,58 6,7 ± 0,76 12,8 ± 1,61 39,3 ± 0,29 b c a 100 10,0 ± 0,00 - - 8,3 ± 1,44 - - 39,3 ± 0,29 b a Lá 800 11,8 ± 0,58 - 39,3 ± 0,29 thu b a mua 400 11,3 ± 1,26 - 39,3 ± 0,29 (cao b - a 200 9,7 ± 0,58 39,3 ± 0,29 khô) b a 100 7,3 ± 0,76 - 39,3 ± 0,29 Escherichia coli Lá 800 - - - - - - 29,3 ± 0,58 thu mua 400 - - - - - - 29,3 ± 0,58 (cao - - - - - - 200 29,3 ± 0,58 đặc) 100 - - - - - - 29,3 ± 0,58 Lá tại 800 - - - - - - 29,3 ± 0,58 TT (cao 400 - - - - - - 29,3 ± 0,58 đặc) - - - - - - 200 29,3 ± 0,58 100 - - - - - - 29,3 ± 0,58 Giá trị Bảng 3 được thể hiện bằng giá trị tr ng bình ± độ lệch chuẩn (SD) với giá trị p
Bảng 3. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên S. aureus Dung môi cồn 25% MIC (mg/ml) Lá thu mua (Cao đặc) 80 Lá tại TT (Cao đặc) 80 Lá thu mua (Cao khô) 80 3.3 Quy trình sản xuất cao khô lá Neem Hoạt tính kháng khuẩn chiết bằng dung môi cồn 25% là tương tự như với cồn 96%, tuy nhiên hiệu suất chiết với cồn 25% cao hơn cả mẫu lá thu mua và tại trung tâm. Để đạt được hiệu suất cao và an toàn trong sản xuất công nghiệp, nghiên cứu lựa chọn quy trình sản xuất chế phẩm cao khô quy mô phòng thí nghiệm từ nguyên liệu lá Neem thu mua với dung môi cồn 25%. Kết quả thu được cao khô với hiệu suất chiết là 25,8%, độ ẩm 5%. Sản phẩm cao khô từ lá thu mua cũng có hoạt tính kháng khuẩn tốt (Bảng 2), tuy nhiên, đường kính vòng kháng khuẩn trên chủng S. aureus nhỏ hơn so với cao đặc, cụ thể chênh lệch từ 1,7 mm (100 mg/ml) đến 4,4 mm (400 mg/ml). Kết quả MIC (bảng 3) cho thấy hoạt tính kháng khuẩn với chủng S. aureus của cao khô tương tự với hoạt tính kháng khuẩn của cao đặc và có khả năng kháng với chủng vi khuẩn gram dương tốt hơn gram âm. Quy trình sản xuất tạo ra sản phẩm cao khô từ bột lá nguyên liệu trải qua giai đoạn gia nhiệt nhiệt độ (60 oC-70 oC) và thời gian nhất định (7 ngày) không ảnh hư ng đến hoạt tính kháng khuẩn của lá Neem. Ngày nay, đa số kháng sinh được sử dụng đều nhằm điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không đúng cách đã dẫn đến tình trạng đề kháng và làm giảm, thậm chí mất hiệu quả điều trị của kháng sinh [2]. Các hợp chất kháng khuẩn nguồn gốc thực vật là một trong những nhóm chế phẩm đáp ứng yêu cầu này [2]. Hiện tại, trên thế giới chưa có nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem chiết xuất với dung môi cồn 25%, đa số các nghiên cứu tập trung vào các dung môi như hexane, methanol, chloroform, ethyl acetate, petroleum ether [8], [10], [13] hoặc nghiên cứu trên dịch chiết từ hạt Neem [3]. Năm 2011, Koona đã chỉ ra dịch chiết lá Neem có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất với dung môi methanol (d=33 mm), chloroform (d=31 mm). Năm 2015, nghiên cứu của Hoda cũng kết luận hoạt tính kháng khuẩn của lá Neem tốt nhất với dung môi chiết là methanol và buthanol. Tại Việt Nam, theo như báo cáo khoa học của tác giả Phạm Thị Kim Hai (2019) đã so sánh lượng cao lá Neem chiết bằng phương pháp ngâm và Soxlet với các dung môi khác nhau; đồng thời so sánh hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết thu được. Kết quả cho thấy với dung môi cồn 96%, hexane, methanol, ethyl acetate đều có khả năng kháng khuẩn tốt với 2 chủng S. aureus và P. aeruginosa [5]. Trong nghiên cứu của Brindha và đồng tác giả (2012), chiết xuất lá Neem trong methanol đã được ghi nhận hoạt tính kháng lại các vi khuẩn B. pumillus, P. aeruginosa và S. aureus với bán kính vòng kháng khuẩn đạt 6 – 10 mm, thử nghiệm trên E. coli không ghi nhận vòng kháng khuẩn [4]. Như vậy, thành phần có hoạt tính kháng khuẩn trong lá Neem nằm trong các phân đoạn từ phân cực (ngoại trừ dung môi nước) đến kém phân cực, tương đồng với kết quả của đề tài khi các dịch chiết cồn đều cho tác dụng kháng khuẩn khác nhau, trong khi dịch chiết nước hoàn toàn không có tác động. Kết luận này cũng được Hoàng Thùy Dương và cộng sự báo cáo năm 2020 [4]; cũng 644
trong nghiên cứu này, chiết xuất với cồn 70% và cồn 96% có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và ức chế nhóm vi khuẩn gram dương tốt hơn nhóm vi khuẩn gram âm. Đề tài còn đánh giá thêm hiệu suất chiết của các dung môi để làm căn cứ lựa chọn cho quy trình sản xuất cao khô, kết quả đã lựa chọn được dung môi cồn 25% cho hiệu suất chiết cao, hoạt tính kháng khuẩn tốt và sản phẩm thu được vẫn có MIC trên S. aureus tương tự như mẫu nguyên liệu ban đầu. Trong nghiên cứu này của chúng tôi đã chứng minh sản phẩm cao khô lá Neem (xoan chịu hạn) có hoạt tính kháng khuẩn tốt với dung môi chiết cồn 25% nhưng vẫn còn kém nhạy so với kháng sinh ciprofloxacin (Bảng 2). Nghiên cứu làm cơ s cho TTNCSXDLMT sản xuất sản phẩm mới có khả năng kháng các bệnh do vi khuẩn gram dương gây ra, trước hết là trên các loại thủy, hải sản tại tỉnh Phú Yên. 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem (xoan chịu hạn) phụ thuộc vào bản chất dung môi chiết xuất và nguồn nguyên liệu. Thông qua việc khảo sát hiệu suất chiết xuất và đánh giá đường kính vòng kháng khuẩn của cao đặc cho thấy cồn 25% là dung môi chiết xuất phù hợp nhất với nguyên liệu là lá thu mua tại Ninh Thuận (%H=25,8), từ đó xây dựng quy trình sản xuất cao khô phục vụ cho việc nuôi trồng thủy hải sản tại Phú Yên. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao khô đã chứng minh quá trình chiết xuất từ bột lá nguyên liệu đến giai đoạn sấy thành cao khô thì phương pháp chiết và nhiệt độ không ảnh hư ng đến hoạt tính kháng khuẩn sản phẩm. Ngoài ra, kết quả trên đã cung cấp chứng cứ khoa học tác dụng của cao khô lá Neem có khả năng điều trị các bệnh do chủng vi khuẩn gram dương gây ra, điển hình là chủng vi khuẩn Staphyloccocus aureus. 4.2 Kiến nghị Cây Neem Azadirachta indica A.Juss Meliaceae là một loài có tiềm năng sinh học rất lớn trong nông nghiệp và dược liệu, đặc biệt là khả năng kháng khuẩn. Trong tương lai, nhóm nghiên cứu chúng tôi sẽ tiếp tục thực hiện xây dựng quy trình định lượng hoạt chất Azadirachtin – một chất có nhiều nhất trong cây và nghiên cứu sâu hơn về việc thử hoạt tính kháng khuẩn in vivo nhằm tạo tiền đề, cơ s khoa học cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TS. Nguyễn Thanh Bình, (2016), "Ảnh hư ng của hợp chất ly trích từ cây neem sử dụng trong điều trị bệnh trên thủy sản đến chất lượng m i trường nước của ao nuôi", Báo cáo ch ên đề Trường đại học Thủ Dầu Một, pp. 1-2,22-25. [2] Nguyễn Tấn Đạt, Nguyễn Bá Tiếp (201 ) "Đánh giá hiệu suất chiết và tác dụng của cao chiết từ gỗ tô mộc (Caesalpinia sappan l.) trong dung môi ethanol với vi khuẩn Escherichia coli", Tạp chí KH Nông nghiệp Việt Nam, 14 (9), pp. 1368-1376. [3] Vũ Văn Độ & cộng sự, (2006), "Chiết tách, tinh sạch và khảo sát tác dụng đối kháng vi sinh vật của salanin từ nhân hạt cây xoan Ấn Độ (Azadirachta indica A. juss) trồng tại Việt Nam", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 14 (2), pp. 24-31. 645
[4] Hoàng Th Dương & cộng sự, (2020), "Thu nhận và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất lá neem (Azadirachta indica) bằng phương pháp ử dụng sóng siêu âm", Công nghệ hóa sinh và protein, Trung tâm Nghiên cứu triển khai Khu Công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh, pp. 218-224. [5] Phạm Thị Kim Hai, (2019), Nghiên cứu chiết tách cao Neem từ lá của cây Neem Ấn Độ bằng các hệ d ng m i khác nha và bước đầu nghiên cứu ứng dụng trong Dược–Mỹ Phẩm–Thuốc bảo vệ thực vật Đề tài Nghiên cứu khoa học, pp.18-38,41. [6] Nguyễn Thị Ý Nhi, (2012), Nghiên cứu thành phần limonoid của lá cây neem Azadirachta indica A. Juss trồng Ninh Thuận, Luận án Tiến ĩ Khoa học Đại học Khoa học tự nhiên, pp. 2-37. [7] A. K. Singh, R. K. Sharma, V. Sharma, T.Singh, et al, (2017), "Isolation, morphological identification and in vitro antibacterial activity of endophytic bacteria isolated from Azadirachta indica (neem) leaves", Vet World, 10 (5), pp. 510-516. [8] Antara Sen, Amla Batra, (2012), "Evaluation of antimicrobial activity of different solvent extracts of medicinal plant: Melia azedarach l.", International Journal of Current Pharmaceutical Research, 4 (2), pp. 67-73. [9] H.S.Puri, (2006), NEEM: The Divine Tree Azadirachta indica, Harwood Academic Publishers, pp. 77-87,121-163. [10] Hoda Salim Khamis Al-Jadidi, Mohammad Amzad Hossain, (2015), "Studies on total phenolics, total flavonoids and antimicrobial activity from the leaves crude extracts of neem traditionally used for the treatment of cough and nausea", beni-suef university journal of basic and applied sciences 4, pp. 93-98. [11] Imam Hashmat, Hussain Azad, Ajij Ahmed, (2012), "Neem (Azadirachta indica A. Juss)-A nat re’ dr g tore: an overview" International Re earch Jo rnal of Biological Sciences, 1 (6), pp. 76-79. [12] Pankaj S, Lokeshwar T, Mukesh B, Vishnu B, (2011), "Review on neem (Azadirachta indica): thousand problems one solution", International Research Journal of Pharmacy, 2 (12), pp. 97-102. [13] Saradhajyothi KOONA, Subbarao BUDIDA, (2011), "Antibacterial Potential of the Extracts of the Leaves of Azadirachta indica Linn.", Notulae Scientia Biologicae, 3 (1), pp. 65-69. [14] Zihadi M A H, Rahman M, Talukder S, Hasan M M, et al, (2019), "Antibacterial efficacy of ethanolic extract of Camellia sinensis and Azadirachta indica leaves on methicillin- resistant Staphylococcus aureus and shiga-toxigenic Escherichia coli", Journal of Advanced Veterinary Animal Research, 6 (2), pp. 247-252. 646