Đề tài: " Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm tại phòng kiểm nghiệm Intertek - Cần Thơ"

Chia sẻ: Nhu Chau | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:68

Thêm vào BST

Báo xấu

134
lượt xem 28
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này em xin chân thành cảm ơn: Quý thầy cô trong bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản cùng quí thầy cô Trường Đại học Cần Thơ đã trang bị cho em những kiến thức vô cùng quý giá trong suốt quá trình học tập. Qua thời gian thực hiện đề tài em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến anh Hoàng Bá Nghị, chị Phạm Bích Kiểu và các anh chị khác ở phòng kiểm nghiệm Intertek đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập trong thời...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài: " Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm tại phòng kiểm nghiệm Intertek - Cần Thơ"

LỜI CẢM ƠN œ¯• Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này em xin chân thành cảm ơn: Quý thầy cô trong bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản cùng quí thầy cô Trường Đại học Cần Thơ đã trang bị cho em những kiến thức vô cùng quý giá trong suốt quá trình học tập. Qua thời gian thực hiện đề tài em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến anh Hoàng Bá Nghị, chị Phạm Bích Kiểu và các anh chị khác ở phòng kiểm nghiệm Intertek đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập trong thời gian qua. Em xin gởi lời cảm ơn đến thầy Vương Thanh Tùng, giáo viên hướng dẫn đã tận tình chỉ dạy cho em phương pháp thực hiện đề tài, cung cấp cho em nhưng tư liệu quí giá. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài. Cần Thơ, tháng 05 năm 2009 Sinh viên thực hiện DƯƠNG THỊ CẨM TRÚC
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN @&? .................................................................................................................................. .... .................................................................................................................................. .... .................................................................................................................................. .... .................................................................................................................................. .... .................................................................................................................................. .... .................................................................................................................................. .... .................................................................................................................................. .... ....................................................................................................................................... ....................................................................................................................................... ....................................................................................................................................... ....................................................................................................................................... ....................................................................................................................................... ....................................................................................................................................... ....................................................................................................................................... ....................................................................................................................................... ....................................................................................................................................... ....................................................................................................................................... ....................................................................................................................................... .................................................................................................................................. .... Cần thơ, ngày……tháng……năm 2009
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN @&? ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... Cần thơ, ngày……tháng……năm 2009 iv
TÓM LƯỢC –&— Trong tình hình hiện nay, việc xuất khẩu thuỷ sản của nước ta đang phải đối mặt với một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dư lượng thuốc kháng sinh, hóa chất, kim loại nặng trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. Sự tồn lưu kháng sinh, hóa chất trong mặt hàng thủy sản khi xuất khẩu nếu không được kiểm soát chặt chẽ sẽ gây ra những thiệt hại nặng nề cho doanh nghiệp chế biến thủy sản và cho uy tín của nước nhà. Trước tình hình xuất khẩu ngày càng nghiêm ngặt đòi hỏi sản phẩm xuất đi phải được kiểm định bởi các cơ quan kiểm nghiệm chất lượng có uy tín cao cả trong nước và trên quốc tế, đảm bảo sản phẩm được an toàn để có thể giải quyết được vấn đề rào cản an toàn vệ sinh thực phẩm của các nước nhập khẩu. Vì vậy, đề tài “Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản tại phòng kiểm nghiệm Intertek – Cần Thơ” có thể giúp ta tìm hiểu được phương pháp tối ưu để định lượng sự tồn lưu của nhóm kháng sinh, kim loại nặng … trong sản phẩm thủy sản. Qua quá trình tìm hiểu đã ghi nhận được một số phương pháp định lượng kháng sinh, hóa chất, kim loại nặng…còn tồn lưu trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. - Một số phương pháp kiểm kháng sinh Định lượng Cloramphenicol trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS Phương pháp xác định hàm lượng Leucomalachite Green bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS Định lượng Nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS - Phương pháp kiểm thuốc trừ sâu: Định lượng thuốc trừ sâu họ Chlor bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GCMS) - Một số phương pháp kiểm kim loại nặng Phương pháp định lượng Cadmium (Cd) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS) Phương pháp định lượng thủy ngân (Hg) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS) Phương pháp định lượng chì (Pb) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS) v
Phương pháp định lượng Arsenic (As) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS) vi
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT –&— Những chữ viết tắt sau đây đã được sử dụng trong đề tài luận văn: HACCP Hazard Analysis Critical Control Point HPLC High pressure Liquid chromatography UV – VIS Ultraviolet-visible spectroscopy AAS Atomic Absorption Spectroscopy AES Atomic Emission Spectroscopy MS Mass spectrometry MP Mobile phase API Atmospheric Pressure Ionization APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization LC-MS Liquid chromatography - Mass spectrometry ESI Electrospray Ionization FAAS Flame atomic absorption spectrometry). ET Electrothermal GFA Graphite Furnace Atomizer HGAAS Hydride generation atomic absorption spectrometry CV-AAS Cold Vapour Atomic Absorption Spectroscopy CAP Cloramphenicol m – CAP meta – cloramphenicol ACN Acetonitrile EtOAC Ethyl acetate MeOH Methanol MG Malachite green LMG Leucomalachite green AOZ 3-amino-2-oxazolidinon AMOZ 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon AHD 1-amino-hyđantoin hyđroclorit SEM Semicarbazit NPAOZ 3-((2-nitrophenyl)metylen)-amino-2-oxazolidinon NPAMOZ 5-metylmorfolino-3-((2-nitrophenyl)metylen)-3- amino-2-oxazolidinon NPAHD 1-(2-nitrophenyl)metylen-amino-hyđantoin NPSEM (2-nitrophenyl) metylen-semicarbazit 2 – NBA 2-nitrobezaldehyd GCMS Gas chromatography mass spectrometry ppm Parts per million vii
ppb Parts per billion mm Micrometer ng Nanogram HA Hydroxylamine.HCl TSA p-toluen sulfonic acid monohydrate Đệm:ACN Dung dịch đệm : Acetonitrile viii
DANH SÁCH HÌNH –&— Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống máy HPLC...............................................................................7 Hình 4.1 Đồ thị khảo sát độ tuyển tính của As trong khoảng nồng độ từ 0.5ppb đến 10ppb.......................................................................................................................50 ix
DANH SÁCH BẢNG –&— Bảng 4.1. Mối liên hệ giữa thể tích và nồng độ của chuẩn CAP và nội chuẩn m- CAP thêm vào để dựng đường chuẩn..................................................................... 16 Bảng 4.2. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích CAP ........ 17 Bảng 4.3. Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm MG và LMG vào mẫu trắng để dựng đường chuẩn ............................................................................................. 21 Bảng 4.4. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích MG và LMG .......................................................................................................... 22 Bảng 4.5. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích Nitrofuran27 Bảng 4.6. Điều kiện phân mảnh MS/MS của hỗn hợp dẫn xuất của các chất trong nhóm Nitrofuran ..................................................................................................... 28 Bảng 4.7. Chương trình nhiệt chạy trên NCI source khi phân tích thuốc trừ sau họ Chlor .......................................................................................................... 31 Bảng 4.8. Chương trình nhiệt chạy trên EI source khi phân tích thuốc trừ sau họ Chlor .......................................................................................................... 32 Bảng 4.9. Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm Hg vào mẫu trắng để dựng đường chuẩn .......................................................................................................... 35 Bảng 4.10. Chương trình cài đặt đối với lò graphit khi phân tích Cd bằng quang phổ hấp thu nguyên tử AAS ................................................................................... 39 Bảng 4.11. Chương trình cài đặt đối với lò graphit khi phân tích Cd bằng quang phổ hấp thu nguyên tử AAS ................................................................................... 42 Bảng 4.12. Các thông số cài đặt trên máy phá mẫu Multiwave 3000 .................... 46 Bảng 4.13. Thể tích chuẩn As 100ppb thêm vào để dựng đường chuẩn As .......... 46 Bảng 4.14. Mối liện hệ giữa nồng độ và độ hấp thu của As khi chạy chuẩn ......... 48 Bảng 4.15. Độ thu hồi của As trên mẫu spike 20ppb và mẫu spike 100ppb.......... 49 Bảng 4.16. Độ tái lặp trên các nền mẫu khác nhau tại 20ppb ................................ 49 Bảng 4.17. Độ lặp lại trên mẫu tôm spike 1ppb ở 3 ngày khác nhau..................... 50 Bảng 4.18. Độ hấp thu của As khi chạy 20 mẫu spike 20ppb và 20 mẫu blank .... 50 x
MỤC LỤC –&— LỜI CẢM ƠN...........................................................................................................ii NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ....................................................iii NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN........................................................iv TÓM LƯỢC ............................................................................................................. v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................................vii DANH SÁCH HÌNH ...............................................................................................ix DANH SÁCH BẢNG............................................................................................... x MỤC LỤC ...............................................................................................................xi CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................... 1 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 2 2.1 Giới thiệu về phòng kiểm nghiệm Intertek................................................. 2 2.2 Kháng sinh và vệ sinh an toàn thực phẩm thủy sản.................................... 2 2.2.1 Khái niệm về thuốc kháng sinh .......................................................... 2 2.2.2 Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm thủy sản.... 2 2.2.3 Ảnh hưởng bất lợi của thuốc kháng sinh .................................................. 3 2.3 Quyết định của Bộ Thủy Sản...................................................................... 3 2.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ký .............................................................. 4 2.4.1 Giới thiệu về sắc kí khí....................................................................... 5 2.4.2 Sắc kí lỏng cao áp_ hệ thống HPLC................................................... 6 2.4. 3 Giới thiệu hệ thống AAS .................................................................. 11 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................. 13 3.1 Các phương pháp và phương tiện thực nghiệm........................................ 13 3.1.1 Các phương pháp.............................................................................. 13 3.1.2 Phương tiện thực hiện....................................................................... 13 3.2 Các bước thực hiện đề tài ......................................................................... 13 3.3 Thời gian thực hiện đề tài ......................................................................... 13 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ ...................................................................................... 14 4.1 Một số phương pháp kiểm các nhóm kháng sinh ..................................... 14 4.1.1 Nhóm kháng sinh Cloramphenicol.................................................. 14 4.1.2 Nhóm kháng sinh Malachite Green và Leucomalachite Green....... 18 xi
4.1.3 Nhóm kháng sinh Nitrofuran:........................................................... 23 4.2 Phương pháp kiểm thuốc trừ sâu .............................................................. 28 4.3 Một số phương pháp phân tích kim loại nặng .......................................... 33 4.3.1 Qui trình phân tích thủy ngân (Hg) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản ......................................................................................................... 33 4.3.2 Qui trình phân tích Cadmium (Cd) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản ......................................................................................................... 37 4.3.3 Qui trình phân tích Chì (Pb) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản .......................................................................................................... 40 4.3.4 Qui trình phân tích Arsenic (As) tổng số trong thủy sản và sản phẩm thủy sản ......................................................................................................... 43 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT............................................................ 52 5.1 Kết luận..................................................................................................... 52 5.2 Đề xuất ...................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 53 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 55 xii
Chương I: ĐẶT VẤN ĐỀ Thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam, nhưng hiện nay ngành thủy sản nước ta phải đối mặt với một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dịch bệnh và dư lượng thuốc kháng sinh trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. Dư lượng các thuốc kháng sinh còn tồn đọng trong thủy sản rất có hại đối với sức khỏe con người và ảnh hưởng đến nền kinh tế thị trường nước nhà. Bộ Thủy sản cho rằng do hoạt động kiểm soát dư lượng, hóa chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa được thực hiện nghiêm túc tại tất cả các công đoạn từ nuôi trồng, đánh bắt, thu mua vận chuyển nguyên liệu, đến chế biến, nên trong năm 2004 số lô hàng bị thị trường nhập khẩu phát hiện kháng sinh có hại vẫn còn cao (EU: 22 lô, Mỹ: 13 lô, Canada: 27 lô). Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến uy tín chất lượng thuỷ sản Việt Nam trên thị trường thế giới. Hậu quả là Tổng vụ Bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng EU (SANCO) đã cử Đoàn cán bộ thanh tra đến Việt Nam để kiểm tra hoạt động ngăn chặn hoá chất, kháng sinh có hại trong thủy sản ở Việt Nam trong tháng 4/2005; Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ đã kiểm tra chương trình HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point- Hệ thống phân tích các mối nguy cơ và điểm kiểm soát tới hạn) của các doanh nghiệp có liên quan của Việt Nam trong tháng 9/2005. TS. Nguyễn Tử Cương, Cục trưởng Cục Quản lý Chất lượng, An toàn Vệ sinh Thú y Thuỷ sản, nhận xét: “Công tác quản lý chất lượng, an toàn vệ sinh và thú y thuỷ sản đã duy trì ổn định, giải quyết kịp thời các rào cản của những thị trường xuất khẩu quan trọng như Nhật Bản, EU, Nga... Nhưng năng lực của các cơ quan địa phương còn hạn chế, chính quyền địa phương đầu tư chưa đúng mức, ngay cả ở các tỉnh trọng điểm”. Trước tình hình xuất khẩu ngày càng nghiêm ngặt đòi hỏi sản phẩm xuất đi phải được kiểm định bởi các cơ quan kiểm nghiệm chất lượng có uy tín cao cả trong nước và trên quốc tế, đảm bảo sản phẩm được an toàn để có thể giải quyết được vấn đề rào cản an toàn vệ sinh thực phẩm của các nước nhập khẩu đối với mặt hàng thủy sản của nước ta và Intertek cũng là một trong những công ty kiểm định hàng đầu được quốc tế công nhận đã cung cấp dịch vụ đảm bảo chất lượng cho nhiều ngành công nghiệp khác nhau trong đó có lĩnh vực thực phẩm thủy sản và đã được VILAS công nhận đạt chuẩn ISO 17025:2005. Vì vậy, đề tài “Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản tại phòng kiểm nghiệm Intertek – Cần Thơ” có thể giúp ta tìm hiểu được phương pháp tối ưu để định lượng sự tồn lưu của nhóm kháng sinh, kim loại nặng… trong sản phẩm thủy sản. 1
Chương II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về phòng kiểm nghiệm Intertek - Cty TNHH Intertek Việt Nam – chi nhánh Cần Thơ được thành lập theo giấy phép số 011043000077 ngày 10/11/2008 do UBND thành phố Hà Nội cấp; chứng nhận đăng ký hoạt động chi nhánh số 5714000009F cấp ngày 17/02/2008 do UBND TP. Cần Thơ, Sở kế hoạch đầu tư cấp, nghề kinh doanh: kiểm nghiệm và giám định sản phẩm, xác nhận chất lượng, cung cấp dịch vụ chứng nhận hệ thống quản lý chất lượng và sản phẩm, cấp chứng thư cho các sản phẩm, tư vấn về hệ thống, kỹ thuật phòng kiểm nghiệm. - Địa chỉ chi nhánh: M10, 11, 12, 13 Khu đô thị Nam Sông Cần Thơ, Phường Phú Thứ, Quận Cái Răng, TP. Cần Thơ. - Đại diện Cty: Ông Hà Ngọc Long – Giám đốc Cty. - Phụ trách phòng kiểm nghiệm: Ông Hoàng Bá Nghị, trưởng phòng kiểm nghiệm. - Số mẫu phân tích hóa và sinh năm 2008: 15393 mẫu, 3 tháng đầu năm 2009: 2477 mẫu hóa ( mẫu thủy sản đông lạnh và đồ hộp), 1087 mẫu vi sinh (mẫu cá tra và vệ sinh công nghiệp). Mẫu do Trung Tâm vùng 6 gửi nhà thầu phụ là Intertek chi nhánh Cần Thơ phân tích: 41 mẫu hóa. - Phòng kiểm nghiệm công ty đã được VILAS công nhận ISO 17025 : 2005 theo quyết định số 644/QĐ-CNCL ngày 31/12/2008 số hiệu VILAS 278, lĩnh vực hóa học, sinh học. - Chi nhánh gồm hai phòng, gồm phòng hành chính và phòng kiểm nghiệm (gồm hóa và vi sinh). 2.2 Kháng sinh và vệ sinh an toàn thực phẩm thủy sản 2.2.1 Khái niệm về thuốc kháng sinh Kháng sinh là một nhóm chất hữu cơ phức tạp đầu tiên do vi sinh vật sản xuất ra trong lúc chúng sinh trưởng và với một lượng nhỏ có tác dụng gây hại đối với vi sinh vật khác, một số vi khuẩn, vi nấm có khả năng tạo ra kháng sinh, những kháng sinh này có khả năng ngăn chặn sự sinh trưởng của một số vi khuẩn, virus, nấm bệnh và một số kí sinh trùng. 2.2.2 Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm thủy sản Có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh. Có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản như: 2
- Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho thủy sản. - Kháng sinh cho vào nước để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh. - Kháng sinh cho thêm vào thức ăn thuỷ sản để bảo quản lâu hư. - Kháng sinh dùng trong thuốc thúy y thủy sản để chữa bệnh hoặc cho vào các sản phẩm thủy sản để kéo dài thời gian bảo quản . Tất cả những nguyên nhân trên làm cho sản phẩm thủy sản tồn dư kháng sinh, có ảnh hưởng không tốt đối với người tiêu thụ. Bất cứ kháng sinh nào dùng để chữa bệnh cho người và động vật, nếu còn tồn dư một lượng dù nhỏ nhất cũng có thể gây kháng thuốc. (Dựa theo nguồn tin Báo Nông nghiệp 12 – 10 – 2006) 2.2.3 Ảnh hưởng bất lợi của thuốc kháng sinh lên con người, vật nuôi và môi trường - Tạo ra dòng vi khuẩn kháng thuốc - Tiết enzyme phân hủy thuốc - Giảm hấp thụ kháng sinh - Thay đổi điểm tác dụng - Đổi qui trình tổng hợp - Sản xuất chất cạnh tranh với kháng sinh - Đề kháng chéo - Kháng chai lì - Rối loạn tạp khuẩn ruột - Độc tính cao - Tác dụng ngoài ý, dị ứng. 2.3 Quyết định của Bộ Thủy Sản về việc ban hành danh mục các hóa chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản Điều 1: Ban hành kèm theo Quyết định này: Danh mục hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản nêu tại Phụ lục 1 và Danh mục hoá chất, kháng sinh hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản nhằm khống chế dư lượng trong sản phẩm thuỷ sản thấp hơn giới hạn tối đa cho phép nêu tại Phụ lục 2. Điều 2: Không cho phép trộn lẫn quá 02 loại chất kháng sinh trong 01 sản phẩm thuốc, hoá chất; không cho phép trộn lẫn các hoạt chất cùng nhóm Fluoroquinolone với nhau. Trong trường hợp một sản phẩm có chứa 02 loại hoạt 3
chất kháng sinh, cơ sở sản xuất phải có đủ bằng chứng khoa học và thực tiễn để đảm bảo trộn lẫn không làm giảm tính năng tác dụng của tứng loại và không phát sinh tác dụng xấu đối với động vật nuôi và môi trường. Mọi sản phẩm thức ăn, hoá chất tẩy rửa khử trùng, hoá chất tẩy rửa ao đầm nuôi, thuốc thú y, hoá chất bảo quản thủy sản phải ghi nhãn theo Quyết định số 178/1999/QĐ-TTg ngày 308/1999 của Thủ tướng Chính phủ, Thông tư số 03/2000/TT-BTS ngày 22/9/2000 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản và kèm theo dòng chữ: “Không chứa các chất cấm sử dụng theo Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24 tháng 2 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản”. Điều 3: Quyết định này có hiệu lực thi hành sau mười lăm (15) ngày kể từ ngày đăng Công báo và thay thế Quyết định số 01/2002/QĐ-BTS ngày 22/1/2002 của Bộ Thủy sản về việc cấm sử dụng một số hoá chất, kháng sinh trong sản xuất, kinh doanh thủy sản và Danh mục thuốc thú y thủy sản hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ban hành kèm theo Quyết định số 17/2002/QĐ-BTS ngày 24/5/2002 của Bộ Thủy sản. Riêng đối với các chất có số thứ tự từ 12 đến 17 tại Phụ lục 1 có hiệu lực thi hành từ ngày 1/7/2005. Điều 4: Cục trưởng Cục Quản lý Chất lượng, an toàn vệ sinh và Thú y thủy sản chịu trách nhiệm tổ chức thực hiện và kiểm tra việc thực hiện Quyết định này. Chánh Văn phòng Bộ; Thủ trưởng các Cục, Vụ, Thanh tra Bộ; Giám đốc Trung tâm Khuyến ngư Quốc gia và Thủ trưởng các đơn vị sự nghiệp trực thuộc Bộ; Giám đốc các Sở thủy sản, Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn có quản lý Nhà nước về thủy sản; và các cá nhân, tổ chức sản xuất, kinh doanh, nhập khẩu, sử dụng thức ăn, thuốc thú y, hoá chất, chế phẩm sinh học, vi sinh vật dùng trong hoạt động thủy sản chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này. 2.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ký Phương pháp sắc ký được xác định như là một qui trình, theo qui trình này chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển khác nhau về động lực học cúa các chất này trong một hệ thống hai hay nhiều pha. Một trong các pha đó chuyển động theo hướng nhất định và trong pha này các chất riêng biệt thể hiện độ linh động khác nhau là do sự khác nhau về: sự phân bố, sự hấp thụ, điện tích, kích thước phân tử, độ hòa tan, áp suất hơi. Các chất riêng biệt được tách ra có thể xác định bằng các phương pháp phân tích. Kỹ thuật chung của sắc kí đòi hỏi chất tan phải được phân bố giữa hai pha: - Một pha là cố định gọi là pha tĩnh 4
- Một pha chuyển dịch được gọi là pha động 2.4.1 Giới thiệu về sắc kí khí Sắc kí khí là phương pháp tách những chất bay hơi (hay được làm cho bay hơi) qua một cột. Những chất này được dẫn đi bằng một khí trơ gọi là khí mang. « Cơ chế sắc kí khí có thể là: Sắc kí phân bố giữa pha tĩnh và khí mang Sắc kí hấp phụ trên pha tĩnh Việc lựa chọn kiểu cột tách sẽ phụ thuộc vào các đặc tính lý hóa của chất phân tích và sự khác biệt về áp suất hóa hơi (P) « Các bộ phận cơ bản của hệ thống sắc kí khí - Lò nung - Nguồn mang khí - Buồng tiêm mẫu - Bộ phận phát hiện hay đầu dò (detector) · Đầu dò dẫn nhiệt · Đầu dò ion hóa ngọn lửa · Đầu dò nhiệt ion hóa · Đầu dò cộng kết điện tử - Bộ nhận ghi tính hiệu - Cột sắc kí « Nguyên lí hoạt động Phương pháp sắc kí khí dùng nhiệt để tách chất nên dùng để tách những chất dễ bay hơi và bền nhiệt. Đầu tiên mẫu được bơm vào thiết bị tiếp nhận mẫu. Có hai chế độ tiêm mẫu và không tiêm mẫu. Khi cần tiêm mẫu bật sang chế độ tiêm mẫu để định lượng chính xác thể tích mà chúng ta cần phân tích sau đó chuyển sang chế độ không tiêm mẫu, phần dư sẽ tự động cho ra ngoài. Thiết bị tiêm mẫu có hệ thống gia nhiệt nên mẫu bị bay hơi tức khắc và được đẩy vào cột khí bằng khí mang. Trong cột sắc kí xảy ra quá trình tách chất. Mỗi chất đi qua cột với thời gian lưu nhất định. Các chất trong cột được tách ra do ái lực của nó với chất áo trên cột. Ái lực của chất với cột mạnh thì nó sẽ bị giữ lại trong cột lâu, thời gian lưu dài, chất có ái lực với cột nhỏ sẽ được khí mang ra khỏi cột trước, thời gian lưu nhỏ. Trong cột sắc kí, các chất tách ra phụ thuộc rất nhiều vào quá trình thay đổi nhiệt độ (lập trình nhiệt). Nếu lập trình nhiệt không hợp lý các peak sẽ rất gần nhau rất khó đọc. 5
Các chất tách ra từ cột lần lượt được đưa đến đầu dò gọi là Detector là một máy biến năng chuyển bứa xạ điện tử thành tín hiệu điện. Dòng tín hiệu từ đầu dò đi ra được khuếch đại đưa vào hệ thống ghi nhận kết quả và hiển thị trên màng hình máy vi tính. 2.4.2 Sắc kí lỏng cao áp_ hệ thống HPLC 2.4.2.1 Sơ lược về hệ thống máy – nguyên tắc, cấu tạo của hệ thống máy Để thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC, chúng ta phải có hệ thống trang bị về kỹ thuật này. Hệ thống trang bị của HPLC đơn giản và đủ để làm việc được theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau đây: Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống máy HPLC. (1)- Bình chứa dung môi động; (2)- Bơm cao áp; (3)- Bộ phận tiêm mẫu; (4)-Cột HPLC; (5)- Detector; (6)- Máy ghi nhận tín hiệu a) Bình đựng dung môi và hệ thống xử lý dung môi Trong trường hợp rửa giải thường (isocratic) chỉ cần một bình dung môi. Trong trường hợp rửa giải gradient: thường dùng 2, 3, 4…bình dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp các dung môi trên được trộn trong quá trình sắc ký với tỷ lệ biến đổi theo chương trình đã định và có bộ phận đuổi khí dung môi trước khi vào cột b) Bơm cao áp 6
Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar), để tạo ra những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc ký nằm trong vùng 0.5 – 3 ml/phút. c) Bộ phận bơm mẫu Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích 20, 50 hay 100ml. Van 6 chiều chỉ có một vòng mẫu nhưng đối với van 10 chiều thì có tới 3 vòng mẫu. d) Cột HPLC Là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc ký, nó là một yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tùy thuộc vào mức độ sắc ký. Nói chung, các cột tách phân tích thường có kích thước chiều dài từ 10 – 25 cm; đường kính trong từ 2 – 5 mm. e) Trang bị phát hiện chất phân tích (detector) Đây thường là các Detector dựa theo các tính chất của chất phân tích, ví dụ: - Detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV–VIS. - Detector phổ nguyên tử AES hay AAS. - Detector phổ huỳnh quang . - Detector điện hóa (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng). - Detector chiết suất. - Detector đo độ dẫn nhiệt… - Detector diode phát quang và diode mảng. - Detector đo khối lượng (khối phổ: MS). Tất nhiên, phải tùy theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như đo định lượng chúng. f) Trang bị chỉ thị kết quả Ở đây có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là các máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng các peak của các chất, rồi đến bộ tích phân kế (Intergrator), sau đó máy tính và máy in kèm theo để xử lý kết quả và in kết quả. Đó là 6 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống HPLC. Ngày nay, hệ thống HPLC còn có thêm bộ chương trình gradient dung môi (pha 7
động), bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu, bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc ký, máy tính và các phần mềm điều khiển toàn bộ hệ thống để xử lý kết quả tách, in kết quả tách…. 2.4.2.2 Pha động và pha tĩnh trong HPLC a) Pha tĩnh trong HPLC Pha tĩnh (Stationary phase) trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC) chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3 – 10 mm, diện tích bề mặt riêng thường từ 50 –500 m2/g. Pha tĩnh, ta chia nó ra làm nhiều loại như: pha tĩnh loại hấp phụ, phân bố, trao đổi ion. Pha tĩnh trong HPLC cũng phải thỏa mãn những điều kiện cơ bản sau đây: - Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có các phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích, đảm bảo cơ chế của sự tách theo đúng bản chất chính của pha tĩnh, không mất chất phân tích cần tách. - Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất định. - Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt có đặc trưng độ xốp của nó và không bị thay đổi hay biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rã dưới áp suất cao của quá trình tách sắc ký. - Cân bằng động của quá trình tách sắc ký phải xảy ra nhanh và lập lại tốt. Có như thế mới đảm bảo thu được kết quả tách tốt. - Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất, nghĩa là đường kính của các hạt lớn nhất so với các hạt nhỏ nhất không chênh lệch nhau quá 10%, và trên 85% số hạt phải nằm trong vùng kích thước trung bình. Có như thế cột tách mới có hiệu lực cao. Đó là các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật tách HPLC . b) Pha động trong kỹ thuật HPLC Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký. Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ đơn, như methanol, acetonitrile, benzene, n-hexane, nước hay cũng có thể là hỗn hợp của 2 hoặc 3 dung môi được trộn với nhau theo những tỷ lệ phù hợp. Ví dụ hỗn hợp của methanol với nước (MeOH + H2O) trong tỷ lệ 70/30 (V/V), acetonitrile với nước (CH3CN + H2O) trong tỷ lệ 80/20 (V/V),…Nó cũng có thể là dung môi nước có chứa các chất đệm pH, chất tạo 8
phức, chất làm chậm,…với nồng độ nhất định. Nói chung, với mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi (pha động: MP) rửa giải riêng phù hợp với nó, để có thể thu được hiệu quả tách tốt nhất. Trong kỹ thuật HPLC pha động cần phải thỏa mãn một số điều kiện sau đây: - Pha động phải trơ đối với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất kỳ một tính chất nào trong quá trình sắc ký. Không có sự tương tác phụ với pha tĩnh để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp cho quá trình tách. - Pha động phải hòa tan được chất mẫu. Có như thế mới làm cho chất mẫu được vận chuyển tốt từ đầu cột tách (lúc nạp mẫu vào) đến cuối cột tách (lúc chất mẫu ra khỏi cột tách), khi thực hiện quá trình rửa giải (sắc ký). - Pha động phải bền vững theo thời gian, có thành phần khống chế được trong quá trình sắc ký. Nghĩa là nó không bị phân hủy hay thay đổi không theo ý muốn khi chạy sắc ký. - Pha động phải có độ tinh khiết cao, để đảm bảo không bị nhiễm bẩn mẫu phân tích, gây sai số cho kết quả tách. Nghĩa là các chất để pha chế pha động phải có độ tinh khiết cao. Vì thế, người ta thường dùng các loại hóa chất có độ sạch ở mức độ mg (Chemicals for HPLC). - Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, tùy theo bản chất của từng loại sắc ký. - Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích, không làm hư hại đến flowcell của detector. Ví dụ: dùng loại detector UV hay UV-VIS thì pha động phải trong suốt trong các vùng phổ đó, dùng detector huỳnh quang thì pha động phải không có tính huỳnh quang… - Điều kiện cuối cùng là pha động đó phải có tính chất kinh tế, không hiếm, không quá đắt. Tất nhiên, yếu tố này trong sắc ký điều chế có ý nghĩa rất lớn, nhưng trong phân tích, không ít trường hợp ta phải chấp nhận pha động đắt tiền để đảm bảo kết quả phân tích chính xác theo yêu cầu đặt ra, đặc biệt là việc phân tích lượng vết bên cạnh một lượng lớn chất khác. Đó là các yêu cầu cần thiết đối với một hệ pha động trong kỹ thuật tách HPLC cho sự tách và phân tích một hỗn hợp mẫu nhất định. Tất nhiên, các điều kiện đó cần được xem xét cụ thể trong mỗi trường hợp của hỗn hợp mẫu phân tích, để xem có thể bỏ qua được yếu tố nào, từ đó chọn một pha động tốt nhất cho đối tượng nghiên cứu. 2.4.2.3 Một số yêu cầu đối với detector dùng trong kỹ thuật HPLC 9