Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2018, 16(6): 571-577<br />
www.vnua.edu.vn<br />
<br />
Vietnam J. Agri. Sci. 2018, Vol. 16, No. 6: 571-577<br />
<br />
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIAO TIẾP (QUORUM SENSING)<br />
GIỮA VI KHUẨN GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP VỚI VIBRIO ALGINOLYTICUS<br />
Trần Thị Thúy Hà*, Nguyễn Thị Hạnh, Phạm Thế Việt, Phan Thị Vân, Trương Thị Mỹ Hạnh<br />
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I<br />
Tác giả liên hệ: thuyha@ria1.org<br />
<br />
*<br />
<br />
Ngày gửi bài: 01.08.2018<br />
<br />
Ngày chấp nhận: 26.08.2018<br />
TÓM TẮT<br />
<br />
Sự liên lạc giữa tế bào vi khuẩn với tế bào vi khuẩn (quorum sensing - QS) có liên quan đến gen độc lực của vi<br />
khuẩn gây bệnh. Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá QS giữa Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan<br />
tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis disease-AHPND) với Vibrio alginolyticus không gây bệnh AHPND, đồng<br />
thời xác định vai trò của tinh dầu quế đối với QS giữa V. parahaemolyticus và V. alginolyticus. Phương pháp sử dụng<br />
bao gồm nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật PCR. Kết quả cho thấy V. alginolyticus đã tiếp nhận gen độc gây bệnh<br />
AHPND từ V. parahaemolyticus trong điều kiện nuôi có sốc nhiệt 3 lần ở 40C (5 phút) và 70C (2 phút) thông qua<br />
cơ chế QS. Ngoài ra, tinh dầu quế sử dụng với liều 0,1 µL/600 µL đã làm rối loạn hệ thống giao tiếp đặc hiệu QS của<br />
vi khuẩn làm V. alginolyticus không tiếp nhận được thông tin của gen độc gây bệnh AHPND ở tôm nước lợ từ V.<br />
parahaemolyticus.<br />
Từ khóa: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, Quorum sensing, tinh dầu quế, AHPND.<br />
<br />
Evaluation of Quorum Sensing Communication between Pathogenic Bactria Causing<br />
Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease and Vibrio Alginolyticus<br />
ABSTRACT<br />
Bacterial cell-to-cell communication (quorum sensing - QS) is associated with the virulence of pathogenic<br />
bacteria. The study was conducted to evaluate the QS communication between Vibrio parahaemolyticus - pathogenic<br />
agent causing acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) and V. alginolyticus- non-AHPND and,<br />
concurrently, to determine the role of cinnamon essential oil for QS between two bacterial species mentioned above.<br />
The methods used included traditional bacterial culture and PCR technique. Results showed that V. alginolyticus<br />
received virulence gene AHPND from V. parahaemolyticus under the culture condition with three times of heat shock<br />
0<br />
0<br />
at 40 C (5 min) and 70 C (2 min) via QS mechanism. In addition, cinnamon essential oil with a dose of 0.1μL/600μL<br />
disrupted the QS communication system of bacteria, causing V. alginolyticus impossible to receive virulence gene<br />
causing AHPND from V. parahaemolyticus.<br />
Keywords: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, Quorum sensing, cinnamomum essential oil, AHPND<br />
<br />
1. ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Quorum sensing (QS) là một däng “ngôn<br />
ngữ giao tiếp của vi khuèn”, chúng có thể liên<br />
läc và trao đổi thông tin để cộng tác thông qua<br />
các vật chçt mang tín hiệu (Schauder & Bassler,<br />
2001). Hæu hết các vi khuèn gây bệnh với hệ QS<br />
đã được nghiên cứu đều cho thçy rằng QS có<br />
<br />
liên quan đến gen gây bệnh hay tính độc lực của<br />
vi khuèn gây bệnh (Coutteau & Goossens, 2013;<br />
Defoirdt & Sorgeloos, 2012). Kết quâ của cơ chế<br />
tác động QS là lan truyền phân tử tín hiệu/gen<br />
mã hóa độc lực cho vi khuèn liền kề, từ đó gia<br />
tăng mật độ vi khuèn có chứa gen độc lực đủ lớn<br />
để gây häi cho vật chủ, đồng thời các chủng vi<br />
khuèn sau khi tiếp nhận được tín hiệu gen mã<br />
<br />
571<br />
<br />
Đánh giá khả năng giao tiếp (Quorum sensing) giữa vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp với Vibrio alginolyticus<br />
<br />
hóa độc lực sẽ trâi qua quá trình sinh sân để gia<br />
tăng về số lượng (Waters & Bassler, 2005).<br />
Nghiên cứu giâi pháp làm rối loän cơ chế<br />
QS của vi khuèn gây bệnh, khiến cho phân tử<br />
tín hiệu mã hóa gen độc lực không được lan<br />
truyền cho vi khuèn liền kề là hướng nghiên<br />
cứu hiện nay đang được quan tâm, giúp kiểm<br />
soát mật độ vi khuèn mang gen độc lực gây<br />
bệnh cũng như việc hän chế vật nuôi nhiễm<br />
bệnh. Một số hoät chçt được xác định có hiệu<br />
quâ như halogen furanons được chiết xuçt từ<br />
tâo đỏ (một loài tâo biển), dịch chiết xuçt thô từ<br />
cåy chó đẻ răng cưa (Phyllanthus amarus)<br />
(Priya et al., 2013), vỏ cây quế (Cinnamomum<br />
verum) (Yap et al., 2015) đã được chứng minh có<br />
khâ năng ức chế QS, gây rối loän thông tin làm<br />
giâm quá trình truyền và tiếp nhận thông tin<br />
của gen độc lực ở vi khuèn gây bệnh, qua đó bâo<br />
vệ cá tôm không bị nhiễm tác nhân gây bệnh<br />
(Defoirdt, 2007; Rasch et al., 2004).<br />
Bệnh hoäi tử gan tụy cçp (Acute<br />
Hepatopancreatic Necrosis Disease-AHPND)<br />
xuçt hiện læn đæu tiên täi Trung Quốc năm<br />
2009, tiếp đến được ghi nhận täi Thái Lan năm<br />
2010, Việt Nam năm 2011, Malaysia năm 2012<br />
(FAO, 2013), Mexico năm 2013 (Schryver et al.,<br />
2014) và gæn đåy nhçt là ở Mỹ La tinh năm<br />
2017 (Han, 2017). Tác nhân gây bệnh AHPND<br />
được xác định là V. parahaemolyticus (Tran et<br />
al., 2013), V. harveyi (Kondo et al., 2015) và V.<br />
campbellii (Han, 2017). Ba chủng vi khuèn này<br />
đều chứa gen pirABvp- một loäi gen độc gây<br />
AHPND ở tôm. Điều đó cũng chỉ ra, gen sinh<br />
độc tố gây AHPND có thể lan truyền theo chiêu<br />
ngang giữa các loài vi khuèn (từ V.<br />
parahaemolyticus<br />
sang V.<br />
harveyi,<br />
V.<br />
campbellii) trong các ao nuôi tôm thông qua cơ<br />
chế QS của loài vi khuèn gây bệnh. Mục đích<br />
của nghiên cứu nhằm xác định điều kiện xây ra<br />
cơ chế QS ở vi khuèn gây AHPND ở tôm nuôi<br />
nước lợ, đồng thời xác định vai trò của dịch chiết<br />
từ vỏ quế ânh hưởng đến rối loän truyền thông<br />
tin QS của vi khuèn gây AHPND. Trong môi<br />
trường ao nuôi tôm nước lợ thường xuyên có mặt<br />
các chủng thuộc Vibrio, trong nghiên cứu này<br />
<br />
572<br />
<br />
chúng tôi lựa chọn V. alginolyticus bởi lẽ V.<br />
alginolyticus và V. parahaemolyticus là hai<br />
chủng vi khuèn khi phát triển trên TCBS læn<br />
lượt có khuèn läc màu vàng và xanh. Sự khác<br />
biệt về màu sắc giúp nghiên cứu dễ dàng phân<br />
biệt tách được 2 chủng V. alginolyticus và V.<br />
parahaemolyticus sau khi nuôi chung trong<br />
cùng môi trường.<br />
<br />
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br />
2.1. Vật liệu nghiên cứu<br />
Vi khuèn V. parahaemolyticus gây bệnh<br />
AHPND được lưu giữ täi Trung tâm Quan trắc<br />
môi trường và bệnh thủy sân miền Bắc<br />
(CEDMA), Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sân<br />
I. Vi khuèn Vibrio alginolyticus trong nước lợ<br />
nuôi tôm.<br />
Môi trường tối ưu của vi khuèn Vibrio sp. là<br />
Thiosulfate Citrate Bile Salts (TCBS), đun sôi<br />
để nguội đến 40-50C rồi đổ ra đĩa peptri để sử<br />
dụng nuôi cçy vi khuèn. Môi trường nuôi cçy cơ<br />
bân Nutrient Broth (NB) có bổ sung 2% NaCl,<br />
được hçp tiệt trùng ở 121C trong 15 phút rồi để<br />
nguội dùng nuôi tăng sinh vi khuèn V.<br />
parahaemolyticus và V. alginolyticus.<br />
Sân phèm tinh dæu quế được chiết xuçt từ<br />
cây quế (Cinnamomum sp).<br />
2.2. Phương pháp nghiên cứu<br />
Các bước thực hiện nghiên cứu được mô tâ<br />
bằng hình 1.<br />
Trong 5 ống eppendoft (1, 2, 3, 4 và 5): chứa<br />
300 µL V. parahaemolyticus và 300 µL V.<br />
alginolyticus. Ống 1 hỗn hợp vi khuèn được cho<br />
vào 100 mL Nutrient broth có bổ sung 2% NaCl<br />
(NB 2% NaCl) nuôi lắc 200 vòng/phút trong 29C<br />
sau 15 giờ trang vi khuèn lên đĩa thäch TCBS.<br />
Ống 2, 3, hỗn dịch được sốc nhiệt læn lượt 40C<br />
trong 5 phút, 3 læn và 70C trong 2 phút 3 læn.<br />
Ống 4, 5 được thực hiện tương tự ống 3,4 tuy<br />
nhiên có bổ sung 0,1 µL tinh dæu quế trước khi<br />
sốc nhiệt. Ống 2, 3, 4 và 5 tiếp tục nuôi ở 29C<br />
trong 3 h trước khi trang trên đĩa thäch TCBS.<br />
<br />
Trần Thị Thúy Hà, Nguyễn Thị Hạnh, Phạm Thế Việt, Phan Thị Vân, Trương Thị Mỹ Hạnh<br />
<br />
V. parahaemolyticus lưu từ tủ -80C<br />
<br />
Nước lợ nuôi tôm<br />
<br />
Chọn khuẩn lạc màu vàng<br />
<br />
Kiểm tra lại sinh hóa bằng<br />
API20E và PCR<br />
<br />
Phân lập, định danh loài theo<br />
phương pháp truyền thống và<br />
test API20E<br />
<br />
Đúng V. parahaemolyticus<br />
gây bệnh AHPND<br />
<br />
Kết quả được V. alginolyticus<br />
không gây bệnh AHPND<br />
<br />
Cấy ria vi khuẩn lên TCBS<br />
<br />
Chọn 1 khuẩn lạc tăng sinh trong<br />
Nutrien broth bổ sung 2% NaCl<br />
<br />
Ống 1<br />
<br />
Phân tích PCR có kết<br />
quả âm tính với AHPND<br />
<br />
Chuẩn bị 5 ống eppendof<br />
<br />
Ống 2<br />
<br />
Ống 3<br />
<br />
Ống 4<br />
<br />
Ống 5<br />
<br />
Cấy trang lên đĩa thạch TCBS, ủ ở 290C trong 24 h<br />
<br />
Chọn khuẩn lạc vàng (V. alginolyticus)<br />
<br />
Chọn khuẩn lạc xanh (V. parahaemolyticus )<br />
<br />
Phân tích PCR xác định mẫu dương/âm tính AHPND<br />
<br />
Kết luận<br />
<br />
Hình 1. Các bước thực hiện nghiên cứu<br />
Phân tích vi khuẩn gây bệnh AHPND bằng<br />
kỹ thuật PCR: sử dụng cặp mồi AP3 (F:<br />
ATGAGTAACAATAAAACATGAAAC;<br />
R:<br />
GTGGTAATATTGTACAGAA) được công bố bởi<br />
Sirikharin et al. (2014). Cặp mồi AP3 đã khuếch<br />
đäi đoän gen 336 bp của gen Toxin gây hoäi tử<br />
gan tụy cçp ở tôm, chu kỳ nhiệt của phân ứng<br />
PCR được áp dụng như sau: 95C (5 phút), [35<br />
chu kỳ (94C trong 1 phút, 53C trong 30 giây<br />
và 72C trong 40 giây)], 72C (5 phút) và 4C<br />
<br />
(∞). Sân phèm PCR được điện di trên thäch<br />
agarose 1% trong dung dịch 1X TAE và đọc kết<br />
quâ dưới đèn UV.<br />
<br />
3. KẾT QUÂ VÀ THÂO LUẬN<br />
3.1. Quorum sensing giữa vi khuẩn gây<br />
AHPND và vi khuẩn không gây AHPND<br />
Trong nghiên cứu này vi khuèn Vibrio<br />
parahaemolyticus có khuèn läc màu xanh khi<br />
573<br />
<br />
Đánh giá khả năng giao tiếp (Quorum sensing) giữa vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp với Vibrio alginolyticus<br />
<br />
ce<br />
d<br />
13<br />
<br />
ce<br />
d<br />
18<br />
<br />
A<br />
<br />
Ký hiệu<br />
<br />
O<br />
N<br />
P<br />
G<br />
<br />
A<br />
D<br />
H<br />
<br />
L<br />
D<br />
C<br />
<br />
O<br />
D<br />
C<br />
<br />
C<br />
I<br />
T<br />
<br />
H<br />
2<br />
S<br />
<br />
U<br />
R<br />
E<br />
<br />
T<br />
D<br />
A<br />
<br />
I<br />
N<br />
D<br />
<br />
V<br />
P<br />
<br />
G<br />
E<br />
L<br />
<br />
G<br />
L<br />
U<br />
<br />
M<br />
A<br />
N<br />
<br />
I<br />
N<br />
O<br />
<br />
S<br />
O<br />
R<br />
<br />
R<br />
H<br />
A<br />
<br />
S<br />
A<br />
C<br />
<br />
M<br />
E<br />
L<br />
<br />
A<br />
M<br />
Y<br />
<br />
A<br />
R<br />
A<br />
<br />
Tên loài<br />
<br />
CED13<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
+<br />
<br />
-<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
+<br />
<br />
-<br />
<br />
V.parahaemolyticus<br />
<br />
CED18<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
+<br />
<br />
-<br />
<br />
w<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
+<br />
<br />
w<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
-<br />
<br />
+<br />
<br />
-<br />
<br />
+<br />
<br />
-<br />
<br />
V.alginolyticus<br />
<br />
400bp<br />
300bp<br />
<br />
B<br />
<br />
(1): V.parahaemolyticus,<br />
(2): Đối chứng dương,<br />
(3): V. alginolyticus,<br />
(-): Đối chứng âm và (M): Marker<br />
<br />
Ghi chú: A: Đặc điểm sinh hóa của V. parahaemolyticus và V. Alginolyticus; B: xác định chủng vi khuẩn gây AHPND bằng kỹ<br />
thuật PCR.<br />
<br />
Hình 2. Đặc tính của vi khuẩn<br />
phát triển trên môi trường thäch TCBS, màu<br />
xanh do vi khuèn không có khâ năng lên men<br />
đường saccarose và rõ ràng phân ứng đường ở<br />
ống mang mã SAC có màu xanh (Hình 1A). V.<br />
alginolyticus có khuèn läc màu vàng trên TCBS<br />
do vi khuèn đã lên lên men đường saccarose täo<br />
ra màu vàng ở ống tuýp mang mã SAC ở test<br />
API20E (Hình 2A). Kết quâ phân tích bằng kỹ<br />
thuật PCR với cặp mồi AP3 (khuếch đäi gen<br />
toxin gây hoäi tử gan tụy cçp ở tôm) đã chỉ ra V.<br />
parahaemolyticus là tác nhân gây AHPND và V.<br />
alginolyticus không phâi là tác nhân gây bệnh<br />
AHPND (Hình 2B).<br />
Nuôi tăng sinh chung trong môi trường lỏng<br />
2 chủng vi khuèn V. parahaemolyticus và V.<br />
alginolyticus ở điều kiện 29C, lắc 200<br />
vòng/phút, sau 15 h định lượng lçy riêng lẻ<br />
khuèn läc xanh và vàng phân tích PCR với cặp<br />
mồi AP3. Kết quâ cho thçy khuèn läc xanh (V.<br />
parahaemolyticus) xuçt hiện väch có kích thước<br />
336 bp trùng khớp với đối chứng dương trong<br />
khi đó khuèn läc vàng (V. alginolyticus) không<br />
có väch nào xuçt hiện trên bân gel tương ứng<br />
với đối chứng åm, điều đó chứng tỏ V.<br />
alginolyticus không nhận được tín hiệu phân tử<br />
<br />
574<br />
<br />
gây bệnh AHPND từ V. parahaemolyticus (Hình<br />
3). Bên cänh đó, khi hỗn hợp 2 chủng vi khuèn<br />
được sốc nhiệt 3 læn ở 40C và 70C læn lượt<br />
tương ứng 5 phút và 2 phút thì kết quâ cho thçy<br />
câ<br />
2<br />
chủng<br />
V.<br />
alginolyticus<br />
và<br />
V.<br />
parahaemolyticus đều xuçt hiện väch dương<br />
tính trên bân gel với kích thước 336 bp (Hình 3).<br />
Như vậy, rõ ràng V. alginolyticus đã nhận phân<br />
tử tín hiệu gen sinh toxin gây AHPND ở tôm<br />
nuôi nước lợ từ V. parahaemolyticus trong điều<br />
kiện sốc nhiệt độ 40C và 70C. Điều kiện môi<br />
trường có vai trò quan trọng ânh hưởng đến quá<br />
trình phát và nhận thông tin (QS) của vi khuèn<br />
gây bệnh đã được một số nghiên cứu chứng<br />
minh và chỉ ra, ở mỗi một loài, chủng vi khuèn<br />
gây bệnh khác nhau chịu tác động của điều kiện<br />
môi trường khác nhau. Cơ chế QS phát và nhận<br />
thông tin của V. vulnificus chịu ânh hưởng của<br />
hàm lượng glucose, dinh dưỡng (McDougald et<br />
al., 2006) và nhiệt độ, sục khí, thời gian (ủ) nuôi<br />
cçy (Hilton et al., 2006). Đối với V. cholerae cơ<br />
chế QS xây ra khi mật độ vi khuèn đủ lớn, vì<br />
vậy QS phụ thuộc vào mật độ của chính vi<br />
khuèn đó trong môi trường (Kamruzzaman et<br />
al., 2010).<br />
<br />
Trần Thị Thúy Hà, Nguyễn Thị Hạnh, Phạm Thế Việt, Phan Thị Vân, Trương Thị Mỹ Hạnh<br />
<br />
400bp<br />
300bp<br />
<br />
Ghi chú: 1, 3 và 5: V. alginolyticus; 2,4 và 6: V. parahaemolyticus, 7 đối chứng âm, 8: đối chứng dương.<br />
<br />
Hình 3. AHPND xác định trong điều kiện nuôi lắc và sốc nhiệt<br />
3.2. Ảnh hưởng của tinh dầu quế đến quá<br />
trình quorum sensing của vi khuẩn<br />
Từ kết quâ nghiên cứu ở nội dung nêu trên,<br />
xác định được ở điều kiện 29C lắc 200<br />
vòng/phút, sau 15 h V. alginolyticus không nhận<br />
<br />
V. parahaemolyticus<br />
<br />
được tín hiệu gen toxin gây AHPND từ<br />
V. parahaemolyticus. Vì vậy, ở nội dung này<br />
nghiên cứu tập trung ở thí nghiệm nhiệt độ40C<br />
(5 phút) và 70C (2 phút). Với môi trường nuôi<br />
cçy vi khuèn có bổ sung tinh dæu quế (0,1<br />
<br />
B<br />
<br />
V. alginolyticus<br />
<br />
400bp<br />
300bp<br />
<br />
A<br />
1 và 3: V. alginolyticus;<br />
2 và 4: V. parahaemolyticus, 5 đối chứng âm,<br />
6 đối chứng dương<br />
Ghi chú: A: Khuẩn lạc mọc sau sốc nhiệt và có bổ sung tinh dầu quế, B: khuẩn lạc thu phân tích AHPND<br />
<br />
Hình 4. Vi khuẩn sốc nhiệt và có bổ sung tinh dầu quế vào môi trường nuôi cấy<br />
<br />
575<br />
<br />