Đánh giá khả năng giao tiếp (Quorum sensing) giữa vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp với Vibrio alginolyticus

Chia sẻ: Tony Tony | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

65
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá QS giữa Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis disease-AHPND) với Vibrio alginolyticus không gây bệnh AHPND, đồng thời xác định vai trò của tinh dầu quế đối với QS giữa V. parahaemolyticus và V. alginolyticus.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đánh giá khả năng giao tiếp (Quorum sensing) giữa vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp với Vibrio alginolyticus

Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2018, 16(6): 571-577 www.vnua.edu.vn Vietnam J. Agri. Sci. 2018, Vol. 16, No. 6: 571-577 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIAO TIẾP (QUORUM SENSING) GIỮA VI KHUẨN GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP VỚI VIBRIO ALGINOLYTICUS Trần Thị Thúy Hà*, Nguyễn Thị Hạnh, Phạm Thế Việt, Phan Thị Vân, Trương Thị Mỹ Hạnh Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I Tác giả liên hệ: thuyha@ria1.org * Ngày gửi bài: 01.08.2018 Ngày chấp nhận: 26.08.2018 TÓM TẮT Sự liên lạc giữa tế bào vi khuẩn với tế bào vi khuẩn (quorum sensing - QS) có liên quan đến gen độc lực của vi khuẩn gây bệnh. Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá QS giữa Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis disease-AHPND) với Vibrio alginolyticus không gây bệnh AHPND, đồng thời xác định vai trò của tinh dầu quế đối với QS giữa V. parahaemolyticus và V. alginolyticus. Phương pháp sử dụng bao gồm nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật PCR. Kết quả cho thấy V. alginolyticus đã tiếp nhận gen độc gây bệnh AHPND từ V. parahaemolyticus trong điều kiện nuôi có sốc nhiệt 3 lần ở 40C (5 phút) và 70C (2 phút) thông qua cơ chế QS. Ngoài ra, tinh dầu quế sử dụng với liều 0,1 µL/600 µL đã làm rối loạn hệ thống giao tiếp đặc hiệu QS của vi khuẩn làm V. alginolyticus không tiếp nhận được thông tin của gen độc gây bệnh AHPND ở tôm nước lợ từ V. parahaemolyticus. Từ khóa: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, Quorum sensing, tinh dầu quế, AHPND. Evaluation of Quorum Sensing Communication between Pathogenic Bactria Causing Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease and Vibrio Alginolyticus ABSTRACT Bacterial cell-to-cell communication (quorum sensing - QS) is associated with the virulence of pathogenic bacteria. The study was conducted to evaluate the QS communication between Vibrio parahaemolyticus - pathogenic agent causing acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) and V. alginolyticus- non-AHPND and, concurrently, to determine the role of cinnamon essential oil for QS between two bacterial species mentioned above. The methods used included traditional bacterial culture and PCR technique. Results showed that V. alginolyticus received virulence gene AHPND from V. parahaemolyticus under the culture condition with three times of heat shock 0 0 at 40 C (5 min) and 70 C (2 min) via QS mechanism. In addition, cinnamon essential oil with a dose of 0.1μL/600μL disrupted the QS communication system of bacteria, causing V. alginolyticus impossible to receive virulence gene causing AHPND from V. parahaemolyticus. Keywords: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, Quorum sensing, cinnamomum essential oil, AHPND 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Quorum sensing (QS) là một däng “ngôn ngữ giao tiếp của vi khuèn”, chúng có thể liên läc và trao đổi thông tin để cộng tác thông qua các vật chçt mang tín hiệu (Schauder & Bassler, 2001). Hæu hết các vi khuèn gây bệnh với hệ QS đã được nghiên cứu đều cho thçy rằng QS có liên quan đến gen gây bệnh hay tính độc lực của vi khuèn gây bệnh (Coutteau & Goossens, 2013; Defoirdt & Sorgeloos, 2012). Kết quâ của cơ chế tác động QS là lan truyền phân tử tín hiệu/gen mã hóa độc lực cho vi khuèn liền kề, từ đó gia tăng mật độ vi khuèn có chứa gen độc lực đủ lớn để gây häi cho vật chủ, đồng thời các chủng vi khuèn sau khi tiếp nhận được tín hiệu gen mã 571 Đánh giá khả năng giao tiếp (Quorum sensing) giữa vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp với Vibrio alginolyticus hóa độc lực sẽ trâi qua quá trình sinh sân để gia tăng về số lượng (Waters & Bassler, 2005). Nghiên cứu giâi pháp làm rối loän cơ chế QS của vi khuèn gây bệnh, khiến cho phân tử tín hiệu mã hóa gen độc lực không được lan truyền cho vi khuèn liền kề là hướng nghiên cứu hiện nay đang được quan tâm, giúp kiểm soát mật độ vi khuèn mang gen độc lực gây bệnh cũng như việc hän chế vật nuôi nhiễm bệnh. Một số hoät chçt được xác định có hiệu quâ như halogen furanons được chiết xuçt từ tâo đỏ (một loài tâo biển), dịch chiết xuçt thô từ cåy chó đẻ răng cưa (Phyllanthus amarus) (Priya et al., 2013), vỏ cây quế (Cinnamomum verum) (Yap et al., 2015) đã được chứng minh có khâ năng ức chế QS, gây rối loän thông tin làm giâm quá trình truyền và tiếp nhận thông tin của gen độc lực ở vi khuèn gây bệnh, qua đó bâo vệ cá tôm không bị nhiễm tác nhân gây bệnh (Defoirdt, 2007; Rasch et al., 2004). Bệnh hoäi tử gan tụy cçp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease-AHPND) xuçt hiện læn đæu tiên täi Trung Quốc năm 2009, tiếp đến được ghi nhận täi Thái Lan năm 2010, Việt Nam năm 2011, Malaysia năm 2012 (FAO, 2013), Mexico năm 2013 (Schryver et al., 2014) và gæn đåy nhçt là ở Mỹ La tinh năm 2017 (Han, 2017). Tác nhân gây bệnh AHPND được xác định là V. parahaemolyticus (Tran et al., 2013), V. harveyi (Kondo et al., 2015) và V. campbellii (Han, 2017). Ba chủng vi khuèn này đều chứa gen pirABvp- một loäi gen độc gây AHPND ở tôm. Điều đó cũng chỉ ra, gen sinh độc tố gây AHPND có thể lan truyền theo chiêu ngang giữa các loài vi khuèn (từ V. parahaemolyticus sang V. harveyi, V. campbellii) trong các ao nuôi tôm thông qua cơ chế QS của loài vi khuèn gây bệnh. Mục đích của nghiên cứu nhằm xác định điều kiện xây ra cơ chế QS ở vi khuèn gây AHPND ở tôm nuôi nước lợ, đồng thời xác định vai trò của dịch chiết từ vỏ quế ânh hưởng đến rối loän truyền thông tin QS của vi khuèn gây AHPND. Trong môi trường ao nuôi tôm nước lợ thường xuyên có mặt các chủng thuộc Vibrio, trong nghiên cứu này 572 chúng tôi lựa chọn V. alginolyticus bởi lẽ V. alginolyticus và V. parahaemolyticus là hai chủng vi khuèn khi phát triển trên TCBS læn lượt có khuèn läc màu vàng và xanh. Sự khác biệt về màu sắc giúp nghiên cứu dễ dàng phân biệt tách được 2 chủng V. alginolyticus và V. parahaemolyticus sau khi nuôi chung trong cùng môi trường. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vi khuèn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND được lưu giữ täi Trung tâm Quan trắc môi trường và bệnh thủy sân miền Bắc (CEDMA), Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sân I. Vi khuèn Vibrio alginolyticus trong nước lợ nuôi tôm. Môi trường tối ưu của vi khuèn Vibrio sp. là Thiosulfate Citrate Bile Salts (TCBS), đun sôi để nguội đến 40-50C rồi đổ ra đĩa peptri để sử dụng nuôi cçy vi khuèn. Môi trường nuôi cçy cơ bân Nutrient Broth (NB) có bổ sung 2% NaCl, được hçp tiệt trùng ở 121C trong 15 phút rồi để nguội dùng nuôi tăng sinh vi khuèn V. parahaemolyticus và V. alginolyticus. Sân phèm tinh dæu quế được chiết xuçt từ cây quế (Cinnamomum sp). 2.2. Phương pháp nghiên cứu Các bước thực hiện nghiên cứu được mô tâ bằng hình 1. Trong 5 ống eppendoft (1, 2, 3, 4 và 5): chứa 300 µL V. parahaemolyticus và 300 µL V. alginolyticus. Ống 1 hỗn hợp vi khuèn được cho vào 100 mL Nutrient broth có bổ sung 2% NaCl (NB 2% NaCl) nuôi lắc 200 vòng/phút trong 29C sau 15 giờ trang vi khuèn lên đĩa thäch TCBS. Ống 2, 3, hỗn dịch được sốc nhiệt læn lượt 40C trong 5 phút, 3 læn và 70C trong 2 phút 3 læn. Ống 4, 5 được thực hiện tương tự ống 3,4 tuy nhiên có bổ sung 0,1 µL tinh dæu quế trước khi sốc nhiệt. Ống 2, 3, 4 và 5 tiếp tục nuôi ở 29C trong 3 h trước khi trang trên đĩa thäch TCBS. Trần Thị Thúy Hà, Nguyễn Thị Hạnh, Phạm Thế Việt, Phan Thị Vân, Trương Thị Mỹ Hạnh V. parahaemolyticus lưu từ tủ -80C Nước lợ nuôi tôm Chọn khuẩn lạc màu vàng Kiểm tra lại sinh hóa bằng API20E và PCR Phân lập, định danh loài theo phương pháp truyền thống và test API20E Đúng V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND Kết quả được V. alginolyticus không gây bệnh AHPND Cấy ria vi khuẩn lên TCBS Chọn 1 khuẩn lạc tăng sinh trong Nutrien broth bổ sung 2% NaCl Ống 1 Phân tích PCR có kết quả âm tính với AHPND Chuẩn bị 5 ống eppendof Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Cấy trang lên đĩa thạch TCBS, ủ ở 290C trong 24 h Chọn khuẩn lạc vàng (V. alginolyticus) Chọn khuẩn lạc xanh (V. parahaemolyticus ) Phân tích PCR xác định mẫu dương/âm tính AHPND Kết luận Hình 1. Các bước thực hiện nghiên cứu Phân tích vi khuẩn gây bệnh AHPND bằng kỹ thuật PCR: sử dụng cặp mồi AP3 (F: ATGAGTAACAATAAAACATGAAAC; R: GTGGTAATATTGTACAGAA) được công bố bởi Sirikharin et al. (2014). Cặp mồi AP3 đã khuếch đäi đoän gen 336 bp của gen Toxin gây hoäi tử gan tụy cçp ở tôm, chu kỳ nhiệt của phân ứng PCR được áp dụng như sau: 95C (5 phút), [35 chu kỳ (94C trong 1 phút, 53C trong 30 giây và 72C trong 40 giây)], 72C (5 phút) và 4C (∞). Sân phèm PCR được điện di trên thäch agarose 1% trong dung dịch 1X TAE và đọc kết quâ dưới đèn UV. 3. KẾT QUÂ VÀ THÂO LUẬN 3.1. Quorum sensing giữa vi khuẩn gây AHPND và vi khuẩn không gây AHPND Trong nghiên cứu này vi khuèn Vibrio parahaemolyticus có khuèn läc màu xanh khi 573 Đánh giá khả năng giao tiếp (Quorum sensing) giữa vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp với Vibrio alginolyticus ce d 13 ce d 18 A Ký hiệu O N P G A D H L D C O D C C I T H 2 S U R E T D A I N D V P G E L G L U M A N I N O S O R R H A S A C M E L A M Y A R A Tên loài CED13 - - + + - - - - + - + + + - - - - - + - V.parahaemolyticus CED18 - - + - w - - - + w + + + - - - + - + - V.alginolyticus 400bp 300bp B (1): V.parahaemolyticus, (2): Đối chứng dương, (3): V. alginolyticus, (-): Đối chứng âm và (M): Marker Ghi chú: A: Đặc điểm sinh hóa của V. parahaemolyticus và V. Alginolyticus; B: xác định chủng vi khuẩn gây AHPND bằng kỹ thuật PCR. Hình 2. Đặc tính của vi khuẩn phát triển trên môi trường thäch TCBS, màu xanh do vi khuèn không có khâ năng lên men đường saccarose và rõ ràng phân ứng đường ở ống mang mã SAC có màu xanh (Hình 1A). V. alginolyticus có khuèn läc màu vàng trên TCBS do vi khuèn đã lên lên men đường saccarose täo ra màu vàng ở ống tuýp mang mã SAC ở test API20E (Hình 2A). Kết quâ phân tích bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi AP3 (khuếch đäi gen toxin gây hoäi tử gan tụy cçp ở tôm) đã chỉ ra V. parahaemolyticus là tác nhân gây AHPND và V. alginolyticus không phâi là tác nhân gây bệnh AHPND (Hình 2B). Nuôi tăng sinh chung trong môi trường lỏng 2 chủng vi khuèn V. parahaemolyticus và V. alginolyticus ở điều kiện 29C, lắc 200 vòng/phút, sau 15 h định lượng lçy riêng lẻ khuèn läc xanh và vàng phân tích PCR với cặp mồi AP3. Kết quâ cho thçy khuèn läc xanh (V. parahaemolyticus) xuçt hiện väch có kích thước 336 bp trùng khớp với đối chứng dương trong khi đó khuèn läc vàng (V. alginolyticus) không có väch nào xuçt hiện trên bân gel tương ứng với đối chứng åm, điều đó chứng tỏ V. alginolyticus không nhận được tín hiệu phân tử 574 gây bệnh AHPND từ V. parahaemolyticus (Hình 3). Bên cänh đó, khi hỗn hợp 2 chủng vi khuèn được sốc nhiệt 3 læn ở 40C và 70C læn lượt tương ứng 5 phút và 2 phút thì kết quâ cho thçy câ 2 chủng V. alginolyticus và V. parahaemolyticus đều xuçt hiện väch dương tính trên bân gel với kích thước 336 bp (Hình 3). Như vậy, rõ ràng V. alginolyticus đã nhận phân tử tín hiệu gen sinh toxin gây AHPND ở tôm nuôi nước lợ từ V. parahaemolyticus trong điều kiện sốc nhiệt độ 40C và 70C. Điều kiện môi trường có vai trò quan trọng ânh hưởng đến quá trình phát và nhận thông tin (QS) của vi khuèn gây bệnh đã được một số nghiên cứu chứng minh và chỉ ra, ở mỗi một loài, chủng vi khuèn gây bệnh khác nhau chịu tác động của điều kiện môi trường khác nhau. Cơ chế QS phát và nhận thông tin của V. vulnificus chịu ânh hưởng của hàm lượng glucose, dinh dưỡng (McDougald et al., 2006) và nhiệt độ, sục khí, thời gian (ủ) nuôi cçy (Hilton et al., 2006). Đối với V. cholerae cơ chế QS xây ra khi mật độ vi khuèn đủ lớn, vì vậy QS phụ thuộc vào mật độ của chính vi khuèn đó trong môi trường (Kamruzzaman et al., 2010). Trần Thị Thúy Hà, Nguyễn Thị Hạnh, Phạm Thế Việt, Phan Thị Vân, Trương Thị Mỹ Hạnh 400bp 300bp Ghi chú: 1, 3 và 5: V. alginolyticus; 2,4 và 6: V. parahaemolyticus, 7 đối chứng âm, 8: đối chứng dương. Hình 3. AHPND xác định trong điều kiện nuôi lắc và sốc nhiệt 3.2. Ảnh hưởng của tinh dầu quế đến quá trình quorum sensing của vi khuẩn Từ kết quâ nghiên cứu ở nội dung nêu trên, xác định được ở điều kiện 29C lắc 200 vòng/phút, sau 15 h V. alginolyticus không nhận V. parahaemolyticus được tín hiệu gen toxin gây AHPND từ V. parahaemolyticus. Vì vậy, ở nội dung này nghiên cứu tập trung ở thí nghiệm nhiệt độ40C (5 phút) và 70C (2 phút). Với môi trường nuôi cçy vi khuèn có bổ sung tinh dæu quế (0,1 B V. alginolyticus 400bp 300bp A 1 và 3: V. alginolyticus; 2 và 4: V. parahaemolyticus, 5 đối chứng âm, 6 đối chứng dương Ghi chú: A: Khuẩn lạc mọc sau sốc nhiệt và có bổ sung tinh dầu quế, B: khuẩn lạc thu phân tích AHPND Hình 4. Vi khuẩn sốc nhiệt và có bổ sung tinh dầu quế vào môi trường nuôi cấy 575