Đề tài: Hệ enzym pectinase

Chia sẻ: Chu Thi Huong | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:44

Thêm vào BST

Báo xấu

530
lượt xem 156
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

_Pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Pectin là polysaccharide dị thể. Về bản chất hoá học, pectin là polygalacturonic được phân bố rộng rãi trong các mô thực vật, hoà tan trong dịch thực vật. Có nhiều trong các loại quả, củ, đặc biệt là trong cùi trắng của bưởi, cam, chanh. _Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic kết hợp với nhau bằng liên kết -1,4-glucosid tạo nên....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài: Hệ enzym pectinase

Seminar Heä enzym pectinase MUÏC LUÏC: • I. Enzyme ...................................................................................................... 2 I.1.Khaùi nieäm ................................................................................................ 2 I.2 . Phaân loaïi enzyme................................................................................... 2 II. Pectin ........................................................................................................ 3 II.1. Giôùi thieäu ............................................................................................... 3 II.2 . Phaân loaïi ............................................................................................... 4 II.3. Caáu taïo .................................................................................................. 6 II.4. Tính ch t chung cuûa pectin .................................................................... 7 III. Pectinase ................................................................................................. 7 III.1 . Giôùi thieäu ............................................................................................ 7 III.2 . Khaùi nieäm ............................................................................................ 8 III.3. Trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme pectinase ....................................... 8 III.4. Phaân loaïi .............................................................................................. 8 IV. Cô cheá taùc duïng .................................................................................... 10 IV.1 . Pectinesterase (PE) ........................................................................... 10 IV.2 . Polygalacturonase (PG)..................................................................... 12 IV.3. Pectate lyase (PEL)............................................................................ 18 IV.4. YÙ nghóa veà maët kyõ thuaät cuûa caùc endo-enzyme ................................. 19 V. Nguoàn thu nhaän enzyme pectinase ........................................................ 23 V.1.Thöïc vaät................................................................................................ 23 V.2.Vi sinh vaät ............................................................................................ 25 VI. Caùc phöông phaùp thu nhaän enzyme pectinase:..................................... 30 VI.1. Thu nhaän cheá phaåm pectinase töø canh tröôøng beà maët ................. 30 VI.2. Thu nhaän cheá phaåm pectinase töø canh tröôøng beà saâu .................. 30 VI.2.1 Phöông phaùp hieáu khí................................................................. 30 VI.2.2 Phöông phaùp yeám khí................................................................. 31 VI.3. .Phương pháp nuôi c y các ch ng n m m c và tách chi t enzyme pectinase t môi trư ng nuôi c y ....................................................................32 VII.Xác nh ho t tính enzyme pectinase .......................................................33 VII.1.Phương pháp xác nh ho t enzim pectinaza ..............................33 VII.2.Phương pháp kh o sát i u ki n thu nh n và c tính c a enzyme pectinase ( tác nhân t a , nhi t , pH t i ưu) ................................................35 VII.3.Phương pháp tinh s ch enzyme pectinase........................................35 VIII. Vai troø vaø öùng duïng cuûa enzyme pectinase ...................................... 36 Taøi lieäu tham khaûo ...................................................................................... 44 -1-
Seminar Heä enzym pectinase I.TOÅNG QUAN VEÀ ENZYME I.1.Khaùi nieäm:[1] _Enzym laø moät loaïi protein ñöôïc sinh vaät toång hôïp neân vaø tham gia vaøo caùc phaûn öùng sinh hoïc. _Ñaëc tính sinh hoïc chung cuûa enzym: * Ñöôïc taïo ra trong teá baøo sinh vaät * Tham gia phaûn öùng caû trong teá baøo soáng vaø caû khi enzyme ñöôïc taùch khoûi teá baøo soáng. *Tham gia phaûn öùng trong ñieàu lieän nhieät ñoä oân hoaø. *Coù theå tham gia xuùc taùc caùc phaûn öùng caùc phaûn öùng trong vaø ngoaøi cô theå töø giai ñoaïn ñaàu ñeán giai ñoaïn giaûi phoùnghoaøn toaøn naêng löôïng döï tröû trong caùc hôïp chaát hoaù hoïc. * Coù theå thöïc hieän 1 phaûn öùng. * haûn öùng enzym laø nhöõng phaûn öùng tieâu hao naêng löôïng raát ít. * Enzym chòu söï ñieàu khieån bôûi gen vaø caùc ñieàu kieän phaûn öùng. I.2 . Phaân loaïi enzyme:[1] • Lôùp • Phaûn öùng xuùc taùc • 1. Oxidoreductase • nhaän vaø loaïi H • 2. Transferase • Chuyeån vò caùc nhoùm • 3. Hydrolase • Phaûn öùng thuyû phaân • 4. Lyase • Phaûn öùng phaân caét • 5. Isomerase • Phaûn öùng ñoàng phaân hoaù • 6. Ligase • Taïo thaønh lieân keát söû duïng ATP • Baûng 1: Phaân loaïi enzyme Döïa vaøo söï phaân lôùp naøy maø ngöôùi ta coù maõ soá cho töøng loaïi enzyme Ví duï: Enzym pctinesterase coù maõ soá laø E.C.3.1.1.11 nghóa laø enzym thuoäc lôùp hydrolase, coù lieân keát este Moät soá nguoàn enzyme vaø enzym quan troïng: Nguoàn ÑV: Catalase, Chymotrypsin, Lipase, Trypsin… • Nguoàn TV: amylase, ficin… • Nguoàn VK: Asparaginase, Protease … • Nguoàn naám sôïi: Lactase, Lipase,… • Nguoàn naám men: Invertase, Lactase,… • -2-
Seminar Heä enzym pectinase II. PECTIN II.1. Giôùi thieäu:[1+2+8] _Pectin laø cô chaát cuûa enzyme pectinase. Pectin laø polysaccharide dò theå. Veà baûn chaát hoaù hoïc, pectin laø polygalacturonic ñöôïc phaân boá roäng raõi trong caùc moâ thöïc vaät, hoaø tan trong dòch thöïc vaät. Coù nhieàu trong caùc loaïi quaû, cuû, ñaëc bieät laø trong cuøi traéng cuûa böôûi, cam, chanh. _Pectin laø hôïp chaát cao phaân töû maïch thaúng, maïch chính cuûa phaân töû do caùc acid galacturonic keát hôïp vôùi nhau baèng lieân keát α-1,4-glucosid taïo neân. _Pectin khaùc vôùi caùc carbonhydrate thoâng thöôøng vì thaønh phaàn chuû yeáu cuûa noù khoâng phaûi laø ñöôøng ñôn maø laø moät acid coù teân laø acid galacturonic. _Pectin goàm moät maïch chính coù thay ñoåi nhöng coù tyû leä lôùn caùc ñôn vò acid D-galacturonic ñaõ ñöôïc methyl hoaù vaø ñöôïc goïi laø acid pectic (acid polygalacturonic). Hình 1: Maïch pectin Hình 2: Hai phaân töû D-galcturonic acid noái vôùi nhau baèng lieân keát glucoside -3-
Seminar Heä enzym pectinase II.2. Phaân loaïi:[1] _ Pectin laø teân goïi chung bao goàm: protopectin, acid pectic, acid pectinic, pectin hoaø tan. Trong quaù trình tìm hieåu thì thaáy coù nhieàu caùch phaân loaïi: Caùch 1: _Pectin coù nhieàu ôû phaàn voû cuûa quaû, cuû hay thaân caây, trong thöïc vaät pectin toàn taïi 2 daïng: • Daïng protopectin: khoâng tan trong nöôùc, toàn taïi chuû yeáu ôû thaønh teá baøo, thöôøng ôû daïng lieân keát vôùi polysaccharide khaùc nhö araban, tinh boät, cellulose… Protopectin taïo cho quaû xanh, coù ñoä cöùng nhaát ñònh. Khoâng theå taùch protopectin ôû traïng thaùi chöa bieán ñoåi. Ngöôøi ta cho raèng protopectin laø hôïp chaát giöõa pectin vôùi araban, galactan, hay tinh boät. Protopectin laø thaønh phaàn quan troïng cuûa chaát gian baøo, laøm nhieäm vuï lieân keát giöõa caùc teá baøo thöïc vaät vôùi nhau. Trong thaønh phaàn protopectin coù caùc phaân töû pectin, phaân töû cellulosase, caùc ion Ca2+, Mg2+, caùc goác acid photphoric, acid acetic vaø ñöôøng. Döôùi taùc duïng cuûa acid, bazô, t0 hoaëc enzyme protopectinase thì protopectin giaûi phoùng ra pectin hoaø tan. • Daïng pectin hoaø tan: chuû yeáu ôû dòch teá baøo. Laø este methylic cuûa acid polygalacturonic cao phaân töû. Khoaûng 2/3 nhoùm cacboxyl cuûa acid polygalacturonic ñöôïc este hoaù baèng methanol. A. pectinic: laø acid polygalacturonic cao phaân töû trong ñoù 1 phaàn nhoû nhoùm cacboxyl ñöôïc este hoaù baèng methanol. A.pectic: laø acid polygalacturonic cao phaân töû ñaõ phaân töû ñaõ hoaøn toaøn giaûi phoùng khoûi nhoùm metoxyl, nghóa laø trong 1 ñôn vò acid galacturonic coù 1 nhoùm cacboxyl töï do. Hình 3: Galacturonic acid -4-
Seminar Heä enzym pectinase Hình 4: acid pectic Hình 5: Acid pectic vôùi caàu muoái Mg vaø Ca Hình 6: a) Galacturonic acid b) Pectic acid -5-
Seminar Heä enzym pectinase Caùch 2: chia laø 3 loaïi _ High metyl este pectin (HM pectin): tyû leä caùc goác este metilic cao (>50%). _Low metyl este petin (LM pectin): tyû leä caùc goác este metilic thaáp hôn (
Seminar Heä enzym pectinase _Pectin tan trong nöôùc, nhaát laø nöôùc noùng, ñöôïc tuûa nhôø röôïu vaø nhöõng chaát tan höõu cô khaùc. _Khi taêng möùc ñoä este hoaù baèng methanol hay giaûm khoái löôïng thì ñoä hoaø tan ôû trong nöôùc taêng leân. Khi ñoù ñoä nhôùt cuûa dung dòch pectin seõ taêng leân. _Moät tính chaát cuõng raát hay cuûa pectin laø acid pectic khi keát hôïp vôùi ion Ca2+ seõ taïo thaønh Canxipectat keát tuûa. Tính chaát naøy ñöôïc öùng duïng ñeå ñònh löôïng pectin. _Pectin deã daøng bò keát tuûa, hay bò ñoâng ñaëc bôûi etanol, isopropanol, acetone, sunfatamon, clorua nhoâm, muoái Cu, muoái Ca… _Tính chaát ñaëc bieät cuûa pectin laø dung dòch pectin bò laøm ñoâng ñaëc bôûi 1 loaïi men ñaëc bieät laø pectat, pectase coù trong dòch cuûa carot. Pectin döôùi taùc duïng cuûa pectase seõ bieán thaønh acid pectic. Acid pectic tan trong kieàm, caùc muoái tan, rieâng pectat Canxi khoâng tan. Enzym pectinase coù trong luùa maïch laïi coù taùc duïng ngöôïc laïi vôùi pectat nghóa laø neáu coù pectinase thì pectat khoâng laøm pectin ñoâng ñaëc nöõa, pectinase coøn coù theå hoaø tan keát tuûa cuûa acid do pectat gaây neân, vaø hieän töôïng naøy keøm theo söï giaûi phoùng caùc ñöôøng khöû oxy. _Tuyø theo thôøi gian vaø nhieät ñoä pectin ñöôïc taùch hoaøn toaøn hay 1 phaàn khoûi cellulose hay hemicellulose maø ta coù tính chaát khaùc nhau. Muoán loaïi pectin khoûi hemicellulose ta taùc duïng leân nguyeân lieäu dung dòch oxalate ammonium vaø dung dòch naøy chæ hoaø tan ñöôïc pectin maø thoâi. _Pectin giöõa vai troø quan troïng trong quaù trình chín cuûa quaû khi quaû coøn xanh vaø ñang phaùt trieån. Protopectin phaân taùn ôû thaønh teá baøo, vaø coù tyû leä khaù cao coù taùc duïng laøm quaû cöùng, khi quaû baét ñaàu chín thì protopectin chuyeån sang daïng pectin hoaø tan döôùi taùc duïng cuûa acid höõu cô vaø enzyme protopectinase coù trong quaû. Quaû caøng chín caøng meàm, pectin hoaø tan taêng cao, vaø ngöôïc laïi protopectin khoâng tan seõ giaûm daàn. _Ñoä beàn vöõng cuûa pectin tröôùc caùc enzyme seõ ñöôïc taêng leân khi coù maët cation, ñaëc bieät laø Al3+ vaø Fe3+. Taêng nhieät ñoä leân 1000C pectin bò phaân taùch, neáu coù theâm ion Cl- thì quaù trình ñoù tieán haønh nhanh hôn. III.PECTINASE: •III.1.Giôùi thieäu: •_1840 E.Fremi phaùt hieän ra enzym pectase trong nöôùc eùp caø roát. •_ Sau ñoù G. Bertrand vaø A. Mallevre tìm thaáy trong nöôùc eùp caø chua •_Enzym pectinase do E. Poourquelot vaø H. Herisseu phaùt hieän trong ñaïi maïch naûy maàm vaøo khoaûng naêm 1898. • -7-
Seminar Heä enzym pectinase III.2. Khaùi nieäm: _Enzym pectinase laø enzyme xuùc taùc söï phaân huyû caùc polyme pectin. Saûn phaåm taïo thaønh: acid galacturonic, galactose, arabinose, metanol… Laø nhoùm enzyme ñöôïc öùng duïng roäng raõi sau protease vaø amylase. _Enzym pectinase coù ôû thöïc vaät baäc cao vaø caùc saûn phaåm cuûa VSV. ÔÛ thöïc vaät baäc cao: coù nhieàu trong laù, khoai taây, chanh, coû cheû ba, trong caùc loaïi quûa thöôøng coù enzyme pectinesterase. _Trong töï nhieân coù nhieàu ôû naám moác, vi khuaån phaân giaûi pectin. _Söï phaân huyû pectin trong töï nhieân thöôøng xaûy ra khi traùi caây chín . Vì vaäy enzyme pectinase coù vai troø heát söùc quan troïng trong quùa trình baûo quaûn traùi caây vaø rau quûa. Vieäc kieåm soaùt enzyme naøy trong caø chua chuyeån gen laø 1 ví duï ñieån hình trong vieäc öùng duïng RNA chuyeån gen ñoái maõ ñeå thao taùc söï bieåu hieän gen. Enzyme pectinase ñöôïc öùng duïng nhieàu trong quùa trình cheá bieán thöïc phaåm, ñaëc bieät laø khaû naêng laøm trong nöôùc hoa quûa. (Vieäc kieåm soaùt hoaït ñoäng cuûa enzym pectinase cuõng coù theå ñieàu chænh baèng ñoä nhôùt cuûa saûn phaåm) III.3. Trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym pectinase: E.pectinase chöùa vuøng coù 8-10 voøng xoaén β keùp veà phía phaûi vôùi hai voøng taïo thaønh khe lieân keát vôùi cô chaát • Trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym naøy chöùa a.a Aspartate vaø Lysine.Coù 1 Histidine naèm gaàn trung taâm hoaït ñoäng seõ aûnh höôûng ñeán khaû naêng xuùc taùc cuûa enzym. Nhi t ñ t i ưu c a enzym pectinase kho ng t 45-55oC III.4.Phaân loaïi: D a vaøo tính ñ c hi u, cơ ch taùc d ng, ki u ph n ng, pH t i ưu c a enzym, 1966 Koller vaø Neukom phâaân lo i chia pectinase thaønh hai nhoùm chính: Hydrolase vaø transeliminase . - Nhoùm th nh t: Hydrolase (xuùc taùc cho quaù trình th y phaân) g m • Pectinesterase (PE) coù teân h th ng laø pectin-petihydrolase (E.C.3.1.1.11) -8-
Seminar Heä enzym pectinase Hình 7: Pectinesterase • Polygalaturonase (PG) coù teân h th ng laø poly – 1,4 galaturonit- glucanohydrolase, maõ soá (E.C.3.2.1.15). Döïa vaøo tính ñaëc hieäu vaø cô cheá taùc duïng leân cô chaát, H.Deuel vaø E.Stulz (1958) ñaõ chia polygalacturonase thaønh 2 nhoùm nhoû. Moãi nhoùm coù 2 kieåu : Polymethylgalacturonase (PMG): coù teân heä thoáng laø poly α-1,4- • galactunonic-methylsteglucanohydrolase(E.C.3.2.1.11). PMG tacù duïng leân acid polymethyulgalacturonic ñaõ ñöôïc methyl hoaù (töùc laø pectin). PMG ñöôïc phaân thaønh 2 kieåu: * Kieåu 1: endo glucosidase-polymethylgalacturonase (vieát taét laø endo- PMG-I) * Kieåu 3: enxo glucosidase-polymethylgalacturonase (vieát taét laø endo- PMG-III) Polygalacturonase (PG) taùc duïng leân acid pectic hoaëc pectinic, goàm 2 • kieåu: * Kieåu 2: endo glucosidase-polygalacturonase (vieát taét laø endo-PG-II) * Kieåu 4: enxo glucosidase-polygalacturonase (vieát taét laø enxo-PG-IV) - Nhoùm thöù hai: Transeliminase (T.E), goàm: Pectin-transeliminase (PTE): coù teân heä thoáng laø poly- -1,4-galcturonic- • methylesteglucanoliase (E.C.4.2.99.8). Caùc enzyme naøy laïi ñöôïc chia laøm 2 loaïi: * Endo-pectintraseliminase kieåu I (vieát taét laø endo-PTE-I) * Exo-pectintraseliminase kieåu III (vieát taét laø endo-PTE-II) -9-
Seminar Heä enzym pectinase Polygalacturonate-transeliminase (PGTE): Coù teân heä thoáng laø poly- - • 1,4-D-galacturonic-glucanoliase (E.C.4.2.99.3). PGTE naøy ñöôïc chia laøm 2 loaïi: * Endo-polygalacturonate-transeliminase kieåu II (Endo-PGTE-II) * Endo-polygalacturonate-transeliminase kieåu IV (Endo-PGTE-IV) Hình 8: Polygalacturonase IV.CÔ CHEÁ TAÙC DUÏNG CUÛA ENZYM PECTINASE: IV.1. Enzym pectinesterase (E.C.3.1.1.11) (PE): _Enzym naøy xuùc taùc s th y phaân lieân k t ester ph c t p c a pectin vaø protopectin, s n ph m t o thaønh laø rư u methylic vaø acid pectinic hay acid polygalacturonic. Ngư i ta nh n th y r ng PE ch phaân caùch lieân k t ester gi a caùc nhoùm metoxyl vaø COOH t do. PE coù aùi l c v i nhoùm metoxyl v trí th 5 l n v i caùc nhoùm v trí th 3 vaø 7. Như v y söï phaân caùch nhoùm metoxyl s x y ra m t caùch tu n t baét ñ u t nhoùm COOH t do. K t quaû laø t o thaønh acid pectic ho c acid pectinic vaø rư u methanol. _Nghieân c u cơ ch taùc d ng pectinesterase, ngư i ta th y r ng metoxyl b xaø phoøng hoaù, sau ñoù th y phaân ti p lieân k t ester ti n haønh d c theo phaân t pectin. _Pectinesterese taùch g c methyl kh i phaân t pectin laøm l ra caùc nhoùm carboxyl r t ho t ñ ng, d k t h p v i caùc ion kim lo i (ví d Ca2+) ñ t o thaønh caùc mu i khoâng hoaø tan, k t l ng l i vaø coù th taùch ra d daøng. - 10 -
Seminar Heä enzym pectinase Hình 9 : Caùc PE ôû thöïc vaät taán coâng vaøo hoaëc ñaàu khoâng khöû hoaëc gaàn vôùi nhoùm carboxyl töï do vaø tieán doïc theo phaân töû baèng cô cheá chuoãi ñôn, taïo ra caùc khoái galacturonic acid khoâng bò ester hoaù raát maãn caûm vôùi calcium. Caùc caáu truùc khaùc nhau cuûa chuoãi galacturonan, chaúng haïn nhö caùc monomer acetyl hoaù, caùc nhoùm ester bò chuyeån ñoåi thaønh amide hay bò khöû ñeán röôïu baäc moät, hay söï toàn taïi cuûa caùc vuøng coù nhieàu maïch nhaùnh, öùc cheá hoaït ñoäng cuûa PE. Hình 10: Vò trí taùc duïng cuûa enzyme pectinesterase PE coù tính ñaëc hieäu cao ñoái vôùi nhoùm methylester cuûa polygalacturonic acid. Caùc ester khaùc chæ bò taán coâng raát chaäm, coøn caùc nhoùm methylester cuûa - 11 -
Seminar Heä enzym pectinase polymanuronic acid thì khoâng heà bò taán coâng. Toác ñoä ñeà ester hoaù treân maïch pectin phuï thuoäc vaøo ñoä daøi cuûa maïch; trimethyl trigalacturonate khoâng bò taán coâng. Caùc PE cuûa naám khaùc vôùi PE cuûa thöïc vaät theo cô cheá ña maïch, caùc nhoùm methoxyl bò laáy ñi moät caùch ngaãu nhieân. Caùc PE thu ñư c t caùc ngu n nguyeân li u khaùc nhau coù pH t i ưu khaùc nhau. Ví d : PE vi sinh v t coù pH t i ưu t 4,5 – 5,5; t th c v t coù pH t i ưu t 5,0 – 8,0 PE c a n m m c coù nhi t ñ t i ưu t 30- 50oC vaø b voâ ho t 55 – 62oC. PE thư ng ñư c ho t hoaù b i caùc ion Ca2+ vaø Mg2+. IV.2.Enzym Polygalacturonase (E.C.3.2.1.15) (PG): _Tham gia quaù trình thu phaân lieân k t -1,4–glucosid c a acid pectic vaø caùc polygalacturonic khaùc, taùch g c acid D – galacturonic thaønh caùc phaân t D – galacturonic t do. PG ít g p trong caây, PG chuû ch y u vi sinh v t. _PG laø m t ph c h enzym g m nhi u c u töø vaø thư ng coù tính ñ c hi u cao ñ i v i cơ ch t. _Haàu heát caùc nghieân cöùu veà PG ñeàu treân cô sôû caùc nguoàn VSV. PG thöôøng ñöôïc tìm thaáy trong caùc phaàn tieát ngoaïi baøo cuûa caùc loaøi naám vaø vi khuaån gaây beänh, chaúng haïn nhö Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, caùc loaøi Ascomycete, Phizopus arrchizus, vaø Fusarium osyporum. Tuy nhieân, trong thöïc teá, PG cuûa thöïc vaät baäc cao ñöôïc nghieân cöùu raát nhieàu ôû caø chua chín. _Caùc enzyme trong caø chua chín: Caùc enzyme PG trong caø chua chín toàn taïi döôùi hai daïng, vaø caû hai ñeàu laø endo-enzyme. PG1 coù khoái löôïng phaân töû 84kD vaø coù khoaûng 50% bò baát hoaït ôû nhieät ñoä 78oC. PG2 coù khoái löôïng phaân töû 44kD vaø coù khoaûng 50% bò baát hoaït ôû 57oC. PG1 coù ñoä oån ñònh toái ña ôû pH 4,3, traùi laïi PG2 oån ñònh toái ña ôû pH 5,6. Söï phaân tích söû duïng SDS- PAGE cho raèng PG1 laø moät dimer cuûa PG2, tuy nhieân caùc nghieân cöùu khaùc laïi cho raèng PG1 hình thaønh laø do söï keát hôïp cuûa PG2 vôùi moät β–subunit. Caùc chuoãi polypeptide cuûa PG ñeàu bò glycosyl hoaù. PG2 chöùa 4,6 ñöôøng trung tính (Dmannose, L-gucose, D-xylose) lieân keát vôùi nhau thoâng qua caàu noái Nacetylglucosaminylasparaginyl. _Coù söï khaùc nhau chuùt ít veà khoái löôïng phaân töû, chaúng haïn caùc isoenzyme cuûa PG2, PG2A va PG2B coù khoái löôïng phaân töû töông öùng laø 43 vaø 46kD. Söï khaùc nhau naøy coù theå laø do quaù trình söûa sai hoaëc quaù trình glycosyl hoaù sau dòch maõ. Trong thöïc teá, caùc nghieân cöùu sau ñoù cuõng ñaõ chöùng minh ñöôïc - 12 -
Seminar Heä enzym pectinase raèng PG2A vaø PG2B laø caùc daïng glycosyl hoaù khaùc nhau cuûa cuøng caùc polypeptide. _Trình töï amino acid: Caùc trình töï amino acid ñöôïc suy luaän treân cô sôû caùc nucleotic cuûa cDNA phaân laäp khoâng nhöõng töø traùi caø chua maø coøn töø phaán cuûa caùc loaøi Pseudomonas solanacearum, Oenothera organesis, phaán hoa baép, vaø töø traùi bô. Gen cuûa PG2 phaân laäp töø traùi caø chua maõ hoaù cho protein hoaøn chænh coù 373 amino acid, vôùi khoái löôïng phaân töû laø 40 279. Enzyme naøy ñöôïc toång hôïp töø moät tieàn chaát, sau ñoù ñi qua quaù trình söûa chöûa sau dòch maõ, goàm caû caùc quaù trình loaïi boû caùc peptide tín hieäu, bò glycosyl hoaù taïi boán ñieåm coù khaû naêng glycosyl, vaø söûa chöõa ôû ñaàu C cuoái. Caùc gen PG ñôn maõ hoaù cho caùc loaïi isoenzyme khaùc nhau, daãn ñeán keát luaän raèng PG1 vaø PG2 ñeàu xuaát phaùt töø cuøng moät chuoãi polypeptide, vaø raèng PG1 ñöôïc taïo thaønh nhôø söï keát hôïp cuûa PG2 vôùi β-subunit. β-subunit. Söï chuyeån ñoåi PG2 vaø PG1 trong quaù trình chín cuûa caø chua laø moät vaán ñeà gaây ñöôïc nhieàu chuù yù. β-subunit, moät yeáu toá beàn nhieät, ñaàu tieân ñöôïc phaân laäp töø caø chua xanh, coù khaû naêng chuyeån ñoåi PG2 thaønh PG1 trong oáng nghieäm. Yeáu toá naøy sau ñoù ñöôïc xaùc minh laø moät glycoprotein raát ñaëc tröng vôùi polypeptide PG veà maët mieãn dòch. Phaân töû PG1 ñöôïc taïo thaønh töø moät phaân töû PG2 vaø moät phaân töû β-subunit; tuy nhieân, chæ coù polypeptide PG coù hoaït tính enzyme. cDNA maõ hoaù cho β–subunit coù trong caø chua laø moät tieàn chaát coù kích thöôùc phaân töû lôùn (69kD, 630 amino acid). Trong phaân töû naøy, theâm vaøo phaân töû protein hoaøn chænh laø moät trình töï tín hieäu kò nöôùc (30 amino acid), moat polypeptide chöùa ñaàu cuoái N-(78 amino acid), vaø moät tieàn peptide chöùa ñaàu cuoái C-(233 amino acid). Protein hoaøn chænh chöùa glycosyl hoaù laø chöùa 289 amino acid naëng 31,5 kD, ñieåm ñaúng ñieän 4,9. Protein naøy chöùa löôïng lôùn amino acid gly, tyr, phe, vaø moät motif laëp coù caáu truùc lieân öùng FTNYGxxGNGGxxx, trong ñoù “x” phaàn lôùn laø caùc amino acid phaân cöïc. Chöùc naêng cuûa motif naøy trong protein vaãn chöa ñöôïc bieát roõ. Vai troø cuûa PG trong quaù trình laøm chín traùi caây: Hoaït ñoä cuûa enzyme trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình laøm chín chuû yeáu laø nhôø PG1. PG1 tieáp tuïc taêng trong quaù trình chín, vaø coù maët trong taát caû caùc giai ñoaïn cuûa quaù trình chín. PG2 coù khoái löôïng phaân töû thaáp hôn vaø ít beàn nhieät, PG2 xuaát hieän trong giai ñoaïn cuoái cuûa quaù trình, vaø chieám löôïng lôùn trong giai ñoaïn chín. Söï xuaát hieän keá tieáp nhau cuûa hai enzyme naøy laø keát quaû cuûa hoaït ñoäng ñieàu hoaø cuûa β–subunit, yeáu toá naøy ñöôïc tìm thaáy vôùi löôïng ít trong caø chua xanh, sau ñoù taêng leân trong giai ñoaïn chín. PG2 ñöôïc coi nhö moät endo-enzyme trong caø chua chín, PG1 ñöôïc hình - 13 -
Seminar Heä enzym pectinase thaønh trong suoát quaù trình chín khi β–subunit ñöôïc sinh ra ñeå phaûn öùng vôùi PG2. Baèng caùch ñieàu chænh nhöõng thay ñoåi trong caùc phaân töû PG trong caùc dòch chieát khaùc nhau coù caùc noàng ñoä khaùc nhau cuûa NaCl vaø pH ñeäm khaùc nhau. Treân thöïc teá gen maõ hoaù cho polypeptide PG trong moät soá nghieân cöùu tröôùc ñaây ñaõ chöùng minh ñieàu naøy. Gaàn ñaây, caùc nghieân cöùu veà caùc kieåu bieåu hieän gen cuûa β–subunit vaø caùc phaân töû PG cho thaáy mRNA cuûa β–subunit xuaát hieän sôùm trong quaù trình phaùt trieån cuûa traùi caây(10 ngaøy sau khi thuï phaán) vaø taêng ñeán möùc toái ña trong 30 ngaøy, cuõng laø luùc traùi caây chín. Sau ñoù, löôïng mRNA cuûa β-subunit giaûm nhanh choùng, trong khi löôïng mRNA cuûa PG taêng moät caùch ñaùng keå. Vì taát caû caùc keát quaû nghieân cöùu ñaït ñöôïc ôû treân, ta coù theå cho raèng endo-enzyme PG2 ñöôïc hình thaønh trong caùc giai ñoaïn sôùm cuûa quaù trình chínphaûi ñöôïc chuyeån veà PG1 do söï coù maët cuûa β–subunit. Söï tích luõy cuûa PG2 trong caùc giai ñoaïn sau cuûa quaù trình chín laø do β–subunit bò caïn kieät. Vai troø cuûa quaù trình chuyeån ñoåi naøy laø nhaèm ñieàu hoaø hoaït ñoäng cuûa PG trong caùc giai ñoaïn cuûa quaù trình chín. β–subunit phaûn öùng vaø neo phaân töû PG2 vaøo thaønh teá baøo, taïo ra phaân töû PG1 döôùi daïng hoaït ñoäng ñeå phaân huûy pectin. Moät soá nghieân cöùu khaùc cuõng chöùng minh ñöôïc raèng PG1, chöù khoâng phaûi PG2 coù chöùc naêng trong vieäc laøm phaân huyû vaø oån ñònh polyuronide, coù nghóa laø söï phaân huûy cuûa polyuronide döôùi taùc ñoäng cuûa enzyme PG laø nguyeân nhaân daãn ñeán quaù trình meàm cuûa caø chua.Tuy nhieân, khi nghieân cöùu veà söï xen ñoaïn vaø bieåu hieän cuûa gen PG trong caø chua chuyeån gen thì keát quaû cho thaáy polyuronide bò phaân huûy nhöng khoâng laøm cho traùi caø chua meàm ñi. _Cô cheá vaø kieåu taùc duïng: Exo-PG thuûy phaân caùc ñaàu khoâng khöû cuûa chuoãi polygalacturonic, taïo ra galacturonic acid laø saûn phaåm thuûy phaân chieám öu theá(H.6.8). Söï thuûy phaân polymer naøy bò giaùn ñoaïn cuûa söï toàn taïi cuûa caùc maïch nhaùnh trong cô chaát. Möùc ñoä thuyû phaân taêng tæ leä vôùi kích thöôùc cô chaát, ñaït toái ña vôùi möùc polymer hoaù 20 ñoái vôùi caùc exo-PG ôû caø roát vaø ñaøo. Hoaït ñoäng cuûa caùc exo- enzyme laøm taêng nhanh söï taïo thaønh caùc nhoùm khöû vaø laøm taêng chaäm ñoä nhôùt cuûa dung dòch cô chaát. Söï phaân huûy polyuronide trong quaù trình chín khoâng gaây ra söï tích luõy galacturonic acid, vaø chæ coù endo-enzyme PG laø coù lieân quan. Caùc endo-PG phaân huûy pectic acid töø beân trong maïch, laøm giaûm nhanh ñoä nhôùt cuûa dung dòch cô chaát. Tính ñaëc hieäu vaø kieåu taùc duïng cuûa endoenzyme - 14 -
Seminar Heä enzym pectinase ñöôïc xaùc ñònh bôûi traïng thaùi cuûa ñieåm hoaït ñoäng. Möùc ñoä thuûy phaân cuûa endo-PG ôû naám men giaûm cuøng vôùi söï giaûm ñoä daøi maïch cô chaát. Vò trí lieân keát cuûa endo-PG ôû Aspergillus niger ñöôïc caáu thaønh töø 4 ñieåm vaø söï phaân caét xaûy ra giöõa caùc ñieåm 1 vaø 2(H.6.9). Moät cô chaát tetramer chòu söï phaân caét(3+1) thaønh trigalacturonic acid galacturonic. Moät cô chaát pentamer cho ra hai saûn phaåm phöùc taïp hôn, caû hai ñeàu ñaùp öùng söï chieám giöõ hoaøn toaøn cuûa 4 ñieåm lieân keát, taïo söï phaân caét (4+1) vaø (3+2). Cuõng töông töï, ñoái vôùi cô chaát laø hexagalacturonic acid, saûn phaåm seõ taïo thaønh loái phaân caét (5+1), (4+2) vaø (3+3). Trigalacturonic acid baùm vaøo ñieåm hoaït ñoäng ñeå taïo thaønh caùc phöùc hôïp höõu ích hoaëc khoâng höõu ích. Lieân keát höõu ích trong tröôøng hôïp naøy laøm sinh ra söï phaân caét (2+1). Lieân keát khoâng höõu ích ñöôïc taïo thaønh khi ba ñôn vò ñôn leõ baùm vaøo ba ñieåm 2, 3 vaø 4, laø khoâng heà töông taùc vôùi caùc nhoùm xuùc taùc ñònh vò beân trong ñieåm 1 vaø 2. Cô chaát trong tröôøng hôïp naøy ñoùng vai troø laø moät chaát öùc cheá caïnh tranh (K = 0,67mM). Hinh11: Söû duïng PG nghieân cöùu ôû caây caø chua Naêm 1958, H.Deuel vaø E.Stutz ñaõ chia ra 4 kieåu polygalacturonic döïa vaøo tính ñaëc hieäu vaø cô cheá taùc duïng: IV.2.1.polymethylgalacturonic(PMG): laø enzyme taùc d ng treân acid polygalactyronic ñaõ ñöôïc metoxyl hoaù (t c laø pectin). Enzyme naøy coù teân h th ng laø poly – – 1,4 – galacturonic – methylesterglucanohydrolase (E.C.3.2.1.41), l i ñ oc chia thaønh 2 nhoùm nh . - 15 -
Seminar Heä enzym pectinase Endo – glucosidase – polymethylgalacturonase ki u 1 (Endo PMG I):Laø enzyme d ch hoaù, pectin coù m c ñ metoxyl hoaù caøng cao thì b thu phaân b i enzyme naøy caøng nhanh vaø caøng coù hi u qu cao. Trong dung d ch, khi coù m t enzyme pectinesterase thì ho t ñ c a enzym naøy thư ng b gi m. Enzym naøy ph bi n n m m c như: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Botrytis cinerea, Neurospora crassa Hình 12: Exo – glucosidase – polymethylesterase ki u III(Exo-PMG-III): Laø enzyme ñư ng hoaù, enzyme naøy coù th c t t ng acid galacturonic ra kh i acid pectinic hay pectin. Exo- PMG III coù aùi l c v i caùc g c acid galacturonic ñaõ ñöôïc metoxyl hoaù nghĩa laø phaân c t liêeân k t -1,4 glucosid ñ u m ch n m gi a hai g c acid galacturonic coù nhoùm COOCH3 Hình 13: - 16 -
Seminar Heä enzym pectinase IV.2.2. Polygalacturonase ( PG ): Laø enzyme taùc d ng treân acid pectic ho c pectinic. PG l i ñ c chia thaønh 2 nhoùm nh . Endo – glucosidase – polygalacturonase ki u II( Endo – PG II): Laø enzyme dòch hoaù, enzyme naøy coù theå thuyû phaân acid pectinic hay acid pectic vaø ch taùc d ng khi coù m t nhoùm COOH t do. Ho t ñ c a Endo–PG II s tăng leân nhi u khi cơ ch t ñư c x lyù sơ b b ng Pectinesterase. a s vi khu n vaø n m m c laø nh ng vi sinh v t t ng h p ñư c enzyme naøy. Hình 14: Exo – glucosidase – polygalacturonase ki u IV (Exo-PG-IV): Enzyme naøy thư ng coù aùi l c m nh ñ i v i caùc lieâên k t glucosid cu i m ch c a phâaân t acid pectinic hay acid pectic nhưng beân c nh ñoù khoâng coù nhoùm methyl. Coù leõ ñeå t o neâên ñư c ph c enzyme-cơ ch t thì trong phaân t cơ ch t ph i coù nhoùm Carboxyl t do k li n liêeân k t b ñ t. Hình 15: - 17 -
Seminar Heä enzym pectinase IV.3.Enzyme Pectate lyase: Naêm 1960, P.Abersheim laàn ñaàu tieân ñöa ra thoâng baùo veà phaân huûy phaân töû pectin khoâng baèng con ñöôøng thuûy phaân. Enzym tham gia vaøo quaù trình ñoù goïi laø pectate lyase. Enzym naøy xuùc taùc phaù vôõ moái lieân keát - 1,4 – glucosid, tieán tôùi laøm maát hoaït tính nguyeân töû hydro ôû nguyeân töû carbon thöù 5, taïo thaønh moái lieân keát ñoâi giöõa nguyeân töû thöù 4 vaø thöù 5. Döïa treân cô cheá taùc duïng cuûa pectate lyase, ngöôøi ta chia noù ra thaønh hai nhoùm: - Nhoùm undo-pectatelyase: Tham gia thuûy phaân phaân töû polygalacturonic ôû choã khaùc nhau cuûa daõy taïo neân acid galacturonic. - Nhoùm exo-pectatelyase: Tham gia phaân huûy thaønh phaàn maïch voøng cuûa acid digalacturonic Pectate lyase (PEL) laø caùc enzyme VSV ngoaïi baøo. Caùc enzyme cuûa gioáng Erwina vaø Bacillus ñöôïc bieát ñeán laø taùc nhaân gaây ra trieäu chöùng soft- rod ôû thöïc vaät. Tuy nhieân, chuùng cuõng ñöôïc tìm thaáy phoå bieán ôû Aeromonas, Pseudomonas, Xanthomonas, Aspergillus vaø Fusarium. Erwinia chrysanthemi sinh ra caùc enzyme pectate lyase ôû daïng isoenzyme coù theå ñöôïc phaân thaønh caùc nhoùm treân cô sôû ñieåm ñaúng ñieän cuûa chuùng: acid (pH 4-5), trung hoaø (pH 7-8,5) vaø kieàm (pH 9-10). Soá löôïng caùc isoenzyme trong moãi nhoùm coù theå thay ñoåi tuøy theo loaøi. Ña soá caùc loaøi ñöôïc nghieân cöùu cho naêm hay ít nhaát boán isoenzyme: moät acid (PELA), hai trung hoaø (PELA vaø C), hai kieàm (PELD vaø E). Taát caû caùc isoenzyme naøy ñeàu caàn Ca++ ñeå laøm taêng ñoä hoaït ñoäng vaø coù pH toái öu 8-10. Caùc nghieân cöùu treân chuûng EC16 cho thaáy raèng taát caû 4 isoenzyme treân ñeàu laø endo-enzyme (PEL A(pI 4,2), PEL A (pI 8,8), PEL C (pI 9,0), vaø PEL D (pI 10,0)). Caùc PEL kieàm raát ñaëc hieäu trong vieäc gaây ra söï giaàm nöôùc cuûa caùc moâ thöïc vaät, tieápntheo laø caùc isoenzyme trung hoaø, traùi laïi caùc PEL acid khoâng gaây aûnh höôûng gì. ÔÛ caùc chuûng Erwinia carotovara, coù ít nhaát ba PEL ñöôïc tieát ra, taát caû ñeàu coù ñieåm ñaúng ñieän ôû pH kieàm: PEL I (pI 9,7), PEL II (pI 10,2), vaø PEL III (pI 10,35). Caû ba isoenzyme naøy ñeàu coù pH toái öu laø 9,0. Nhieät ñoä toái öu cho hoaït ñoäng cuûa PEL II vaø PEL III laø 50 vaø 60oC, theo thöù töï. PEL I coù ñoä bean nhieät thaáp. ÔÛ chuûng GIR726, coù boán loaïi endo-PEL isoenzyme vôùi caùc ñieåm ñaúng ñieän ôû caùc pH raát kieàm (10,0, 10,6, 10,3 vaø 10,9) vaø khoái löôïng phaân töû naèm trong khoaûng töø 28-33 kD. pH toái öu cho hoaït ñoäng laø 9,3 cho PEL II 9,5 cho PEL IV vaø 9,7 cho PEL I vaø III. Cuõng nhö vôùi caùc PEL töø caùc nguoàn khaùc, nhöõng isoenzyme naøy ñöôïc kích hoaït bôûi Ca++. Hoaït ñoä - 18 -
Seminar Heä enzym pectinase enzyme taêng 50-70% khi coù maët cuûa Ca++ noàng ñoä 0,5mM. Isoenzyme vôùi pI>10 chöùa 2,5-4.8% ñöôøng trung tính. Caùc PEL töø moät soá loaøi Bacillus cuõng coù khaû naêng gaây ra söï giaûm nöôùc ôû moâ thöïc vaät. Hình 16 IV.4. YÙ nghóa veà maët kyõ thuaät cuûa caùc endo-enzyme 1) Pectinesterase: Ethanol coù maët trong phaàn chöng caát ñöôïc töø thòt quaû leân men laø do pectin methylester bò phaân caét bôûi endo-enzyme PE. Trong suoát quaù trình leân men, ethanol ñöôïc sinh ra vaø caùc ñôn vò saûn xuaát caàn phaûi thanh truøng thòt quaû tröôùc khi leân men ñeå noàng ñoä ethanol coù maët trong saûn phaåm khoâng vöôït quaù giôùi haïn cho pheùp. Söï coù maët cuûa PE trong traùi caây hoï citrus laønguyeân nhaân gaây ra caùc vaán ñeà caàn ñöôïc giaûi quyeát trong coâng nghieäp thöïc phaåm, töùc laø söï maát ñi cuûa caùc veát vaãn ñuïc trong dòch eùp. Neáu PE khoâng bò öùc cheá tröïc tieáp sau khi taùch chieát dòch quaû baèng caùch baát hoaït bôûi nhieät hay laøm ñoâng, caùc phaân töû pectin seõ bò ñeà ester hoaù vaø seõ bò ñoâng tuï bôûi söï coù maët cuûa caùc ion Ca++ trong dòch eùp. Ñeå ngaên ñieàu naøy, nöôùc eùp ñöôïc taùch thaønh phaàn caën vaø phaàn trong. Neáu nöôùc eùp quaù ñaëc, gel pectate seõ ñöôïc hình thaønh vaø do ñoù nöôùc eùp seõ khoâng ñöôïc hoaøn nguyeân laïi nöõa. Nhöõng vaán ñeà naøy laøm giaûm chaát löôïng saûn phaåm moät caùch nghieâm troïng. Caùc chaát taïo höông cuûa traùi caây hoï citrus cöïc kyø maãn caûm vôùi nhieät, vì theá caùc phöông phaùp saûn xuaát saûn phaåm traùi caây ñoâng laïnh ñang raát caàn thieát. Phöùc hôïp cuûa ion Ca++ coù theå ngaên ngöøa söï bieán maát cuûa caùc ñaùm maây vaãn ñuïc do hoaït ñoäng cuûa PE, nhöng laïi laøm phaùt sinh caùc vaán ñeà mang tính chaát phaùp lyù. Polyphenol coù theå öùc cheá hoaït ñoäng cuûa PE nhöng lai gaây aûnh höôûng ñeán vaán ñeà caûm quan, chaúng haïn veà vò trí vaø tính ñoàng nhaát cuûa saûn phaåm. PE ñoàng thôøi laø moät chaát öùc cheá saûn phaåm cuoái, nhöng neáu theâm pectic acid vaøo laïi laøm nöôùc eùp bò phaân lôùp, theá laø laïi taïo ra moät vaán ñeà khoâng mong muoán khaùc. Tuy nhieân, vieäc thuûy phaân pectic acid, ñeán möùc polymer hoaù 8-10, coù aûnh höôûng öùc cheá cuûa caùc cheá phaåm polymer cao phaân töû nhöng laïi khoâng ñoâng tuï vôùi Ca++. Vieäc theâm caùc cheá phaåm nhö theá seõ - 19 -
Seminar Heä enzym pectinase khoâng ngaên ngöøa ñöôïc nhöng seõ trì hoaõn ñöôïc quaù trình töï phaân lôùp, coù leõ ñuû laâu ñeå phaân phoái nhanh caùc loaïi nöôùc eùp traùi caây töôi ñöôïc laøm tan giaù. Moät khaû naêng khaùc laø vieäc theâm caùc exo-enzyme (H.17): PG laøm phaân huûy pectin coù möùc ester thaáp hình thaønh tröôùc khi söï ñoâng tuï vôùi Ca++ xaûy ra, hay PL phaân huûy caùc pectin trong nöôùc eùp traùi caây ñeán caùc saûn phaåm coù khoái löôïng phaân töû thaáp hôn, laø caùc hôïp chaát khoâng maãn caûm vôùi Ca++, duø laø ñeà ester hoaù vaø thöïc teá cuõng coù theå hieän chöùc naêng öùc cheá PE. Hoaït ñoäng phaân huûy pectin bôûi enzyme nhö theá ñaõ ñöôïc öùng duïng trong vieäc aøm giaûm ñoä nhôùt trong nöôùc traùi caây, vì theá laøm taêng noàng ñoä cuûa caùc thaønh phaàn chaát chieát ñeán caùc giaù trò Brix cao hôn nhö bình thöôøng coù theå. Cuõng caàn haûi löu yù vieäc söû duïng caùc giai ñoaïn bay hôi nhieàu laàn nhaèm toái öu hoaù quaù trình xöû lyù nhieät vaø khoâi phuïc höông vò saûn phaåm, keát hôïp vôùi vieäc baûo quaûn trong ñieàu kieän ñoâng laïnh vaø vaän chuyeån saûn phaåm nöôùc eùp coâ ñaëc giuùp traùnh ñöôïc phaàn lôùn PE bò baát hoaït do taùc ñoäng cuûa nhieät ñoä.Tuy nhieân, ñoái vôùi caùc nöôùc ñang phaùt trieån, vaãn ñang toàn taïi vaán ñeà naøy trong coâng nghieäp saûn xuaát nöôùc eùp traùi caây hoï citrus vaø caùc loaïi nöôùc eùp vaån ñuïc khaùc coù hoaït löïc PE cao vaø caùc chaát taïo höông raát maãn caûm vôùi nhieät, chaúng haïn nhö oåi vaø xoaøi. PL Pectin hoøa tan → Caùc ester oligogalactorunic acid ↓ PE PG Pectin coù haøm löôïng metholxyl thaáp → Caùc oligogalacturonic acid tan ↓ M++ Caùc pectate khoâng tan Hình 17: Ngaên ngöøa söï ñoâng tuï cuûa ñoâng tuï cuûa Ca++ vôùi pectin bò ñeà ester hoùa bôûi PE trong serum cam Caùc PE ñöôïc phaân laäp töø cam coù hình thöùc khaùc nhau vaø coù aùi löïc khaùc hau ñoái vôùi pectin vaø pectate. Maët khaùc, chuùng cuõng khaùc nhau veà ñoä beàn hieät, vaø cuõng deã hieåu raèng chuùng ñoùng vai troø khaùc nhau trong hieän töôïng aøm trong dòch quaû eùp. Moät loaïi ñöôïc phaân bieät bôûi khoái löôïng phaân töû cuûa noù raát cao, chæ chieám khoaûng 5% hoaït tính toaøn phaàn vaø mang moät soá ñaëc ñieåm noåi baät. Loaïi naøy beàn nhieät vaø vì theá ñoùng vai troø chính yeáu trong vieäc laøm trong - 20 -