Điều kiện thích hợp nuôi cấy chủng Bacillus subtilis CB15 sinh protease trên môi trường dịch ép đầu tôm

Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 1/2011<br /> <br /> THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br /> <br /> ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP NUÔI CẤY CHỦNG BACILLUS SUBTILIS CB15<br /> SINH PROTEASE TRÊN MÔI TRƯỜNG DỊCH ÉP ĐẦU TÔM<br /> CONDITION SUITABLE FOR PROTEASE PRODUCTION OF<br /> BACILLUS SUBTILIS CB15 STRAIN ON MEDIUM FROM SHRIMP WASTE<br /> Nguyễn Minh Trí<br /> Khoa Chế biến, Trường Đại học Nha Trang<br /> TÓM TẮT:<br /> Bacillus subtilis, là loài vi khuẩn an toàn cho sử dụng cho người và động vật, có thể sinh protease trên<br /> môi trường từ dịch ép đầu tôm rẻ tiền.<br /> Kết quả thực nghiệm cho thấy đối với chủng sinh protease B. subtilis CB15, điều kiện nuôi cấy thích<br /> hợp sinh protease: môi trường chứa 40% dịch ép đầu tôm (pH 7), nhiệt độ phòng (28 - 300C), lắc 130 vòng/<br /> phút, nuôi cấy trong 72h, hoạt độ protease đạt trên 1 AU/ml dịch nuôi cấy. Enzyme thu được có hoạt tính cao<br /> nhất ở 50°C, pH 8.<br /> Từ khoá: Protease, Bacillus subtilis, dịch ép đầu tôm.<br /> ABSTRACT:<br /> Bacillus subtilis, a safe microorganism for human and animal, can produce protease on the medium<br /> prepared from the inexpensive ‘pressing out’ of shrimp waste.<br /> The experiment results showed that for the chosen protease-producing strain, B. subtilis CB15, the<br /> optimal cultural conditions for producing protease were: medium with 40% of the ‘pressing out’ of shrimp<br /> waste (pH of 7); room temperature (28 - 300C), agitation speed at 130 rpm, during 72 hours, protease activity<br /> of the culture was over 1 AU/ml. The optimal pH and temperature of the protease from B. subtilis CB15 were<br /> found to be at 8 and 50°C, respectively.<br /> Keywords: Protease, Bacillus subtilis, shrimp waste.<br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> con người [9, 11, 13]. Chúng ta có thể thu nhận<br /> <br /> Công nghệ enzyme là một phần không thể<br /> <br /> protease từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó<br /> <br /> thiếu được của công nghệ thực phẩm. Trong<br /> <br /> người ta chú ý đến việc thu nhận protease từ<br /> <br /> giai đoạn đầu, việc sử dụng enzyme trong công<br /> <br /> vi sinh vật. Sự phát triển của các enzyme công<br /> <br /> nghiệp thực phẩm hạn chế như việc sản xuất<br /> <br /> nghiệp phụ thuộc vào việc sử dụng các nguồn<br /> <br /> các thực phẩm lên men dựa vào tác động của<br /> <br /> vi sinh vật. Các vi sinh vật có ích do sử dụng<br /> <br /> các protease nội sinh dưới các điều kiện thích<br /> <br /> sản xuất hiệu quả kinh tế hơn nhờ môi trường<br /> <br /> hợp [19]. Ngày nay, các phương pháp enzyme<br /> <br /> lên men rẻ tiền, thời gian lên men ngắn [3, 4,<br /> <br /> có vai trò quan trọng trong quy trình sản xuất<br /> <br /> 8, 12, 15, 16]. Trong các vi sinh vật B. subtilis<br /> <br /> của công nghệ thực phẩm hiện đại để sản xuất<br /> <br /> là vi sinh vật được sử dụng rộng rãi cho người<br /> <br /> lượng lớn các sản phẩm khác nhau dùng cho<br /> <br /> động vật cũng như trong xử lý môi trường, cho<br /> TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 77<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 1/2011<br /> <br /> thấy đây là vi sinh vật an toàn cho việc sản xuất<br /> <br /> từ các nguồn khác nhau được phân lập và sơ<br /> <br /> cũng như dùng trong công nghiệp thực phẩm<br /> <br /> bộ định danh lại dựa theo phương pháp được<br /> <br /> [10, 15].<br /> <br /> mô tả trong cuốn ‘Sổ tay phân loại vi khuẩn của<br /> <br /> Để giảm chi phí trong việc sản xuất, người<br /> <br /> Bergey’ [18]. Khả năng sinh protease được kiểm<br /> <br /> ta thường nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme trên<br /> <br /> tra, tuyển chọn các chủng tạo vòng ly giải protein<br /> <br /> các môi trường thu được từ các phế liệu. Phế<br /> <br /> rõ, lớn (Hình 1). Chủng đem thí nghiệm được<br /> <br /> liệu đầu tôm được sử dụng để sản xuất chitin.<br /> <br /> đánh số theo thứ tự các chủng phân lập được.<br /> <br /> Để giảm chi phí hóa chất sử dụng, cũng như<br /> <br /> Chủng B. subtilis CB15 cho thấy có khả năng<br /> <br /> gánh nặng cho việc xử lý môi trường, người ta<br /> <br /> sinh protease mạnh, được tuyển chọn nuôi cấy<br /> <br /> thêm công đoạn ép tách dịch đầu tôm trước khi<br /> <br /> thí nghiệm.<br /> <br /> đưa vào sản xuất chitin. Dịch ép đầu tôm có thể<br /> sử dụng làm thức ăn chăn nuôi hay tinh sạch<br /> thành nguồn đạm bổ sung vào các quá trình sản<br /> xuất sản phẩm như nước mắm hay thức ăn gia<br /> súc [5]. Việc tạo sản phẩm từ nuôi cấy vi sinh<br /> vật trên môi trường phế liệu nhằm tạo ra một<br /> hướng sử dụng phế liệu là việc làm cần thiết.<br /> Sử dụng dịch ép đầu tôm để nuôi cấy sản xuất<br /> protease chưa được quan tâm nghiên cứu, do<br /> vậy chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh<br /> protease của vi khuẩn Bacillus subtilis CB15 và<br /> xác định một số tính chất đặc trưng của protease<br /> thu được.<br /> <br /> 2.2. Môi trường giữ giống vi khuẩn, nhân<br /> giống vi khuẩn và sản xuất<br /> Chủng vi khuẩn này được duy trì trên ống<br /> thạch nghiêng TSA (1,5% trypticase peptone,<br /> 0,5% phytone peptones, 0,5% NaCl, 1,5% agar)<br /> Vi khuẩn nhân lên trong môi trường TSB,<br /> trong vòng 24 giờ. Sau đó đem cấy vào môi<br /> trường sản xuất, tỷ lệ 10% (v/v) so với thể tích<br /> môi trường nuôi cấy.<br /> Môi trường sản xuất được chuẩn bị từ dịch<br /> ép đầu tôm. Đầu tôm thẻ lấy từ xí nghiệp chế<br /> biến thủy sản, được giữ đông -20°C để sử dụng<br /> dần. Dịch ép được lọc qua vải để loại cặn lớn,<br /> <br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN<br /> <br /> đem đi chuẩn bị môi trường, tiệt trùng 121°C/15<br /> <br /> CỨU<br /> <br /> phút.<br /> <br /> 2.1. Chủng vi khuẩn<br /> <br /> 2.3. Xác định hoạt tính protease<br /> <br /> Các chủng Bacillus subtilis được thu thập<br /> <br /> Hoạt tính của protease được xác định theo<br /> phương pháp Anson cải tiến. Đơn vị hoạt tính<br /> của enzyme (AU) được xác định theo lượng<br /> enzyme cần để thuỷ phân casein tạo sản phẩm<br /> tương đương 1mmol tyrosine trong thời gian 1<br /> phút. [1, 17]<br /> 2.4. Xử lý thống kê<br /> Số liệu trong báo cáo là trung bình cộng của<br /> 3 lần phân tích với khoảng tin cậy (95%). Kết<br /> quả được phân tích thống kê và vẽ đồ thị bằng<br /> <br /> Hình 1. Vòng ly giải protein sau 48 giờ<br /> nuôi cấy trên môi trường chứa 1% casein<br /> <br /> 78 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br /> phần mềm Microsoft Excel. Giá trị của p < 0,05<br /> được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 1/2011<br /> <br /> III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy B. subtilis CB15 sinh protease từ môi trường dịch ép<br /> đầu tôm<br /> a. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch ép đầu tôm đến khả năng sinh protease của chủng B. subtilis CB15<br /> Môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh protease của vi khuẩn, cũng như tốc độ lắc<br /> trong khi nuôi cấy. Dịch ép đầu tôm chứa nhiều đạm (0,9%) [5], do vậy có thể sử dụng để nuôi cấy<br /> vi khuẩn. Chọn mức độ lắc 100 vòng/phút, khảo sát hoạt độ protease thu được trong dịch nuôi cấy<br /> theo tỷ lệ dịch ép đầu tôm và theo thời gian, kết quả như sau:<br /> <br /> Hình 2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch ép đầu tôm và thời gian đến hoạt độ protease<br /> trong môi trường nuôi cấy<br /> <br /> Qua Hình 2 kết quả tốt nhất ở tỷ lệ dịch ép đầu tôm dùng để pha môi trường là 40%. Tỷ lệ dịch<br /> đầu tôm cao hơn 50% cũng không có lợi cho việc sinh protease. Thời gian thu nhận protein tốt nhất<br /> vào 72 giờ, kéo dài thời gian nuôi cấy không tăng lượng enzyme thu nhận được.<br /> b. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh protease của chủng vi khuẩn B. subtilis CB15.<br /> B. subtilis là vi khuẩn hiếu khí, việc cung cấp oxy là quan trọng cho quá trình nuôi cấy. Trong<br /> nuôi cấy vi sinh tại phòng thí nghiệm cách thường sử dụng là dùng máy lắc. Tiến hành thí nghiệm ở<br /> các tốc độ lắc khác nhau (100-130-160 vòng/phút), khảo sát hoạt độ protease trong môi trường nuôi<br /> cấy theo thời gian (môi trường nuôi cấy chứa dịch ép đầu tôm 40%). Kết quả thu được trình bày trên<br /> Bảng 1, minh họa trên Hình 3.<br /> Bảng 1: Ảnh hưởng của tốc độ lắc và thời gian đến hoạt độ protease (AU/ml)<br /> trong môi trường nuôi cấy.<br /> Thời gian nuôi cấy (phút)<br /> <br /> Tốc độ lắc<br /> (vòng/phút)<br /> <br /> 48<br /> <br /> 60<br /> <br /> 72<br /> <br /> 84<br /> <br /> 0 (không lắc)<br /> 100<br /> 130<br /> 160<br /> <br /> 0,19<br /> 0,25<br /> 0,21<br /> <br /> 0,05<br /> 0,6<br /> 0,7<br /> 0,56<br /> <br /> 0,12<br /> 0,95<br /> 1,22<br /> 1,24<br /> <br /> 0,65<br /> 0,9<br /> 0,88<br /> <br /> TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 79<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 1/2011<br /> <br /> Hình 3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc và thời gian đến hoạt độ protease<br /> trong môi trường nuôi cấy.<br /> <br /> Qua Bảng 1, Hình 3, rõ ràng tốc độ lắc có ảnh hưởng đến protease sinh ra, khi không lắc, lượng<br /> protease sinh ra thấp. Tốc độ lắc từ 130 vòng/ phút trở lên cho kết quả tốt hơn so với tốc độ lắc thấp<br /> 100 vòng/ phút, do điều kiện phòng thí nghiệm để an toàn cho thiết bị, tốc độ lắc được chọn là 130<br /> vòng/ phút.<br /> Về thời gian sinh protease trong môi trường cao nhất sau nuôi cấy 72 giờ, trùng với kết quả thí<br /> nghiệm trên.<br /> c. Ảnh hưởng của casein bổ sung vào môi trường nuôi cấy:<br /> Trong nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh protease của Bacilius subtilis<br /> [6], tác giả nhận thấy casein ở nồng độ 0,5% cho canh cấy có hoạt độ cao nhất. Do vậy, để có thể<br /> tăng sản lượng protease thu được, casein được thêm vào môi trường nuôi cấy ở các tỷ lệ khác nhau<br /> (0,5 %, 1% và 1,5%). Kết quả thu được trình bày trong biểu đồ ở Hình 4.<br /> <br /> Hình 4. Ảnh hưởng của casein bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến Protease thu được trong môi trường nuôi cấy<br /> <br /> Qua biểu đồ thu được ở hình 4, rõ ràng casein bổ sung vào không có tác động tốt đến lượng<br /> protease sinh ra. Điều này có thể giải thích là do hàm lượng protein chứa trong 40% dịch ép đầu<br /> <br /> 80 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 1/2011<br /> <br /> tôm đã chọn ở thí nghiệm trên, đã cung cấp đủ<br /> <br /> ép đầu tôm thích hợp cho việc nuôi cấy chủng<br /> <br /> lượng protein cần thiết có việc sinh protease<br /> <br /> vi khuẩn B. subtilis CB5 sinh protease (trên 1<br /> <br /> của chủng vi khuẩn B. subtilis sử dụng. Việc bổ<br /> <br /> AU/ml) cao hơn nghiên cứu khác trên chủng<br /> <br /> sung thêm lượng protein có thể gây ức chế việc<br /> <br /> B.subtilis (0,56 AU /ml) [2]<br /> <br /> sinh protease. Điều này phù hợp với kết quả<br /> của thí nghiệm trình bày ở phần 3.1.a, khi sử<br /> dụng nồng độ dịch ép đầu tôm 50%, canh cấy có<br /> hoạt độ protease thấp hơn so với nồng độ dịch<br /> ép đầu tôm 40%. Điều này cũng phù hợp với<br /> nghiên cứu về sinh protease trên chủng Serratia<br /> [b], việc tăng nồng độ casein từ 1 - 3% tốc độ<br /> <br /> 3.2. Một số tính chất của enzyme thu được<br /> Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào<br /> nhiều yếu tố như nồng độ enzyme, bản chất và<br /> nồng độ cơ chất, nhiệt độ và pH của môi trường,<br /> các ion kim loại và các chất khác... Trong nghiên<br /> cứu này, chúng tôi tiến hành xác định pH và<br /> <br /> sinh trưởng và phát triển tăng nhưng sinh tổng<br /> <br /> nhiệt độ thích hợp enzyme thu được khi thủy<br /> <br /> hợp protease giảm dần.<br /> <br /> phân casein. Kết quả nghiên cứu được trình bày<br /> <br /> Qua kết quả trình bày trên cho thấy dịch<br /> <br /> trong Bảng 2.<br /> <br /> Bảng 2: Hoạt tính của enzyme đo được ở các điều kiện nhiệt độ, pH khác nhau<br /> pH<br /> <br /> Nhiệt độ<br /> (°C)<br /> <br /> 6,5<br /> <br /> 7,0<br /> <br /> 7,5<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8,5<br /> <br /> 40<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 0,19<br /> <br /> 0,23<br /> <br /> 0,31<br /> <br /> 0,24<br /> <br /> 50<br /> <br /> 0,5<br /> <br /> 0,7<br /> <br /> 1,08<br /> <br /> 1,22<br /> <br /> 0,92<br /> <br /> 60<br /> <br /> 0,4<br /> <br /> 0,45<br /> <br /> 0,65<br /> <br /> 0,67<br /> <br /> 0,59<br /> <br /> 70<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,21<br /> <br /> 0,33<br /> <br /> 0,33<br /> <br /> 0,27<br /> <br /> Xử lý thống kê Phân tích phương sai 2 yếu tố, kết quả như sau:<br /> FNĐ = 38,99 > F 0,05 = 3,49<br /> FpH = 6,07 < F 0,05 = 3,26<br /> Vậy trong khoảng khảo sát (nhiệt độ : 40 - 70°C, pH : 6,5 - 8,5) nhiệt độ và pH đều có ảnh hưởng<br /> đến hoạt độ của enzyme một cách có ý nghĩa.<br /> Minh hoạ số liệu trên biểu đồ ở Hình 5.<br /> <br /> Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến chế độ thủy phân của protease thu được.<br /> <br /> TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 81<br /> <br />