Điều hướng trao đổi chất ở vi khuẩn Escherichia Coli phục vụ sinh tổng hợp một số Flavonoid Rhamnoside

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

17
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Flavonoid là cốc hợp chất trao đổi thứ cấp, đã được chứng minh có hoạt tính sinh học mạnh và phổ rộng như kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm, kháng ung thư, v.v. Đề tài nghiên cứu này trình bày phương phấp chuyển hóa sinh học nhằm tạo ra một số hợp chất flavonoid rhamnoside

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Điều hướng trao đổi chất ở vi khuẩn Escherichia Coli phục vụ sinh tổng hợp một số Flavonoid Rhamnoside

bảo quản (không xác định được vùng nhớt đàn hồi ờ nhiệt độ phòng và sự tái cấu trúc các phân tử Tween tuyến tính) (hình 5). Điều này được giải thích do quá 80 trong mạng gel hoặc cấu trúc mạng gel bị phá vỡ trình chuyển dạng thù hình của alcol béo íừ dạng a (hệ được bào chế từ cetyl alcoí) do quá trinh chuyển sang dạng P,Ỵ [2]. dạng thù hỉnh của aicol béo từ dạng a sang dạng P,Ỵ. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 1Hệ được bào chế từ cetosteàrỳí alcoi có độ nhói và * Dựa vào kểt quả nghiên cứu cùa đề tài, các thông độ đàn hồi cao nhất, có khả năng lưu giữ nước ở dạng sổttiích hợp cho phép đo lưu biến của hệ ba thành liên kết lởn nhát Do vậy, hệ nay có thề được nghiên phần iween 80 - aicoi béo - nước VỚ! iượng mẫu cứu tiếp tục để làm chất nền cho kem bôi ngoấỉ da thích hợp 1,4 ml đã được íựa chọn như sau: TÀÍLỈỆU THAM KHẢO - Đo lưu biến kiểu trượt liên tục: thời gian một chu kỳ 1. Barnes, H.A., J.F. Hutton, and Walters, K., (1989), đo là 300 s (tốc độ trượt trong khoảng 0,3 đến 100 s ). "An introduction to rheology", Elsevier Science Publishers, - Đo lưu biến kiểu dao động: thời gian cân bằng Amsterdam, 147-152. 500 s; khoảng đàn hồi tuyển tính ờ hai tần sổ 0,01 và 2. Eccleston, G.M., (1985), “Phase transition in ternary 10 Hz là 1 - 10Pa. Phép đo lưu biến kiểu dao động systems and in oil-in water emulsions containing cetrimide được thực hiện ở ứng suất dao động 5 Pa. and fatty alcohols”, International Journal of * Kểt quả khảo sát độ ổn định về mặt iưu biến của Pharmaceutics, 27, 311-323 hệ ba thành phần Tween 80 - alcol béo - nước được 3. Eccleston, G.M., (1997), "Functions of mixed emulsifiers and emulsifying waxes in dermatological bào chế từ các loại aỉcoi béo (cetyl, stearyí, lotions and creams", Colloids and Surfaces A: cetostearyl) cho thấy: Physicochemical and Engineering Aspects, 123-124, - Trong quá trình bảo quản, các hệ đều có chung 169-182. xu hướng thay đổi độ ổn định vật lý: tăng mạnh độ 4. Herh, p., et al (1998), "The rheology of nhớt trong vòng 2 tuần đầu và ít thay đổi trong các pharmaceutical and cosmetic semisolids", American tuần tiếp theo (hệ được bào chế từ cetostearyl và laboratory, 30(15), 12-14. stearyl alcol) do quá trình hydraí hóa chuỗi polyoxyethylene írong phân tử Tween 80 diễn ra chậm ĐIỀU HƯỚNG TRAO ĐỒI CHÁTỞVI KHUẲN ESCHERICHIA COLI PHỤC VỤ SINH TỔNG HỢP MỘT SỐ FLAVONOID RHAMNOSIDE Tác già: Lê Thị Như Hoa - Sinh viên K/)oa Dược, Đại học Duy Tân Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Huy Thuần -Trung tâm Sirih hộc Phan tử, Đại học Duy Tân, K7/25 Quang Trung, Hải Châu, Đà Nang TÓM TẤT Đặt vẩn đề: Flavonoid là cốc hợp chất trao đổi thứ cấp, đã được chứng minh có hoạt tính sinh học mạnh và phổ rộng như khàng khuẩn, khàng virus, khàng viêm, kháng ung thư, v.v. Hiện nay, do sự phát triển mạnh của các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử, các nhà nghiên cứu có thể ứng dụng chúng trong việc sinh tổng hợp các hợp chất này trong điều kiện thí nghiệm và quy mô pilot. Ưu điềm của phừơng pháp tồng hợp sinh học so với tách chiết truyền thống và tổng hợp hóa học là có tính định hướng cao, ít tạp chất do đó de tinh sạch, không sử dụng kim loại nặng có thể gây ô nhiễm môi trường và dễ dàng gia tăng quy mô. Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu này trình bày phương phấp chuyển hóa sinh học nhằm tạo ra một số hợp chất flavonoid rhamnoside. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hai hợp chất được sừ dụng làm cơ chất là rhamnetin và taxifolin. Phương pháp được sử dụng là chuyển hóa sinh học dựa trên việc chủng vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp di trụyền trong điều kiện nuôi cấy thích hợp. Sàn phẩm sau đó được tách chiết VỚI dung môi hữu cơ và định tính, định lượng nhờ sử dụng các phương pháp sắc kỷ như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký lỏng ghép khối phố (LC-MS). Kết quả: Đã thu được sản phẩm là taxifolin-3-O-rhamnoside và rỉiamnetin-3-O-rhamnoside Kết luận: Chúng tôi đã tồng hợp thành công hai hợp chất fiavonoid rhamnosíde trong phòng thí nghiệm bằng phương phốp chuyển hóa sinh học sử dụng vi khuẩn E. coli tối tổ hợp. Từ khoá: Sinh tổng hợp, Escherichia coli, sắc ký, flavonoid rhamnosides. SUMMARY Metabolic engineering for production of flavonoid rhamnoside in recombinant Escherichia coli Author: Le Thi Nhu Hoa (Department of Pharmacy, Institute of Pharma, Medicine and Biotech, Duy Tan University). Supervisor: Nguyen Huy Thuan, Ph.D. (Center for Molecular Biology, Institute of Research and Development, DuyTan University, K7/25 Quang Trung street, Haichau, Danang) Background: Flavonoids are phenolic secondary metabolites which demonstrated as potent biological activities including anti-bacterial, anti-virus, anti-inflammatory and anti-cancer agents, etc. Nowadays, based on the advanced development o f molecular biology techniques and methods these chemicals can be synthesized in -5 9 0 -
lab and pilot scale as well. Biological synthesis have several advantages rather than traditional extraction and chemical synthesis including high regiospecific, low by-products, facilitating to purification o f desired compounds 3nd ease to sca/e up the reaction. This ressarch described the production o f soveral fldvonoid rhamnoside Lisina bio-transformation method. Materials and Methods: Taxifolin and rhamnetin were used as substrates. E. coli ~ based bio-transformation method were used to convert these substrates to corresponded products under the suitable conditions. The formation o f products are analyzed and confirmed by chromatographical methods such as thin layer chromatography, high pressure liquid chromatography and liquid chromatography mass Results: Two products are obtained including taxifolin-3-O-rhamnoside and rhamnetin-3-O-rhamnoside Conclusion: We have successfully synthesize o f several flavonoid rhamnoside by bio-transformation methods using recombinant E. coil. Keywords: Biosynthesis, Escherichia coli, flavonoid rhamnoside, chromatography ĐẬT VÁN Đè VÀ MỤC TIÊU 2. Thiết kế và tạo vi khuần tái tổ hợp ^ Flavonoid ià nhóm hợp chất thứ cấp cỏ mặt phổ Chủng E. coli BL21 (DE3) đã bị đột bien 2 gen ià pgi biến ờ ỉhực vật có mạch. Từ lâu chung đã'được và zwf nhằm tăng sinh tiền chất glucose-1-phosphate. nghiên cứu là các chất có hoạt tính khang khuấn, Sau đó chủng đột biến này được chuyển 2 vector chống oxy hoá và khối u rất mạnh. Trên phương diện (pCD-TGSDH mang kháng sinh streptomycin và pAC- trao đồi chất, flavonoid thường tòn tại dưới dạng EPKR mang kháng sinh Chloramphenicol) mang các đường hoá nhờ sự xúc tác của enzyme đặc hiệu gen tàng cữờng tổng hợp UDP-rhamnose và 1 vector (glycosyltransferase). Hợp chất flavonoid glycosides có tái ỉổ hợp mang gen phục vụ việc gắn phân ỉử đường tính bền vững, tỉnh tan và hoại tính sinh học mạnh hơn UDP-rhamnose vào cơ chất nhận là pETGT3 (mang phân íử mẹ flavonoid trong một số trường hợp. gen kháng kanamycin). Taxifolin-3-O-rhamnoside và rhamnetin-3-O- 3. Sơ đồ chuyền hóa rhamnoside là các chất ức chế peroxidase, chất hấp Quá trình chuyển hóa cơ chất taxifolin và thụ gốc tự do và kháng côn trùng nồi tiếng [1], Ngoai rhamnetin vào vi khuẩn E. coli tái tổ hợp được mô tả ra chúng còn có hiệu ưng bệnh ĩý thận tren bệnh tiểu như Hình 2. Cụ thể là vỉ khuẩn E. coli tái tổ hợp được đường íhực nghiệm in-vivo và in-vitro. Tuy nhỉển, tổng nuôi trong điều kiện đầy đủ chất đinh dưỡng, phát triển hợp hoá học và phương pháp tách chiết trực tiếp từ mật độ tốt và các protein tái tổ hợp được bieu hiện đầy ỉhực vật các hợp chấỉ nay là khó khăn và năng suất đủ. Sau đó, sẽ tiến hành bổ sung cơ chất với nổng độ thấp [2]. Hiện nay, do sự phát triển của các kỹ thuật cuối cùng là 100 ịjM . Enzyme giycosyitransferase tái tổ công^nghệ sinh học như phản ứng enzyme in-vitro, hợp đựợc sinh ra sẽ làm nhiệm vụ xúc tác cho phản chuyển hoá íế bào sinh tổng hợp fiavonoid đã trở nên ứnp gắn phân tử đường UDP-rhamnose vào vơi cơ dễ dàng [3]. Có một số ưu điểm của việc sử đụng kỹ chat nhận để tạo ra sản phẩm mong muốn. thuật cong nghệ sinh học như sản lượng chấỉ tông 4. Phương pháp tiến hành trong phòng thí hợp cao, chuan bị thí nghiệm đơn giản, dễ dàng gia nghiệm tặng quy mô phản ứng sình học [6]. Dựa trên các dan Vị khuẩn Escherichia coli BL21(DEZ)IApgiỉầzwf liệu xuấỉ bản trước đay, chúng iôi đã đặt ra mục tiêu (chủng M3G3) (Thuan và cs., 2013) đừợc sư dụng ỉàm sinh íổng hợp hai hợp chất flavonoid glycosides quan vậí chủ cho thí nghiệm chuyển hoá các hợp chất ỉrọng bao gồm taxifolin-3-O-rhamnoside vàrhamnetỉn- taxifolin và rhamnetĩn. Chuyển hoá. vi khuẩn Ẽ. coìi cải 3-O-rhamnoside bằng sử dụng vi khuẩn E. coli tái tổ biến di truyền được nuôi trong thề tích 3 ml/ môi hợp trong điều kiện thích hợp. trường LB có chứa kháng sinh là Kanamycin, ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu Chloramphenicol và streptomycin ở 37 độ c. Nuôi qua 1. Vật liệu nghiên cứu đêm. Tiếp theo 0.5 mL dịch nuôi được sử dụng để cấy Chùng vỉ khuẩn £ coli BL21(DE3)/Apg/7Azwf chuyển sang bình tam giác 250 mi- có chứa 50 mL (chùng M3G3) tái ỉổ hợp [4, 5] được sử dụng ỉam vật dịch môi trường LB. Tiếp tục nuôi cấy ở 37 độ c cho chủ. Các loại chất khang sinh bao gồm Ampỉciliin, đến khỉ OD íại 260 nm đạt 0.6, tiến hành bổ sung với Kanamỵcỉn và Chloramphenicol (Biobasics, Canada) IPTG 0.5 mM và hạ rihiệt độ xuống 27 độ c và nuôi được sử dụng với nồng độ cuối cùng trong dịch nuôi tiếp trong 3~5h đề tạo điều kiện cho các protein tái tổ giống vi khuẩn lần lượt là 100, 50 và 30 Mg/mL. Các cơ hợp biểu hiện. Tiếp theo, bổ xung taxifoiin hoặc chất bao gồm taxifolin và rhamnetin có hàm lượng > rhamnetin (đã hoà ían trong DMSO) với nồng độ cuối 90%. Các loại máy móc dùng khuấy mẫu, cô 'quay cùng là 100 ụM. Tách chiêt. Lấy 3 ml dịch chiết trộn đông khô, và chai lọ làm thí nghiệm v.v thuộc Trung với 6 mi ethyl acetate (v/v = 1:2). Lắc đều ở 2Ó0 tậm Sinh học Phân tử, Đại học Duy Tân. Các hóa chất rpm/2h. Thu dịch trên, ly tâm tốc độ 12000 rpm/10 tậch chiết như Ethylacetate, axit sunfuric, toluen, phút, lọc qua màng lọc sartorius có đường kính 0,25 dimeihylsulfoxide, v.v cỏ nguồn gổc từ Đài Loan, ụm. Kiểm tra bằng sắc ký. sắc ký bản mỏng TLC Indonesia hoặc Mỹ. Bản mỏng sắc ký (Merck, Đức) va được sử dụng để Kiểm tra ổịnh tính sự có mặí của sản máy phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC, Agiient, Mỹ). phẩm bằng cách sử dụng dung môi ỉà Mẫu được gửi đi phân tích sắc ký lỏng ghép khoi phổ EthyỊacete:Methanoi:Water:ToIuen (8:1:1:ồ.2). Kiểm (LC-MS/MS hoặc LC-TOF-MS) tại trường Đại học tra định tính. Sừ dụng hệ đung môi gồm: A: nước chứa Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN). 0.1% formic acid và B: acetoniỉriíe. Hệ chương trình -5 9 1 -
chạy HPLC gồm dung môi B: 10 % (0-5 min), 10-30 uv, % dung môi B lần lượt íà: 1.0 ml/min, 6, 280 nm % (5—15 min), 30-80 % (15-30 min), và 80-100 % và 40 %. (30-41 min). Tốc độ dòng, đường cong, bước sóng R H A M N E T IN - 3 - O - R H A M N O S I D E Hình 2. Cơ chất nhận được bổ sung vào dịch nuôi vi khuẩn nhằm thực hiện thí nghiệm đường hóa, ví dụ trong trường hợp sử dụng rhamnetin. KÉT QUẢ 1. Phân tích sắc ký bản mỏng TLC Dịch chiết sản phẩm được đem phân tích sắc ký íớp mỏng sử dụng hệ dung môi ià Ethyỉacete:Methanol:Water:Toiuen (8:1:1:0.2). Kết quả phân tích TLC của các dịch chiểt được chì ra trong hình 3A và 3B. Các điểm (pot) chì thị cơ chất rhamnetin và sản phẩm giycoside của nổ có giá trị Rf lần lượt là 0,75 và 0,35. Trong khi đó, giá trị Rf củataxiíolin và taxifolin rhamnóside là 0,82 và 0,25. ■ - K h a t im c ỉin ! T a x i f o li n ( R f -0 .8 2 ) i" ( R f -0 .7 5 ) điAHUiclin [tamtiovỉiEc 8 'ự ẩ . T n x ĩíb l ũ ) ( K i - 0 .3 5 ) f[i r b u m n o s iU e ( R f ** 0 , 2 5 ) 2 1 2 3 Hình 3. Sắc ký đồ phân tích vị trí cùa cơ chất rhamnetìn, taxifolin và sản phẩm tương ứng. Với mẫu taxifolin: Cột 1: Dịch chiết chùng E. coli tái tổ hợp không chuyển hóa cơ chất; cột 2: dịch chiết chủng E. coli tái tổ hợp có chuyển hóa cơ chất; cột 3: cơ chất chuẩn taxifolin. Với mẫu rhamentin: Cột 1: mẫu tách chiết, cột 2: mẫu chuẩn. 2. Phân tích sắc ký sắc ký lỏng cao áp, HPLC Dịch chiết các chất này sau đỏ được đení phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp. Kết quả phân tích HPLC thể hiện trong hình 4A và 4B, trong đó sản phầm rhamnetin rhamnoside và taxifolin rhamnoside lần lượt xuẳt hiện ờ phút thứ 13,4 và 19,2. Cơ chất -5 9 2 -
Cơ chấl ỉf Cơ châí (Rt~ 2].8) Sàn phầm ( R t 19,2)\ / Hình 4B. Phân tích định tính sự tạo thành sản phẩm taxifolin-3-O-rhamnoside 3. Phân tích sắc ký sắc ký lỏng ghép khối phổ Peạk cúa sản phâiiì (rham hetin-3-p-rhair noside) ■ [M -rham -CỈỈ3] [M -rham ] M2.5 3OÍÍ.0 30/.5 310.0 Hình 5A. Phân tích LC-MS/MS ở chế độ negative mode Dữ íiệu phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ hợp chất rhamnetin ở chế độ negative mode được chỉ ra trên hỉnh 5A. Rhamneỉin-3-O-rhamnoside có KLPT íà 461,05 sẽ bị khử gốc đường rhamnose (M=146,95) tạo ra phân mảnh có KLPT là: [M-rham]' =315,10 (phân mảnh lần 1, MS1). Tiếp theo phan mảnh này bị loại bò gốc methyl (- CH3) để tạo ra phân mảnh có KLPT là. [M-rham-CH3Ị' = 299.10 (phân mảnh lần 2, MS2). 1: T O F M S E S + 100 - 1,84e6 K L P T Cỉía (axifoiin-3-O-rhamnoside (.451.1215 ) K L P T cùa cơ chắt C(’3p5~0623 318.0765 168.0758 x 390.2445 167.0439 387.2407- ị Ị 118.0749 197.1378 .463.1261 O-rỊ ' • ( . 1 I.ìt .. m/z 50 100 150 200 ' " 250' ’ ’ '300 350 400 450 500 Hình 5B. Phân tích LC-TOF-ESI-MS hợp chất iaxifolin-3-O-rhamnoside ở chế độ positive mode - 593 -
Trong khi đó dữ íiệu phân tích taxifolin đã cho tháy glycoside theo dự kiến ban đầu. rõ ràng khối lượng phân tử của taxifolin-3-O- - Cần tiếp tục tiến hành tổi ưu hóa điều kiện nuôi rhamnoside và cơ chất taxifoiin cùa nó ở chể độ cấy (thành phần môi trường, pH, nhiệt độ, oxy hòa ían, positive mode là: 451.1215 và 305.0632. v.v) nhằm tang sinh năng suất của sản phẩm tạo thành. Như vậy,,dựa trên các kểt quả phân tích sắc ký TÀI LIỆU THAM KHẢO bản mỏng TLC, sắc ký lỏng (HPLC) và sắc ký ỉỏng 1. Petacci F, Freitas ss, Bruneíti IL, Khalil NM ghép khối phổ (LC-MS/MS), chủng tôi đã xác nhận sự (2010), Biological Research, 43(1):63-74. tồng hợp các hợp chất glycoside bằng phương pháp 2. Kim HS, BG Kim, s Sung, M Kim, H Mok, Y chuyển hóa sinh học. Chong, JH Ahn (2013), Pianta, 238(4):683-693. doi: KẾT LUẬN VA KIẾN NGHỊ 1 0 .1 0 0 7 /S 0 0 4 2 5 -0 13 -1 9 2 2 -0 . - Đã tiến hành các thí nghiệm chuyển hóa sử 3. Ko JA, YB Ryu, TS Park, HJ Jeong, JH Kim, SJ dụng vi khuần cải biến di truyền Escherichia coli Park, JS Kim, D Kim, YM Kim, w s Lee (2013), Journal of BL21(DE3)/Apgi/Azwf với 2 cơ chất là taxifolin và Microbiology and Biotechnology, 22(9):1224-1229. rhamnetin. 4. Pandey RP, s Ma!la, D Simkhada, BG Kim, JK Sohng (2012), Applied Microbiology and Bioiechnoly, - Đã kiểm tra sự íạo thành các sản phẩm là 97(5):1889-1901. taxifolin-3-O-rhamnoside và rhamnetin-3-O- 5. Thuan NH, RP Pandey, TTT Thuy, JW Park, JK rhamnoside bằng các kỹ thuật sắc ký bản mỏng (TLC), Sohng (2013a), Applied Biotechnology and Biochemistry, sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sẳc ký lỏng ghép khối 171(8):1956-1967. phổ (LC-MS/MS va LC-TOF-MS). 6. Thuan NH, Park JW, JK Sohng (2013b), Journal - Kết quả cho thấy vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng of process biochemistry, 48(11):1744-1748. chuyển hóa cơ chat flavonoid thành sản phẩm PHÂN LẬP FLAVONOID VÀ IRIDOID MỚI TỪ CÂY NỮ LANG VALERIANA HARDWICKII WALL. VALERI DS Lê Thị Thu Hồng " Khoa Dược- ĐH Lạc Hồng H ướng dẫn: Th.s Huỳnh LỜI - Khoa Dược- Đh Y Dược TP HCM ĐẶT VÁN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU Chiết xu ấ ỉ và phân lập Chi Valeriana L. thuộc họ Valerianaceae, là một chi Nguyên liệu (7 kg) được ngấm kiệt với ethanol khá lớn, gồm hơn 200 loài, phân bố chủ yếu ở Châu 96%, loại dung môi thu được dịch chiểt nước, lần lượt Á, châu Au, châu Mỹ. Một số loài trong chi valeriana lắc phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng đã và đang được sử dụng có tác dụng an thần, giảm lo dần, loại dung môi thu được các cao petroleum ether lâu, chữa mất ngủ, đau dạ dày, động kinh [1], [3]. ở (32,88 g), ethyl aceíat (70,64 g), butanol (38,73 g). Cao Việt Nam có hai loài gồm V. hardwickii Wall, được gọi butanol được tủa trong methanol, làm sạch tủa này thu là "Nữ lang"; và loài V. jatamansi Jones gọi là "Sì to", được V1 15 mg. Phần cao butanol sau đỏ được triển chúng đều được dùng làm thuốc íàm thuốc ờ một số khai qua sắc ký cột siiica gei với hệ dung môi rửa giải nơi. Loài V. jastamansi Jones (sì to) đã có nhiều ethyl acetat:methanol (100:0 -> 70:30) thu được 15 nghiên cứu được công bố : Đỗ Ngọc Thanh (1989), phân đoạn. Nguyễn DuỵThuần (2008)...còn loài V. hardwickiiV\laỉị Phân đoạn 6 được cô bớt dung môi, làm íạnh thu được kết tinh hình kirĩVmảu trâng xanh (KT6 830 mg). Kếí tinh KT6 chưa sạch được xử iỷ qua than hoạt, kểt tinh lại íhu tác dụng dược lý của loài V. hardwickii Wall., đề tài được chất V2, có khối lượng 730 mg, màu trắng. “Phân lập flavonoid và iridoỉd mới từ cây Nữ lang Phân đoạn 7 có tủa, tủa được làm sạch bằng cách Valeriana hardwickii wall." đã được thực hiện. tùa lại trong methano!. 30 mg tủa 7A đã được làm ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHẢP NGHIÊN cứ u sạch, có màu trắng. Đổi tượng nghiên cứu Phân đoạn 8, 10 thu được tủa, tủa được tiến hành Phần trên mặt đất cây Nữ lang Valeriana hardwickii triển khai qua sephadex. Ket quả các chất V3(11 mg), thu hái vào tháng 11/2011 ở cổng Trời, Đả Lạt. V4(30 mg), V5(P mg) đã được phân lập. Nguyên liệu được định danh bằng cách so sánh hình Xác định câu trúc íhái học với tài liệu chuyên ngành [1]. Các chất phân lập được kiểm tra độ tinh khiết bằng Phương pháp nghiên cứu sắc ký lớp mỏng, HPLC, xác định cấu írúc bằng MS Các phươnq pháp chiết xuất, phân lập đã được sử NMR. dụng: chiết ngấm kiệt bằng ethanol 96%, lắc phân bố V1: tủa màu trắng, có phổ ES+ của V1 có [M+Na]+ với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần, sẩc ký cột tín hiệu m/z 615, trên p h ỉ ES- có [M-H]- tín hiệu ,m/z silica gel, sắc ký rây phân tử, sắc ký lớp mỏng. Ngoài 591 , kết iuận sơ bộ phân tử khối của V1 íà 592. Ngoài ra còn có HPLC, MS, NMR,.. được sư đụng đề xác ra phổ ES- còn có đĩnh m/z 283, phần agiycon của V1 định cấu trúc các chất. là 284. M=592=[284+162+146]. Vậy sơ bộ kếí luận V1 Kết quả và bàn luận ià iinarin