ĐỀ TÀI " SƯU TẦM VÀ THIẾT LẬP HỆ THỐNG LƯU TRỮ CÁC LOÀI VI KHUẨN PHÂN LẬP TRÊN TÔM CÁ TẠI KHOA THỦY SẢN - ĐẠI HỌC CẦN THƠ "

Chia sẻ: Nguyen Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:39

Thêm vào BST

Báo xấu

93
lượt xem 19
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong những năm gần đây, việc thâm canh hoá nghề nuôi thuỷ sản đã có những đóng góp tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập của cộng đồng và tăng kim ngạch xuất khẩu. Rất nhiều loài tôm cá nuôi có giá trị kinh tế đã được đưa vào nuôi với nhiều hình thức khác nhau như: Nuôi quảng canh, bán thâm canh và thâm canh. Để đáp ứng nhu cầu giống tôm cá nuôi, các cơ sở sản sản xuất giống đại trà và kém chất lượng, khả năng đề kháng với bệnh tật yếu, từ đó bệnh phát sinh với tỷ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: ĐỀ TÀI " SƯU TẦM VÀ THIẾT LẬP HỆ THỐNG LƯU TRỮ CÁC LOÀI VI KHUẨN PHÂN LẬP TRÊN TÔM CÁ TẠI KHOA THỦY SẢN - ĐẠI HỌC CẦN THƠ "

BỘ GIÁO D ỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại h ọc C ần Thơ BÁO CÁO KHOA HỌC Đề tài cấ p Trường SƯU TẦM VÀ THI ẾT LẬP HỆ THỐNG LƯU TRỮ CÁC LOÀI VI KHUẨN PHÂN LẬP TRÊN TÔM CÁ TẠI KHOA TH ỦY S ẢN - ĐẠI H ỌC CẦN TH Ơ Mã s ố: T2004-16 Cần Thơ 1 2/2005 i
BỘ GIÁO D ỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại h ọc C ần Thơ BÁO CÁO KHOA HỌC Đề tài cấ p Trường SƯU TẦM VÀ THI ẾT LẬP HỆ THỐNG LƯU TRỮ CÁC LOÀI VI KHUẨN PHÂN LẬP TRÊN TÔM CÁ TẠI KHOA TH ỦY S ẢN - ĐẠI H ỌC CẦN TH Ơ Mã s ố: T2004-16 Chủ n hi ệm đề tài K.s Nguy ễn Th ị Thu Hằng Cán bộ tham gia Th.s Đặng Th ị Hoàng Oanh PGs. Ts Nguy ễn Thanh Ph ương Cầ n Thơ 1 2/2005 ii
M ỤC LỤC I. Đặt v ấn đ ề................................................................................................................... 1 II. Lược kh ảo tài liệu...................................................................................................... 2 III. Ph ương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 9 3.1 Vật liệu .................................................................................................................. 9 3.2 Hóa ch ất và môi trường nuôi cấy....................................................................... 9 3.3 Ph ương pháp nghiên cứu .................................................................................... 10 3.4 Ph ương pháp lưu trữ v à phụ c hồ i vi khu ẩn ...................................................... 12 3.5 Ph ương pháp xử lí s ố liệu ................................................................................... 12 IV. Kết qu ả & th ảo lu ận................................................................................................... 13 4.1 Sưu tầm các ch ủ ng vi khu ẩn gây b ệnh trên đ ộng v ật th ủy sản....................... 13 4.2 Đặc đ iểm sinh lí sinh hóa củ a các chủ ng vi khu ẩn s ưu tập............................. 14 4.3 Hệ th ố ng lưu trữ M icrobankTM tại khoa thủ sản............................................... 21 V. Kết lu ận & đ ề xu ất ...................................................................................................... 22 Tài liệu tham kh ảo ........................................................................................................... 24 Ph ụ lụ c iii
Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1 .1 Giới thiệu Trong nh ững n ăm g ần đ ây, việc thâm canh hoá ngh ề n uôi thu ỷ s ản đ ã có nh ững đ óng góp tích cực vào việc nâng cao nguồ n thu nh ập của cộ ng đ ồng và tăng kim ng ạch xu ất khẩu. Rất nhiều loài tôm cá nuôi có giá trị kinh tế đ ã đ ược đ ưa vào nuôi v ới nhiều hình th ức khác nhau nh ư: Nuôi quảng canh, bán thâm canh và thâm canh. Để đ áp ứng nhu cầu giống tôm cá nuôi, các cơ s ở sản s ản xu ất giố ng đ ại trà và kém ch ất lượng, kh ả năng đ ề kháng v ới bệnh tật y ếu, từ đ ó b ệnh phát sinh với tỷ lệ cao trên diện tích rộng (Báo Con Tôm s ố 77, 2002). Ngh ề n uôi thủ y s ản cũ ng đ ang ph ải đ ương đ ầu với tình trạng d ịch b ệnh bùng nổ n gày càng th ường xuyên và nghiêm trọ ng do s ự s uy thoái v ề môi trường và s ự lây lan mầ m b ệnh. Theo Từ Thanh Dung (2002) thì vi khu ẩn gây b ệnh ở độ ng v ật th ủy s ản đ ã đ ược phân lập vài trăm loài thu ộ c 9 họ , đ iển hình là nhóm vi khu ẩn Aeromonas sp, Pseudomonas sp g ây b ệnh ở n ước ngọ t và nhóm Vibrio sp g ây bệnh ở n ước mặn. Vi khu ẩn có ở mặt cả n ước ng ọt và n ước mặn v ới nhiều chủ ng loài khác nhau và gây thiệt h ại nghiêm trọ ng cho ngh ề nuôi trồ ng th ủy sản nói chung và tôm cá nói riêng. Hiện tại, nhu cầu v ề mẫu vi khu ẩn gây b ệnh dùng cho việc kh ảo nghiệm thuố c, nghiên cứu các đ ặc đ iểm sinh hoá h ọc cũng nh ư miễn d ịch h ọ c trên độ ng v ật th ủy s ản là rất cần thiết. Các nghiên cứu này có ý ngh ĩa rất quan trọng trong việc phát triển các kỹ thu ật ch ẩn đ oán và phòng trị b ệnh ở thu ỷ s ản. Tuy nhiên, nh ững thông tin v ề tác nhân gây b ệnh trong nuôi thuỷ s ản ở vùng Đồ ng Bằng Sông Cửu Long còn rất hạn ch ế v à nguồ n mẫu vi sinh v ật gây b ệnh phân lập từ các đ ợt d ịch bệnh b ộ c phát còn rất hiếm hoi, phân tán, ch ưa đ ược lưu trữ v à nghiên cứu mộ t cách hệ th ống. Do v ậy, chúng tôi th ực hiện đề tài “Phân lậ p, s ưu tầ m và thiết lậ p hệ th ống lưu trữ các loài vi khuẩ n gây bệnh trên tôm cá t ại Khoa Thủ y S ản - Đ ại học Cần Thơ” nh ằm mụ c tiêu: Lưu trữ h ệ th ống các giống loài vi khu ẩn gây b ệnh trên độ ng v ật thuỷ sản để p hụ c vụ cho việc giảng d ạy và các nghiên cứu sâu h ơn. 1.2 Nội dung củ a đề tài 1. Sưu tầm các chủ ng vi khu ẩn trên cá và tôm ở v ùng Đồ ng Bằng Sông Cửu Long từ các đ ề tài nghiên cứu b ệnh thuỷ s ản trước đ ây tại Đại h ọ c Cần th ơ. 2. Định danh b ằng ph ương pháp sinh hoá truyền thố ng đ ến mức loài các ch ủng vi khu ẩn s ưu tầm đ ược trên cơ s ở phân tích cụ m b ằng phần mềm Statistica v ới các chủ ng vi khu ẩn chu ẩn. 3. Thiết lập h ệ thố ng lưu trữ các loài vi khu ẩn gây b ệnh trên tôm cá b ằng hệ th ống Microbank™ tại Khoa Thủ y s ản, Đại h ọ c Cần th ơ 1
Phầ n II: LƯỢC KH ẢO TÀI LIỆU Bệnh vi khu ẩn có mặt từ rất lâu đ ời trong nghề nuôi trồ ng thủ y s ản, s ự phát hiện s ớm nhất là b ệnh vi khu ẩn trên cá chình vào n ăm 1971. Bệnh vi khuẩn gây thiệt h ại lớn, ước đ oán kho ảng 10% thiệt h ại củ a ngh ề cá là do bệnh trong đ ó 50% là từ b ệnh vi khu ẩn Từ h ơn ch ục n ăm nay, nh ững trở n g ại do bệnh đ ã gây thiệt h ại rất lớn v ề tài chính trong ngh ề nuôi tôm biển, tôm sú luôn b ị b ệnh và ch ết là chuyện đã từng xảy ra ở n hiều đ ịa ph ương, nhất là các tỉnh Nam Bộ - n ơi tập trung kho ảng 80% diện tích tôm nuôi của cả n ước. Th ậm chí vào giữa năm 1994 b ệnh tôm xảy ra rộng kh ắp các tỉnh phía Nam đ ã gây thiệt hại lớn về kinh tế v à ảnh h ưởng sâu rộ ng v ề xã hộ i ở n h ững n ơi có bệnh gây thiệt h ại trên d ưới 250 tỷ đ ồ ng (Phan Lương Tâm, 1994 trích d ẫn từ Hảo, 2000). Báo cáo kết qu ả Nuôi Trồ ng Thu ỷ Sản n ăm 2003 củ a ngành đ ã đ ưa ra vài con s ố : cả n ước có 546.757 ha nuôi tôm n ước lợ th ương ph ẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi b ị b ệnh và ch ết là 30.083 ha. Các tỉnh thành ven biển từ Đà Nẵng đ ến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm b ị ch ết, chiếm 97,06 % diện tích có tôm b ị ch ết trong cả n ước (Tạp chí Thu ỷ Sản, 2004). Nh ững trở n gại do b ệnh gây ra ít nh ất từ 20 n ăm qua, đ a số th ừa nh ận rằng b ệnh ở độ ng v ật thu ỷ s ản xảy ra th ường là do s ự tương tác giữa v ật chủ có tính mẫn cảm trong đ iều kiện môi trường xấu cùng v ới sinh v ật gây b ệnh sẵn có trong môi trường (Nguy ễn Anh Tu ấn và ctv, 2002). Trong đó hiện nay b ệnh truy ền nhiễm do nhóm virut và vi khuẩn đ ược xem là tác nhân gây bệnh đ áng đ ược quan tâm. Bệnh do vi khu ẩn gây ra th ường th ấy nh ư bệnh Vibrio , bệnh đ ố m nâu, đố m đ en, b ệnh ho ại tử, b ệnh phát sáng…b ệnh do các nhóm Speudomonas sp, Aeromonas sp, Flavobacterium… đ ặc biệt là nhóm Vibrio n h ư V. parahaemolyticus, V. valginolyticus v à mộ t s ố loài thuộ c giố ng Vibrio . Nhiễm b ệnh ở tất cả các loài tôm biển, tôm càng xanh và cua ở g iai đ o ạn ấu trùng, tôm b ộ t, giố ng và trưởng thành. Ph ổ b iến ở các vùng n ước lợ. Tôm nhiễm b ệnh th ường mất ph ương h ướng, các bộ p h ận nh ư v ỏ , ph ụ b ộ chân, râu và mang b ị n hiễm khu ẩn có màu đ en hay đỏ n âu, v ỏ b ị ăn mòn, cơ có màu trắng đ ụ c. Ấu trùng b ị n hiễm b ệnh th ường có màu đ en trên đ ỉnh các phụ b ộ , tôm b ỏ ăn ru ộ t rỗ ng. Tôm s ẽ ch ết d ần, đ ôi khi ch ết 100%. Trong đ ó b ệnh phát sáng là mộ t trong nh ững b ệnh gây thiệt h ại nghiêm trọ ng cho ngh ề nuôi tôm trong và ngoài n ước. Bệnh này theo Bùi Quang Tề v à Vũ th ị Tám (2000) là do vi khu ẩn Vibrio parahaemolyticus. Ngoài ra còn g ặp mộ t số v i khu ẩn khác nh ưng tần số ít h ơn: V.alginolyticus; V. harveyi, Pseudomonas sp ... Tôm bỏ ăn, lắng đ áy và ch ết hàng lo ạt. Tỷ lệ ch ết rất cao từ 80-100%. Bệnh phát sáng th ường xu ất hiện ở g ian đ oạn ấu trùng và giai đ o ạn giố ng củ a các loài tôm sú, tôm th ẻ, tôm càng xanh. Trong sản xu ất giố ng mầm b ệnh đ ược lây truy ền chủ y ếu từ ru ộ t giữa củ a tôm mẹ cho ấu trùng trong quá trình sinh s ản và gây 2
b ệnh ch ủ y ếu ở g iai đ o ạn tôm ương trong trại nh ư trứng, ấu trùng tôm bộ t (Oanh et al, 2001). Ngoài ra, ch ất thải từ h ệ thố ng tiêu hoá, trứng củ a tôm mẹ đ ược nghi ng ờ là ngu ồn ch ứa vi khu ẩn phát sáng (Shariff và Suhasinghe,1992 trích d ẫn b ởi Hảo, 2000). M ộ t s ố loài vi khu ẩn phát sáng n ếu chúng hiện diện v ới 1 s ố lượng lớn có thể làm tôm b ị n hiễm b ệnh phát sáng xanh nh ạt trong bóng tố i. Dạng nhiễm khu ẩn này th ường th ấy ở cá trại giố ng, nh ưng cũ ng đang ph ổ b iến ở các ao nuôi và đ ược g ọ i là “h ộ i ch ứng vi khu ẩn phát sáng” (Tu ấn và ctv, 2002). Cơ h ay máu tôm s ắp ch ết có rất nhiều vi khu ẩn hình que di đ ộ ng. Gan tụ y là n ơi b ị h ại n ặng nh ất làm mất ch ức n ăng tiêu hoá và gây ch ết (Oanh và ctv, 2001). Để ch ẩn đoán b ệnh, phân lập và nuôi cấy vi khu ẩn Vibrio trên môi trường TCBS. Sau 24 giờ khuẩn lạc phát sáng trong bóng tố i, đ a s ố thuộ c nhóm gram âm, ch ỉ p hát triển ở môi trường có nồ ng đ ộ mu ố i 2-7‰ (Bùi Quang Tề- Vũ Th ị Tám, 2000). Trước đ ây nhóm Vibrio đ ược xem là vi khu ẩn cơ hộ i. Tuy nhiên gần đ ây nghiên cứu qua nhiều ổ d ịch xảy ra trên tôm sú nuôi do vi khuẩn gây ra cho th ấy loài này d ường nh ư đ ược xem là v i khu ẩn gây b ệnh tiên phát th ật s ự ch ứ không phải là vi khu ẩn cơ h ộ i (Lightner, 1998, trích d ẫn b ởi Hảo, 2000). Do đ ó đ ể b iết rõ tác nhân gây ra các b ệnh này thì có nhiều tác giả đ ã tiến hành phân lập trên các đ ố i tượng nuôi nh ư: Tôm càng xanh, tôm sú… Ở tôm càng xanh, từ n h ững n ăm đ ầu củ a s ự p hát triển ngh ề nuôi tôm, ch ỉ xu ất hiện mộ t vài b ệnh, nh ưng nh ững n ăm g ần đ ây đ ã phát hiện trên 30 lo ại b ệnh khác nhau quan trọng là vi khu ẩn trên các công đo ạn s ản xu ất giố ng, ương ấu trùng đ ến ấu niên và nuôi th ịt (Lê Hồ Th ị M inh Trang, 2001). Nh ư b ệnh đố m nâu ở tôm càng xanh hiện đ ang có nhiều ý kiến khác nhau v ề tác nhân gây bệnh. Nh ưng qua nghiên cứu củ a Bùi Quang Tề v à Vũ Th ị Tám (2000) cho th ấy gây b ệnh ho ại tử ở tôm càng xanh là do nhóm vi khu ẩn Aeromonas hydrophila và Pseudomonas sp . Đồ ng th ời khi các y ếu tố n go ại cảnh: gây s ốc cho tôm, môi trường n ước nhiễm b ẩn, nuôi mật đ ộ d ầy, quản lý ch ăm sóc kém... đ ã tạo đ iều kiện cho b ệnh phát triển nhanh và gây cho tôm ch ết. Tôm càng xanh b ị b ệnh đố m nâu th ường kém ăn, trên thân xu ất hiện nh ững đ ố m nâu chuy ển đần sang đ en. Nh ững đố m b ệnh trên thân, mang hình dạng không nh ất đ ịnh. Các phần phụ : râu, chân bò, chân b ơi, đuôi cụ t d ần có màu nâu đ en. Đố m b ệnh n ằm ở phía trong các lớp v ỏ kitin và lớp biểu mô ngoài củ a tôm. Vì th ế khi lộ t xác các v ết b ệnh vẫn không mất đ i. Bệnh n ặng tôm g ầy y ếu, ít ho ạt độ ng, th ường nằm ở đ áy ao. Bệnh đ ố m nâu th ường xu ất hiện ở các ao ương nuôi từ tôm càng xanh giống đ ến trưởng thành. Ở các giai đ o ạn ấu trùng tỷ lệ cảm nhiễm th ường xuyên từ 30-70%. Ở g ian đ o ạn tôm th ịt tỷ lệ cảm nhiễm th ường xuyên từ 5-10%. Nếu b ệnh nặng tỷ lệ cảm nhiễm 60-90% làm tô m ch ết rải rác, n ăng suất tôm giảm 30%, ch ất lượng tôm th ương phẩm giả m đ i rõ rệt. Bệnh xu ất hiện quanh n ăm. Đồ ng th ời b ệnh ăn mòn v ỏ kitin cũ ng th ường xu ất hiện trên tôm càng xang là do nhóm vi khu ẩn Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas v à Proteus...Ở Vibrio th ường gặp mộ t số loài: V . parahaemolyticus, V. alginlyticus, V. anguillarum... Theo Phatarpekar (2002) vi khu ẩn gây b ệnh trên Tôm Càng Xanh đ a số là vi khu ẩn gram âm, bao g ồ m h ơn 75% tổ ng số n h ư: Aeromonas, Alealgenes và Pseudomonas. 3
Lưu Minh Bé (2002) đ iều tra b ệnh tôm càng xanh trong h ệ th ống nuôi ao và tôm lúa tỉnh An Giang, b ước đ ầu đ ịnh danh đ ược 4 lo ại vi khu ẩn: Edwardsiella tarda, Yersinia ruckeri, Providencia rettgeri và Pseudomonas fluorescen. Còn Nguy ễn Tấn Đạt (2002) kh ảo sát b ệnh ký sinh trùng và vi khu ẩn trên tôm càng xanh nuôi trong ao và ruộ ng lúa mật đ ộ th ấp cũng đ ã phân lập đ ược các ch ủng vi khu ẩn sau : Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria, Aeromonas carviea và Aeromonas sp từ tôm càng xanh b ị cụ t râu, mòn phụ bộ . Ngoài nh ững vi khu ẩn gây b ệnh trên tôm càng xanh thì tôm sú qua kết qu ả nghiên cứu ban đầu của trung tâm nghiên cứu Thu ỷ Sản III và Trường đ ại h ọ c Thuỷ Sản từ ấu trùng tôm sú nhiễm b ệnh phát sáng đ ã phân lập đ ược các loài vi khuẩn sau đây: Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus. Trong các loài vi khu ẩn trên đ ã cảm nhiểm nhân tạo cho tôm thành công v ới V. parahaemolyticus. Ấ u trùng tôm kho ẻ s au khi cảm nhiễm đ ã có d ấu hiệu b ệnh lý của b ệnh phát sáng (Hà Ký và ctv, 1992). Số liệu kh ảo sát b ệnh tôm - mộ t s ố h iểu biết cần thiết và biện pháp phòng ng ừa (1996) trong tất cả các ao nuôi v ới mô hình bán thâm canh xảy ra tôm ch ết nh ư Vĩnh Châu (Sóc Trăng), Bình Đại (Bến Tre), Long Toàn (Duyên Hải, Trà Vinh), An Biên ( Kiên Giang)....đều xác đ ịnh có chủ ng vi khu ẩn gây b ệnh nh ư Vibrio anguillarum, vibrio alginolyticus…Trong h ầu h ết các mẩu nuôi tôm có kiểu biểu hiện bệnh lí ở mức đ ộ n hiều ho ặc ít và ngay cả các mẩu không có biểu hiện bệnh lí khi phân lập đ ều phát hiện các nhóm V. anguillarum, V. p arahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus n hóm g ặp ở tầng s ố th ấp h ơn là Pseudomonas sp, Aeromonas sp v à Aerobacter sp. Môi trường n ước ao nuôi tôm ở các tỉnh ven biển phía Nam qua kh ảo sát đ ã b ị nhiểm b ẩn ở n hiều g ốc đ ộ khác nhau, n ền đ áy ao và ngay cả trong ngu ồn n ước mộ t s ố khu v ực đồ ng b ằng Sông Cửu Long có tổng số Vibrio sp khá cao. Các nhóm khu ẩn gây b ệnh nh ư V. anguillarum, V. paralymolyticus. Các mẫu ấu trùng tôm sú thu tại Bà Rịa, Vũ ng Tàu, Cà Mau cũ ng đ ã phân lập đ ược các loài vi khu ẩn gây b ệnh đ ều thuộ c các nhóm Vibrio , nh ư V. alginolyticus, V. harveyi, V. parahaemolytilus…Đây là nh ững loài vi khu ẩn cảm nhiễm ph ổ b iến ở các loài tôm nuôi thuộ c h ọ Penaecidae tại châu Á và nhiều vùng khác trên th ế g iới (Tạp chí thuỷ s ản, 2004). Trong 171 trại giố ng ở Khánh Hoà, kết qu ả phân lập đ ược 36 ch ủng vi khu ẩn. Dựa vào ph ương pháp truy ền th ống kết h ợp v ới test API 20E đ ã đ ịnh danh các ch ủng vi khu ẩn , V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, V sp . Qua 15 mẫu ấu trùng b ị b ệnh phát sáng đ ược thu trực tiếp từ các trại giố ng đã phân lập đ ược 30 ch ủ ng vi khu ẩn g ồ m: V. harveyi, V. alginolyticus, V. vulnificus, V. damsela, V. parahaemolyticus. Qua kết qu ả đ iều tra cho thấy bệnh đ ỏ mang và đỏ thân ở tôm sú bố mẹ là mộ t b ệnh khá ph ổ b iến trong các trại giố ng ở Khánh Hòa, có tới 90,05% s ố trại đ ược ph ỏng v ấn đ ã trả lời có g ặp b ệnh này trong trại củ a mình. Ông cũ ng cho rằng vi khu ẩn Vibrio là tác nhân th ường g ặp và nguy hiểm nó có mặt trong nhiều h ộ i ch ứng b ệnh khác nhau ở tôm b ố mẹ v à tôm ấu trùng. Lo ại vi khu ẩn này luôn có mặt trong b ể n uôi tôm b ố mẹ và b ể ấp ấu trùng, ở n gu ồn n ước biển ven 4
b ờ v à trong củ a chính b ố mẹ con tôm. M ật độ v i khuẩn này nhiều hay ít ph ụ thu ộc vào th ời tiết, khi h ậu, ph ụ thuộ c vào kh ả n ăng qu ản lý ch ất lượng b ể ấp củ a ng ười nuôi. Trong b ể ấp số lượng vi khu ẩn này tăng theo thời gian ương ấp trong mộ t chu kỳ v à có trường h ợp tăng rất nhanh khi vi khu ẩn này đ ạt trên 1000 tế b ào ml thì s ức kho ẻ ấu trùng có th ể b ị ảnh h ưởng (Nguyễn Văn Hảo, 2002). Từ kết qu ả cảm nhiễ m củ a Đỗ Th ị Hoà (1996) cho th ấy V. parahaemolyticus là mộ t trong các tác nhân gây b ệnh phát sáng cho tôm sú ấu trùng tôm sú ở miền Trung Việt Nam. Còn V. alginolyticus là mộ t trong nh ững tác nhân có th ể g ây ra bệnh đỏ d ọ c thân của ấu trùng tôm sú. Khi so sánh kết quả nghiên cứu này v ới các kết quả n ghiên cứu khác nh ư ở Philippine, Thái Lan và mộ t s ố n ước khác cho th ấy V. harveyi v à Spendidus là 2 chủ ng vi khuẩn đ ược thông báo phân lập từ tôm b ị b ệnh phát sáng, các tác giả cho rằng V. h arveyi là vi khu ẩn th ường g ặp, gây tác h ại lớn cho tôm ấu trùng trong b ể ấp. Tuy nhiên có mộ t số tác giả lại cho rằng tôm sú ấu trùng có th ể b ị phát sáng khi nhiễm mộ t số loài vibrio nh ư: V. parahaemotyticus,V. h arveyi v à V. vulnificus… Ngoài ra bệnh do vi khuẩn đ ã gây thiệt h ại cho các ao nuôi tôm công nghiệp các n ước Châu Á nh ư Trung Quố c, Đài Loan, Ấ n Độ , Indonesia...và cũng làm ảnh h ưởng đ ến s ản lượng tôm nuôi ở các khu v ực này. Nhóm vi khu ẩn gây bệnh phổ b iến đ ược phân lập tại Thái Lan là V. a lginolyticus, V.parahamolyticus, V. harveyi...Indonesia: V.harveyi. Phillippine: Vibrio spp, V. splendicus, V. harveyi (Lavilla –Pitogo C.R, 1995). Ở Philippin nuôi tôm sú công nghiệp b ắt đ ầu từ thập niên 80. Hiện tại nhiều trại nuôi theo ph ương pháp này b ị tổn th ất do bệnh truy ền nhiễm từ tháng nuôi th ứ 1-2. Hai nhóm vi khu ẩn gây b ệnh nghiêm trọ ng trong các giai đ oạn nuôi khác nhau của tôm là v i khu ẩn d ạng s ợi Leucothirix và nh ất là loài vibrio.Trong 97 khu ẩn lạc từ tôm giố ng và n ước th ử n ghiệm đ ã phân lập có 93 V. harveyi và 4 V. splendidus. Theo báo cáo củ a Anderson và ctv (1988) vi khu ẩn là nguyên nhân giảm 70 – 90% thu ho ạch 3 trại nuôi ở M alaysia (C.R Lavilla– Pitogo, 1995). Còn ở Ấ n Độ mộ t trong nh ững loài tôm thu ộ c h ọ tôm he đ ược nuôi phổ b iến nh ất là tôm sú. Việc gia tăng nghề nuôi và chiến lược quản lý không phù h ợp là nguyên nhân khiến cho tôm b ị b ệnh, d ẫn đ ến phá s ản nhiều trại nuôi ở ấn Ðộ . Bệnh tôm đ ã trở thành rào cản chính đ ố i v ới s ự phát triển và mở rộ ng nuôi tôm cả về mặt số lượng, ch ất lượng, tính cân đ ố i và tính liên tục. Vì v ậy v ấn đ ề b ệnh ảnh h ưởng đ ến tôm nuôi ở Ấ n Độ , trong trại giố ng tỷ lệ ch ết b ởi vi khu ẩn truy ền nhiễm là ph ổ b iến (có kho ảng 175 trại giố ng v ới 10 tỷ con giống ở Ấn Độ 1996). Cả 2 b ệnh do vi khu ẩn và virut là v ấn đ ề quan trọ ng trong trại tôm ở Ấn Độ . Tuy nhiên nghiên cứu cho th ấy vi khu ẩn là v ấn đ ề chính trong trại giố ng, loài vi khu ẩn gây ch ết là V. harveyi, V. alginolyticus v à V. campbellii mặc dù tôm nuôi ở các n ước Châu Á th ường mắc b ệnh đ ố m trắng (Thông Tin Khoa Họ c Công Ngh ệ và KT Thuỷ Sản, 2003). Tôm công nghiệp ở Nh ật đã phát triển trong nh ững th ập niên 80 không có vấn đề q uan trọ ng v ề b ệnh. Nh ưng s ản xu ất tôm ở Nh ật 3.020 tấn giảm còn 1.519 tấn trong 5
n ăm 1994, nguyên nhân chính b ởi vì vi khu ẩn V. penaeicida v ới h ơn 60% tổ ng số th ất thu (Riichi Kusuda và Kenji Kawai, 1998). Ở Trung Qu ố c bệnh do vi khu ẩn V. a lginolyticus, V. parahamolyticus g ây ra đ ã đ ược phát hiện lần đ ầu tiên vào n ăm 1983, d ịch b ệnh trở nên lan tràn vào nh ững n ăm 1992 –1993 gây tỷ lệ ch ết 80% và s ản lượng tôm giảm kho ảng 70% (Đỗ Hồ ng Tu ấn, 1995). Theo Aduardom Leano (1994) nhiều loài cá và giáp xác b ị n hiể m b ệnh b ởi vi khu ẩn Vibrio v à Aeromonas v à th ường xuyên nh ất là ở môi trường n ước mặn và ng ọt. Tổ ng 116 v i khu ẩn phân lập trừ tôm và cá trong n ước nuôi 44 mẩu từ n ước và 72 mẩu từ cá và tôm. Đa s ố p hân lập từ tôm ( 92,2%) ở ao và trại. Trong 116 vi khu ẩn phân lập, xác đ ịnh 109 Vibrio spp 45 vi khu ẩn phát sáng và 7 Aeromonas spp . Ngoài nh ững thiệt h ại do bệnh vi khu ẩn gây ra trên tôm thì cá cũ ng nh ư các độ ng v ật khác th ường mắt mộ t s ố b ệnh, làm ch ết cá rất nhiều. Đặc biệt là b ệnh d ịch cá, kh ả n ăng lây lan rất nhanh làm ch ết hàng lo ạt cá do các loài vi sinh v ật trong s ố đó vi khu ẩn cũ ng là mộ t nhân tố g ây ảnh h ưởng nghiêm trọ ng cho ngh ề nuôi (Từ Thanh Dung, 2002). Theo tài liệu củ a G. Post vi khu ẩn gây bệnh trên cá đ ược phát hiện đ ầu tiên vào 1894. Vi khu ẩn ở độ ng v ật thủ y s ản đ ã phân lập đ ược vài trăm loài gây b ệnh thu ộc 9 h ọ , vi khu ẩn đ iển hình là nhóm vi khu ẩn Aeromonas sp, Pseudomonas sp g ây b ệnh ở n ước ng ọt (Bùi Quang Tề, Ph ạm Th ị Yên, 2002). Trong vài n ăm qua b ệnh đ ố m đ ỏ ở cá n ước ngọ t và n ước lợ là b ệnh lưu hành rộ ng rãi và gây nhiều thiệt h ại, b ệnh đ ã trở thành mộ t mố i đ e d ọ a lớn cho ng ười nuôi cá ở b ệnh khu v ực Châu Á–Thái Bình Dương. Bệnh đố m đ ỏ ở cá n ước ngọ t ảnh h ưởng nghiêm trọ ng đ ến s ản xu ất cá ở miền Nam châu Á. Nó là nguyên nhân gây tỷ lệ ch ết cao ở cả 2 loài cá nuôi và cá tự nhiên mỗ i n ăm. Bệnh đ ã đ ược phát hiện ở A ustralia n ăm 1972, Indonesia 1980, Malaisia 1981-1983, Thái Lan 1981-1985, Lào 1984- 1985... Sự b ùng nổ củ a b ệnh đ ố m đ ỏ trên cá n ước ng ọt gây tác đ ộng đ ến s ản lượng cá củ a các n ước này. Theo th ống kê của mộ t số công trình nuôi cá ở Trung Quố c, mộ t s ố cá bệnh hao h ụt 20-40% (Từ Thanh Dung, 2002). Còn ở Bangladesh trong mộ t vài n ăm trở lạ i đ ây b ệnh b ắt đ ầu đ e do ạ n ghiêm trọ ng s ản xu ất cá. Mặt dù tác đ ộ ng củ a b ệnh này giảm, tuy nhiên nó v ẫn đ e do ạ n hiều trại cá trong n ước. Trong 150 cu ộ c đ iều tra ở ao nuôi và 40 trại cá kh ắp Bangladesh có 50 – 60% b ệnh đố m đ ỏ , 40 – 70% ch ấm đ ỏ trên da và các v ết th ương khác 20 –30%, vây và đ uôi b ị th ố i rửa 10 – 20% (Chowdhury, 1998). Ở Việt Nam b ệnh đ ược phát hiện lần đầu vào n ăm 1962 ở Ninh Bình, cá b ệnh là cá chép, mè, trắm cỏ . Năm 1973-1976 b ệnh d ịch xảy ra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long gây thiệt h ại nhiều đ ố i với cá trê, sau 3-4 n ăm v ẫn ch ưa khôi phụ c đ ược sản lượng. Năm 1981 d ịch b ệnh xảy ra ở Ngh ệ Tĩnh, n ăm 1982, ở Đà Nẵng vào n ăm 1983 – 1984 ở Đồ ng Bằng Nam Bộ . Các loài cá: trắ m cỏ , chép, mè, cá quả, cá trê, cá tra... b ị b ệnh không nh ững ở v ùng n ước tự nhiên mà cả trong các bè ao nuôi cá. Bệnh phát triển thành d ịch gây ch ết cá, làm giả m n ăng suất cá th ịt nuôi trong các bè đ ến 6
20-30%. Ở miền Bắc từ tháng 11/1987-4/1988 trên sông Đà, trong số 100 lồ ng nuôi cá trắm cỏ , b ệnh xu ất hiện, lan tràn gây tổ n th ất lớn cho gần 80 lồ ng cá. Vào th ời gian đ ó cá tự n hiên trên sông cũ ng b ị nhiễm b ệnh. Trong các ao nuôi v ỗ cá b ố mẹ ở Hải Hưng 1070-1971, Hoàng Liên Sơn 1982-1983, Hà Bắc 1988-1989... hàng tấn cá trắm cỏ bố mẹ đ ã nhiễm b ệnh ảnh h ưởng lớn đ ến s ản xu ất cá giống, s ức sinh s ản củ a cá b ố mẹ b ị b ệnh giảm 30-40%. Cu ố i n ăm 1990-1991 b ệnh lại xu ất hiện ở Ba Vĩ (ngã ba Sông Hồ ng) gây nhiều thiệt h ại cho các hộ g ia đ ình nuôi cá (Hà Ký và ctv, 1992). Năm 1986-1995, b ệnh xu ất huy ết đ ố m đ ỏ xu ất hiện ch ủ y ếu ở cá trắm cỏ n uôi lồ ng. Năm 1994-1998, b ệnh xu ất hiện h ầu h ết các ao nuôi cá trắm cỏ b ố mẹ v à cá th ịt. Năm 1999-2001, các h ệ thố ng nuôi cá trắm cỏ b ệnh liên tụ c xảy ra gây thiệt hại rất lớn cho ngh ề n uôi cá n ước ngọ t. Bệnh nhiễm trùng do nhóm vi khu ẩn Aeromonas spp d i đ ộng th ường g ặp nhiều loài đ ộng v ật thủ y s ản. Bộ môn b ệnh độ ng vật th ủy s ản viện nghiên cứu Nuôi Trồ ng Th ủy Sản I đ ã phân lập vi khu ẩn gây b ệnh chủ y ếu là Aeromonas hydrophyla 57,5%, A. caviae 25,0%, Pseudomonas fluorescens 17,5% (Bùi Quang Tề, 2002). Theo Bùi Quang Tề (1986–1988) đ ã nghiên cứu b ệnh cá nuôi ở h ình th ức nuôi lồ ng bè thấy cá nuôi lồ ng bè th ường xu ất hiện mộ t s ố bệnh truyền nhiễm: b ệnh xu ất huyết đ ố m đỏ ở cá ba sa, cá trắm cỏ , cá bố ng tượng. Bệnh viêm ru ộ t g ặp ở cá ba sa và cá trắm cỏ . Tùy từng loài cá có th ể xu ất hiện đ ơn b ệnh hay có thể cùng lúc xu ất hiện 2–3 b ệnh. Còn Lê Th ị Thanh Loan (2004) đ ã thu các mẫu cá tra, cá ba sa nuôi ao và nuôi bè tại các vùng nuôi ở h uyện Hồ ng Ng ự (Đồ ng Tháp), M ộ c Hoá (Long An), tỉnh An Giang và Vĩnh Long đ ể phân lập các vi khu ẩn gây b ệnh trên các đ ố i tượng này chủ y ếu là nhóm Aeromonas, nh ư A. hydrophilla, A. caviae, A. sobria v à mộ t số loài khác nh ư Peudomonas fluorescens, Edwarsidla tarda (Tạp chí Thuỷ Sản, 2004). Ngoài ra còn mộ t số b ệnh trên cá cũng đ ã đ ược phân lập. Theo Dung et al (2001) trong đ iều tra xác đ ịnh b ệnh trên cá bố ng tượng cho th ấy nh ững vi khu ẩn phổ b iến gây b ệnh trắng da là Aeromonas hydrophila, Aeromonas sorbia , Pseudomonas eruginosa và Flexibacter columnaris g ây thiệt h ại lớn cho ng ười nuôi. Còn theo nghiên cứu của Bùi Quang Tề (2000) b ệnh này còn do vi khu ẩn gây b ệnh khác là Pseudomonas dermoalba g ây ra. Bệnh chủ y ếu g ặp ở cá h ương 2-3 cm các loài cá mè trắng, trắm cỏ , mè vinh... Bệnh lan truy ền rất rộ ng, gây tỷ lệ tử v ong cao, nh ất là khi v ận chuyển đ àn cá đ ã nhiễm b ệnh trắng da, tỷ lệ cá ch ết lên tới 90-100%. Ngoài ra b ệnh lở loét (Epizootic Ulcerative Syndrome) ở cá cũng là mộ t bệnh rất nguy hiểm, lây lan nhanh và xu ất hiện tại nhiều n ước trên thế g iới. Ở v iệt nam, b ệnh xu ất hiện h ầu h ết các Tỉnh, trên các loài cá nh ư: trắm cỏ , chép, rô phi, mè, trê. Nguyên nhân gây b ệnh khá ph ức tạp v ới các tác nhân truy ền nhiễm g ồ m virus, vi khu ẩn, n ấm và cả ký trùng M ột loài vi khuẩn gây bệnh đ ược phân lập trên cá bao g ồ m: Aeromonas hydrophyla, Aeromonas sobria Pseudomonas fluorescens, Flavobacterium sp, Micrococcus sp, Vibrio sp, Nocardia sp . Hiện nay có trên 100 loài cá mẫn cảm v ới b ệnh, bao gồ m cá trong tự nhiên, cá nuôi n ước ngọ t và cá nuôi n ước lợ. Triệu ch ứng b ệnh g ồ m có: Da trở n ên s ậm màu xám, 7
trên thân, đ ầu, vây, đ uôi xu ất hiện các đố m màu xám, trắng ho ặc đỏ rồ i hình thành v ết loét. Các v ết loét lan rộng dần, có khi ăn sâu đ ến xương, v ảy b ị rụ ng…Th ời gian mắc b ệnh thay đ ổ i tu ỳ thu ộ c vào loài cá, khí h ậu và ch ất lượng n ước. Bệnh th ường xảy ra khi ngu ồ n n ước có nhiệt độ th ấp (từ tháng 11 – tháng 12) (Từ Thanh Dung, 2002). Để xác đ ịnh tác nhân gây b ệnh thì ph ải tiến hành đ ịnh danh. Có nhiều cách đ ể đ ịnh danh nh ư ph ương pháp test củ a Baumann et al (1984), ph ương pháp này đ ã đ ược dùng phổ b iến nh ưng do tố n nhiều công và môi trường để chu ẩn b ị n goài ra th ời gian test dài, nên ng ười ta đ ã s ử d ụng nhiều ph ương pháp test nhanh khác nh ư p h ương pháp test API-zy m, API-NFT, API-RE... Đặc biệt đ ó là hệ thố ng test nhanh API 20E th ường đ ược dùng ph ổ b iến do ph ương pháp này s ử dụ ng đ ơn giản , chu ẩn đ oán nhanh và đ ược s ử d ụng làm b ằng tay. Hiện nay API 20E cũ ng đ ựơc s ử d ụng tests trên nhiều đ ố i tượng. Trong tổ ng số 223 loài vi khu ẩn đ ược phân lập b ằng h ệ thố ng API 20E bao gồ m: Aeromonas di độ ng, A. salmonicida, Vibrio a nguillatum, Pasteurella p iscicida v à Yersinia reckeri... Ngoài ra h ệ th ống API 20E còn đ ược nhiều tác giả d ùng đ ể đ ịnh danh vi khu ẩn Vibrio v à Aeromonas trên ng ười và vi khu ẩn Edwardsiella tarda (Beverly, 1999) Kozinska et al (2002) dùng API 20E đ ể đ ịnh danh các ch ủng vi khu ẩn Aeromonas n h ư A. hydrophila, A. sobria, A. caviae v à A . media , các ch ủng vi khu ẩn này đ ược phân lập từ cá chép. Còn Kara et al (2000) cũ ng đ ịnh danh vi khu ẩn A. hydrophila, A. caviae v à A. sobria trên cá h ồ i. Ông so sánh v ới kết qu ả đ ịnh danh sinh hoá trên ố ng nghiệm và cho rằng h ệ th ống này có th ể dùng để phân lập Aeromonas đ ố i v ới các chủ ng A. h ydrophila , A. caviae và A. sobria . Qua đ ó cho thấy h ệ th ống đ ịnh danh nhanh API 20E th ường đ ược dùng để đ ịnh danh vi khu ẩn Vibrio, Aeromonas nói riêng và các loài vi khu ẩn khác nói chung. Đồ ng th ời theo hệ th ống đ ịnh danh củ a bioMerieux, kết qu ả đã đ ịnh danh đ ược các ch ủng vi khu ẩn Vibrio spp . 8
Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 3 .1 Vật liệu Các ch ủng vi khu ẩn đ ược s ưu tập từ các đ ề tài nghiên cứu v ề b ệnh thu ỷ s ản của Khoa Thu ỷ ho ặc phân lập từ tôm cá b ệnh trong th ời gian triển khai đ ề tài. 3 .2 Hoá chấ t và môi trường nuôi c ấy 3 .2.1 Các loại môi trường dùng trong nghiên cứu vi khuẩ n 3.2.1.1 Môi trường phân l ậ p vi khuẩ n * M ôi trường tổ ng hợ p - M ôi trường Trypticase Soya Agar (TSA) - Môi trường Nutrient Agar (NA) - Môi trường Trypticase Soya Broth (TSB) * M ôi trường chọ n lọc - M ôi trường thạch Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose (TCBS) - Môi trường thạch Rimler Short (RS) - Môi trường thạch Pseudomonas - Môi trường thạch Aeromonas - Môi trường Phát quang * M ôi trường nuôi tă ng sinh - M ôi trường Nutrient Broth (NB) - Môi trường thạch Brain heart infusion (BHI) 3 .2.1.2 Môi trường dùng cho các phản ứng sinh hoá - Các mô i trường đ ường (Glucose, Arabinose, Cellobilose, Galactose, Glycerol, Lactose, Mannitol, Salicin, Sucrose, Xylose) dùng để kiểm tra kh ả n ăng lên men củ a vi khu ẩn. - M ôi trường OF dùng để kiể m tra kh ả n ăng Oxi hoá và lên men củ a vi kh ẩn - M ôi trường thạch Muller Hinton (MHA) dùng cho ph ản ứng O/129 đ ể p hân biệt 2 giố ng vi khu ẩn Vibrio và Aeromonas - M ôi trường thạch Cimon Citrat Agar dùng kiểm tra kh ả n ăng xử d ụ ng ngu ồn cacbon củ a vi khu ẩn - M ôi trường th ạch d ưỡng (NA) +12% gelatin dùng kiểm tra kh ả năng phân h ủ y genlatin - M ôi trường th ạch d ưỡng (NA) + Starch dùng kiểm tra kh ả n ăng thủ y phân tinh bộ t 9
- M ôi trường KCN broth dùng kiểm tra kh ả n ăng mọ c hay không mọ c củ a vi khu ẩn trong môi trường có Cyanua - M ôi trường Nitrat Broth dùng kiể m tra kh ả n ăng kh ử Nitrat củ a vi khu ẩn - M ôi trường Methyl Red-Voges Prosauer dùng cho phản ứng MR-VP - M ôi trường Tryptophan Broth dùng kiểm tra kh ả n ăng sinh Indol - M ôi trường Decacboxylase + 1% Amino acid (Arginine, Lysine, Ornithine) dùng kiểm tra kh ả n ăng kh ử A mino acid - M ôi trường Bacto pepton - M ôi trường Blood Agar Base - M ôi trường Ure broth - M ôi trường Tryptone Soya broth + 1% ho ặc 2%…NaCl đ ể kiể m tra nhu cầu và kh ả n ăng ch ịu đ ựng n ồng đ ộ mu ố i 3 .2.1.3 Một s ố t huốc thử - Dung d ịch Oxy già H2 O2 3% cho phản ứng Catalase - Dung d ịch Tetramethy P-Phenylenediamin-edihydrochloride 1% dùng cho ph ản ứng kiểm tra Oxidase - Dung d ịch Kovac’s dùng cho phản ứng sinh Indole - Thuố c th ử Nitrat - Thuố c th ử Lugol’s Iodine - Thuố c th ử HgCl2 - Các dung d ịch nhuộ m Gram 3 .3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp nuôi cấy và phân l ậ p vi khu ẩn - Nuôi cấy từ mẫu bệnh: Cấy mẫu b ệnh ph ẩm trên môi trường TSA hoặc NA (thêm 1,5% NaCl v ới vi khu ẩn n ước lợ) và môi trường chọ n lọ c TCBS, RS, Psedomonas …Ủ ở n hiệt đ ộ 28-35o C, đ ọ c kết q ủ a sau 24 giờ, yêu cầu ph ải có khu ẩn lạc tách rời nhau - Nuôi cấ y ròng : Dựa vào hình d ạng, màu s ắc và kích tước củ a khuẩn lạc để xác đ ịnh các ch ủng vi khu ẩn nghi ng ờ có kh ả n ăng gây b ệnh trên đ ĩa phân lập. Dùng que cấy vô trùng, cấy chuy ển từng khu ẩn lạc sang đ ĩa môi trường TSA hay NA (thêm 1,5% NaCl v ới vi khu ẩn n ước lợ), ủ ở nhiệt độ 28-35o C trong 24-48 giờ . - Kiểm tra tính thuầ n chủng : Xác đ ịnh tính thu ần ch ủng của vi khu ẩn d ựa vào s ự đồ ng nhất v ề h ình dạng, kích th ước củ a khu ẩn lạc. 3 .3.2 Phương pháp xác đị nh các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hóa Các ch ỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa đ ược ch ọn để đ ịnh danh d ựa theo h ệ thố ng phân lo ại củ a Baumann và cộng s ự, 1984. Các đ ặc đ iểm sinh lý sinh hóa đ ược xác đ ịnh d ựa theo cẩm nang Cowan and Steels (Barrow và Feltham, 1993) và ph ương pháp củ a West & Colwell (1984). M ỗ i ch ỉ tiêu đ ược xác đ ịnh ba lần kết qu ả đ ược ghi nh ận là kết qu ả có ít nh ất 2 lần lặp lại. 10
3 .3.2.1 Xác đị nh các chỉ tiêu về hình thái Quan sát hình d ạng và màu s ắc khu ẩn lạc trên môi trường phân lập chung Nutrient agar và môi trường phân lập chuyên biệt nh ư TCBS, Aero monas hay RS, Pseudomonas… Hình d ạng, kích th ước và tính ròng củ a vi khu ẩn đ ược xác đ ịnh b ằng ph ương pháp nhu ộ m Gram 3 .3.2.2 Xác đị nh các chỉ tiêu về s inh lý Kh ả n ăng di động Kh ả n ăng di độ ng củ a vi khu ẩn đ ược quan sát bằng cách nh ỏ mộ t giọ t n ước cất lên lam, lấy que cấy trãi đ ều lên lam mộ t ít v i khu ẩn. Đậy lại b ằng lammela và quan sát bằng kính hiển vi ở v ật kính 100X. Phản ứng Catalase Dùng que cấy nhặt mộ t ít vi khuẩn đ ể lêm lam, sau đ ó nh ỏ lên vi khu ẩn mộ t giọ t 3% H2 O2 .Vi khu ẩn cho ph ản ứng Catalase (+) s ẽ g ây hiện tượng sủ i bọ t trong dung d ịch 3% H2 O2 v à ng ược lại Kh ả n ăng phát triển của vi khu ẩn ở các n ồng độ 0 , 3, 6, 8, 10% NaCl Vi khu ẩn th ử nghiệm đ ược cấy vào trong các ống nghiệm có ch ứa 3ml môi trường 1% Tryptone có thêm NaCl ứng v ới các n ồng độ 0, 3, 6, 8 và 10% NaCl. Để trong tủ ấm ở 30 o C. Sau 2-4 ngày, môi trường đ ục cho kết qu ả (+) và ng ược lại. 3 .3.2.3 Xác đị nh các chỉ tiêu sinh hoá • Kh ả n ăng lên men và oxi hóa đ ường glucose (O/F) • Tính mẫn cảm v ới h ợp ch ất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129) • Ph ản ứng Decarboxylase • Kh ả n ăng sinh Indole • Ph ản ứng Voges-Proskauer (VP) • Ph ản ứng tạo Nitrite từ n itrate • Kh ả n ăng s ử d ụng Citrate • Tính phát quang • Kh ả n ăng thu ỷ p hân Starch • Kh ả n ăng thu ỷ p hân Gelatin • Kh ả n ăng thu ỷ p hân Lipit (Tween 80) • Kh ả n ăng s ử d ụng các ngu ồn Carbohydrate • Kh ả n ăng s ử d ụng Urê • Kh ả n ăng sinh ga và H2 S • M ôi trường Esculin 11
3 .4 Phương pháp trữ l ưu trữ và phục hồi vi khuẩn Hệ th ố ng cryobead (Microbank™, Pro-Lab Diagnostics, UK) đ ược ch ọ n s ử d ụng để lưu trữ v i khu ẩn. Hệ th ố ng này cho phép lưu trữ v i khu ẩn ở n hiệt đ ộ -70°C trong mộ t th ời gian dài mà không làm ảnh h ưởng đ ến các đ ặc tính sinh h ọc củ a chúng. Vi khu ẩn đ ược cấy lên môi trường th ạch d ưỡng (Nutrient Agar) và đ ược ủ 24 giờ ở 28°C. Phân n ữa số khu ẩn lạc mọ c trên đ ĩa ISA đ ược thu b ằng que cấy tiệt trùng và trữ v ào ống cryobead và giữ ở -70°C. Sau 48h vi khu ẩn đ ược phụ c hồ i lên môi trường ISA ở 28°C đ ể kiể m tra kh ả n ăng ph ục h ồ i và tính thu ần chủ ng. 3 .5 Phương pháp xử lí s ố liệu Các ch ỉ tiêu v ề h ình thái, sinh lý và sinh hoá đ ược mã hoá bằng s ố 0 tương ứng v ới kết qu ả âm tính và s ố 1 tương ứng v ới kết qu ả d ương tính. Số liệu sau đ ó đ ược s ử d ụ ng đ ể xác đ ịnh mức đ ộ g iố ng nhau giữa các chủ ng vi khu ẩn phân lập và các ch ủng chu ẩn bằng biểu đồ phân nhánh qua ch ương trình phân tích cụ m của ph ần mề m Statistica 5.0. Th ước đ o mức đ ộ g iố ng nhau giữa các ch ủng vi khu ẩn đ ược xác đ ịnh b ằng kho ảng cách Euclid (Euclidean distance). 12
Phần IV: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 1 . S ưu tầm các chủng vi khuẩ n gây bệnh trên độ ng vậ t thủy s ản Các ch ủng vi khu ẩn gây b ệnh trên đ ộng v ật thủ y s ản ở v ùng ĐBSCL đ ược s ưu tập từ các đ ề tài nghiên cứu bệnh thu ỷ s ản trước đây tại Đại h ọ c Cần thơ v à từ n gu ồn tôm, cá đ ược xét nghiệm. Các ngu ồ n s ưu tập bao g ồ m: 1. Đề tài th ử n ghiệm vaccin phòng bệnh xu ất huy ết ở cá chép 2. Dự án FAO v ề b ệnh cá trong mùa lũ ở ĐBSCL 3. Dự án Jircas v ề b ệnh ở ấu trùng tôm càng xanh 4. M ẫu xét nghiệm tôm b ị b ệnh phân trắng 5. M ẫu tôm giố ng xét nghiệm vi khu ẩn phát quang Thông tin chi tiết v ề nguồ n g ốc củ a từng chủ ng vi khu ẩn trên đ ược trình bày ở p hụ lụ c 1. Kết qu ả s ưu tập đ ược 306 ch ủ ng vi khu ẩn, trong đ ó mộ t số chủ ng đ ã đ ược tác giả củ a các đ ề tài đ ịnh danh. M ộ t s ố chủ ng đ ược đ ịnh danh trong quá trình th ực hiện đề tài này. Chi tiết cụ th ể đ ược tóm tắt nh ư sau: Các ch ủ ng vi khu ẩn đ ã đ ược đ ịnh danh trước khi s ưu tập 1. 11 ch ủ ng vi khu ẩn Aeromonas hydrophyla từ đ ề tài th ử nghiệm vaccin phòng b ệnh xu ất huyết ở cá chép (LVTNĐ H, 2001) 2. 45 ch ủ ng vi khu ẩn giố ng Aeromonas sp p hân lập từ tôm càng xanh b ị b ệnh cụt râu, mòn ph ụ bộ đ ề tài FAO (LVTN ĐH, 2002) 3. 32 ch ủ ng vi khu ẩn phát quang từ nguồ n tôm sú đ ược xét nghiệm là Vibrio sp (LVTNĐ H 2002) Các ch ủ ng vi khu ẩn đ ã đ ược đ ịnh danh sau khi s ưu tập 4. 16 ch ủ ng vi khu ẩn giống Vibrio p hân lập từ ao nuôi tôm sú b ị bệnh phân trắng, trong đó 8 ch ủng Vibrio sp , 3 chủ ng V. vulnificus, 3 V. cholerae, 1 chủ ng V. navarrensis v à 1 ch ủng V. hollisae. 5. 11 ch ủ ng vi khu ẩn Vibrio sp từ tôm b ệnh củ a đề tài Jicas 6. 142 ch ủng vi khu ẩn giống Aeromonas phân lập từ cá b ệnh đ ề tài FAO, trong đó có 129 ch ủ ng Aeromonas sp , 7 ch ủng A. hydrophila , 5 chủ ng A. sobria , và 1 ch ủng A. caviea (Dự án FAO) 7. 49 ch ủ ng vi khu ẩn phát quang giố ng Vibrio từ n gu ồn tôm sú đ ược xét nghiệm, trong đ ó có 25 ch ủ ng Vibrio sp , 22 ch ủ ng V. carchariea , 2 ch ủ ng V. vulnificus. 13
M ặc dù s ố lượng mẫu ch ưa phong phú và đa d ạng nh ưng tất cả các giống loài vi khu ẩn này đ ược phân lập và nghiên cứu có h ệ thố ng trên tôm cá nuôi ở v ùng Đồ ng Bằng Sông Cửu Long. Các ch ủng vi khu ẩn này s ẽ là nguồ n mẫu v ật tốt cho các nghiên cứu tiếp theo v ề d ịch tể họ c, các thí nghiệm phòng trị b ệnh… Tuy nhiên, việc s ưu tập mẫu vi khu ẩn gây d ịch bệnh trên đ ộng v ật thủ y s ản từ các s ở thuỷ s ản đ ịa ph ương vẫn còn g ặp nhiều khó kh ăn. Nguyên nhân do các trung tâm khuy ến ng ư, các s ở thuỷ sản đ ịa ph ương không có lưu trữ các chủ ng vi khu ẩn gây b ệnh khi kh ả o s át hay phân tích mẫu b ệnh ph ẩm. M ộ t trở ng ại n ữa do yếu tố ch ủ quan và khách quan v ề v iệc s ưu tập mẫu vi khu ẩn là không liên lạc đ ược v ới các Trường Đại h ọ c Thuỷ sản cũ ng nh ư các Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồ ng Thu ỷ Sản. Vì v ậy, đ ề tài v ẫn còn h ạn ch ế v ề s ự p hong phú các ch ủng loài vi khu ẩn th ường gây b ệnh trên đ ộng v ật thuỷ s ản nói chung và tôm cá s ống ở n ước ng ọt và lợ n ói riêng. 2 . Đặc điểm sinh lý, sinh hoá củ a các ch ủng vi khuẩn s ưu tậ p Các chủng vi khuẩ n Vibrio từ tôm sú Kết qu ả phân tích cụ m b ằng phần mềm Statictica d ựa trên các đ ặc đ iểm sinh lý, sinh hoá b ằng ph ương pháp truy ền thố ng và s ử d ụng b ộ test API về đặc đ iểm sinh lý sinh hoá củ a các chủ ng vi khu ẩn Vibrio s ưu tập đ ược trình bày chi tiết trong các b ảng 1 và 2. Các ch ủ ng vi khu ẩn phát quang từ n gu ồn tôm sú đ ược xét nghiệm, tôm sú b ị bệnh phân trắng và tôm sú b ệnh gồ m có 22 chủ ng V. carchariae, 25 chủ ng Vibrio sp , 5 ch ủ ng V. vulnificus, 1 ch ủng V. hollisae, 1 ch ủng V. navarrensis v à 3 ch ủng V. cholerae. B ảng 1. Đặ c điể m hình thái, sinh lí và sinh hóa củ a các chủng vi khuẩn Vibrio định danh bằng PP sinh hoá truyền th ống Vibrio Vibrio Vibrio Vibrio Vibrio Vibrio Chỉ tiêu carchariae cholerae navarrensis carchariae cholerae navarrensis (n=22) (n=3) (n=1) (chuẩn) (chuẩn) (chuẩn) T rượt - - - - - - Nhuộm gram - - - + + + Di động + + + + + + Catalase + + + + + + Oxidase + + + + + + Arginine - - + - - - Lysine + + + + + + Ornithine 19 + + + + - 0% NaCl 11 + + - + + 3% NaCl + + + + + + 6% NaCl 20 2 + + + + 8% NaCl 8 - + - - + 10% NaCl - - + - - + O t est + + + + + + 14
F test + + - + + + Urease 19 - - + - - T CBS + + + + + + Phát quang 20 - - - - - Citrate 6 - + + + + Indole 19 + + + + + VP - + + - + + Nitrate 18 + + + + + Amylase + 2 - + + - Gelatinase + + + + + - Glucose + + + - + + Gas from 2 - - + - + glucose Arabinose 20 + + + - + Cellobiose + + + + - + Galactose + + + + + + Glycerol + + + + + + Lactose + + - + + + M annitol + + + + + + Salicin + + + + - + Sucrose 21 + - + + + Xylose 21 - + - - + +: Tấ t cả các ph ản ứng đều dương; -: Tấ t cả các ph ản ứng đề u âm; Ch ữ s ố: S ố chủ ng cho ph ản ứng dương Dựa vào đ ặc đ iểm giố ng nhau v ề h ình thái sinh lí và sinh hóa củ a củ a các ch ủng vi chu ẩn. Cả 2 6 ch ủ ng vi khu ẩn đ ều có kh ả n ăng mọ c trên môi trường TCBS và khu ẩn lạc có hình d ạng giống nhau, hình tròn h ơi lồ i, có màu xanh ho ặc vàng, có dạng hình que, gram âm, di đ ộ ng và không có chủ ng nào trượt trên môi trường th ạch d ưỡng. Đồ ng thời các ch ủng này còn cho ph ản ứng Oxidase, Catalase, ph ản ứng lêm men oxy hoá, ph ản ứng v ới Lysine, Genlatine, Amylase, Arginine, VP và tạo acid trong các môi trường đ ường... Đặc biệt tất cả các ch ủng đ ều số ng trong môi trường 1% pepton có ch ứa 3% NaCl. Vibrio carchariae Có 22 ch ủ ng V. carchariae trong số 26 ch ủ ng vi khu ẩn đ ược đ ịnh danh. Cả 22 ch ủng này đ ều có d ạng hình que, Gram âm và không trượt trên môi trường th ạch d ưỡng. Cho ph ản ứng Oxidase và Catalase d ương tính và khi nuôi cấy trên môi trường chuyên biệt TCBS vi khu ẩn có dạng hình tròn h ơi lồ i, màu vàng hoặc xanh. Ngoài ra còn cho phản ứng d ương v ới Lysine, Ornithine (19 ch ủ ng), Urease (19 ch ủng), Citrate (6 ch ủng), Indole (19 ch ủng) và tạo Nitrite từ Nitrate (18 ch ủng). Đặc biệt trong số các ch ủng này có khả năng phát triển ở cá n ồng độ 0%, 3%, 6% và 8% NaCl còn n ồ ng đ ộ 10% NACl không có chủ ng nào phát triển. Hầu h ết các ch ủng này đ ều tạo acid trong các môi trường đ ường ngoại trừ A rabinose (2 ch ủng), Sucrose (1 ch ủng) và Xylose (1 ch ủng) không tạo acid. Đồ ng th ời cho ph ản ứng lên men (F) và ph ản ứng Oxidation (O), ph ản ứng thuỷ p hân Starch và d ịch hoá 15
Gelatinase có 42 ch ủng. Ngoài ra các chủ ng này phản ứng âm v ới Arginine, VP và không sinh gas từ đ ường Glucose. Vibrio cholerae Có 3 trong s ố 26 chủ ng vi khu ẩn đ ược đ ịnh danh là V. cholerae. Vi khu ẩn này khi nuôi cấy trên môi trường chuyên biệt TCBS khu ẩn lạc có d ạng hình tròn h ơi lồ i có màu vàng ho ặc xanh. Vi khu ẩn Gram âm, h ình que, di đ ộ ng, không trượt trên môi trường th ạch d ưỡng và các ch ủng này còn cho ph ản ứng Oxidase, Catalasa d ương tính. Đồ ng th ời các ch ủng này đ ều cho phản ứng Arginine, Urease âm tính. Cả 3 ch ủng đ ều phát triển ở n ồng độ mu ố i 0% và 3% nh ưng không có khả năng phát triển đ ược ở nồ ng đ ộ mu ố i 8% và 10% còn ở nồ ng đ ộ 6% NaCl có 2 ch ủng phát triển. Ngoài ra còn cho ph ản ứng lên men (F), ph ản ứng Oxidation, ph ản ứng d ương v ới VP, Lysine, Ornithine, tạo nitrite từ n itrate và d ịch hoá Gelatinase. Ngoài ra các ch ủng vi khu ẩn này còn tạo acid trong môi trường đ ường ngo ại trừ A rabinose, Xylose và 1 ch ủ ng không sinh ga từ đ ường Glucose. M ặt khác còn có s ự s ai khác đ ố i v ới chủ ng vi khu ẩn đố i ch ứng là cho ph ản ứng Citrate âm tính, 1 ch ủng không cho ph ản ứng thu ỷ phân Starch. Vibrio navarrensis Có 1 ch ủ ng trong số 26 ch ủng vi khu ẩn đ ịnh danh là V. navarrensis. Giố ng nh ư V. carchariae v à V. cholerae v i khu ẩn này khi nuôi cấy trên môi trường chuyên biệt TCBS khu ẩn lạc có dạng hình tròn h ơi lồ i có xanh, Gram âm, hình que, di độ ng, không trượt trên môi trường thạch d ưỡng và các ch ủng này còn cho ph ản ứng Oxidase, Catalasa d ương tính. Tất cả các ch ủng đ ều ph ản ứng d ương với Lysine, Citrate, Indole và VP. Ph ản ứng âm v ới Urease và không ph ản ứng thuỷ phân Starch. Mặt khác các ch ủng này có kh ả n ăng tạo acid trong môi trường đ ường Glucose, Arabinose, Glycerol, Mannitol, Cellobiose, Galactose, Salicin, Xylose. Ngo ại trừ mộ t s ố đ ường sai khác v ới ch ủ ng chu ẩn nh ư Lactose và Sucrose không tạo acid trong môi trường đ ường và phản ứng d ương v ới Arginine. Ngoài ra còn có kh ả n ăng phát triển ở nồ ng đ ộ mu ố i 0%, 3%, 6% , 8% và 10%. Ngoài ra còn ph ản ứng v ới Oxidation, ph ản ứng lên men (F) và tạo Nitrite từ N itrate. Đố i v ới ph ản ứng thuỷ phân Gelatine cho ph ản ứng âm. M ộ t đ ặc đ iểm khác n ữa là không sinh gas trong v ới đ ường Glucose trong khi mẫu chu ẩn sinh gas trong v ới đ ường Glucose. Kết qu ả đ ịnh danh đ ịnh danh theo ph ương pháp củ a bioMerieux b ằng cách s ử dụ ng h ệ thố ng đ ịnh danh nhanh API 20E có 5 ch ủ ng V. vulnificus, và 1 ch ủ ng V. hollisae. Đặc đ iểm sinh hoá của các ch ủng này đ ược trình bày ở b ảng 2 Bảng 2: Đặc điể m sinh lý và sinh hoá của các chủng vi khuẩ n Vi brio đị nh danh bằng hệ t hống API 20E Vibrio Vibrio Vibrio Vibrio Chỉ tiêu vulnificus hollisae vulnificus hollisae (chuẩn) (chuẩn) (n=5) (n=1) ONPG 3 - - + 16
A DH - - - - LDC + - + - ODC 1 - + - CIT 4 - - - H2S - - - - URE 4 - - - TDA + + - - IND + + + + VP - - - - GEL + + + - GLU + - + - M AN + - + - INO - - - - SOR - - - - RHA - - - - SAC 2 - - - M EL - - - - A MY 2 + + - A RA - - - - +: Tấ t cả các ph ản ứng đều dương; -: Tấ t cả các ph ản ứng đề u âm; Ch ữ s ố: S ố chủ ng cho ph ản ứng dương. Vibrio vulnificus Tất cả các ch ủng này đ iều cho ph ản ứng d ương v ới Lysine, Indole, Gelatinase, Glucose, Mannitol và ph ản ứng âm v ới Arginine, H2 S, VP, Inositol, Sorbitol, Rhamnose, Melibiose, Arabinose. Ngoài ra, còn mộ t s ố p h ản ứng sai khác v ới ch ủng chu ẩn đ ược trình bày ở b ảng 3 Vibrio hollisae Ch ủ ng V. h ollisae ph ản ứng âm v ới Arginine, Lysine, Ornithine, Citrate, H2 S, Urease, VP, Inositol, Sorbitol, Shamnose, Melibiose, Saccharose và Arabinose ch ỉ có 1 ph ản ứng d ương với Indole. Giố ng nh ư v i khu ẩn Vibrio vulnificus v à Vibrio fluvialis các ch ỉ tiêu sai khác đ ược trình bày ở b ảng 3 Bảng 3: Các chỉ tiêu sai khác với chủ ng chuẩn Chỉ tiêu Phản ứng dương sai Phản ứng âm sai V. vulnificus (n=5) ONPG 3/5 ODC 4/5 URE 4/5 TDA 4/5 SAC 2/5 A MY 2/7 V. hollisae (n=1) ONPG 1/1 17