Định danh mẫu đậu đỏ địa phương thu tại tỉnh Hà Giang bằng phương pháp hình thái và mã vạch ITS

Nguyễn Thị Vân và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 187(11): 105 - 111<br /> <br /> ĐỊNH DANH MẪU ĐẬU ĐỎ ĐỊA PHƯƠNG THU TẠI TỈNH HÀ GIANG<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÌNH THÁI VÀ MÃ VẠCH ITS<br /> Nguyễn Thị Vân, Nguyễn Hữu Quân*<br /> Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đậu đỏ (Vigna angularis) được biết đến là loài cây cung cấp protein, tinh bột, khoáng và vitamin<br /> quan trọng. Đậu đỏ được thu tại tỉnh Hà Giang (ĐĐ10-HG) thuộc dạng thân bò, leo, trên thân có<br /> nhiều lông tơ nhám. Lá nhỏ, có 3 lá chét, hình tim. Hoa màu vàng, mọc thành chùm từ 6-10 hoa và<br /> tự nở ở nách. Vùng ITS của mẫu đậu đỏ Hà Giang phân lập được có kích thước 479 nucleotide.<br /> Kết quả phân tích đặc điểm hình thái và mã vạch ITS đã chứng minh được mẫu đậu đỏ thu tại tỉnh<br /> Hà Giang thuộc loài Vigna angularis. Hoạt tính α-amylase và protease trong mầm hạt đậu đỏ sau<br /> 3 ngày lần lượt đạt 1,2 và 1,4 U/mg. Hàm lượng isoflavone của mầm hạt đậu đỏ sau 3 ngày đạt<br /> 72,7 µg/g và hàm lượng protein tan tổng số đạt 30 mg/100 g hạt.<br /> Từ khóa: α-amylase, đậu đỏ, isoflavon, vùng ITS, protease<br /> <br /> MỞ ĐẦU*<br /> Đậu đỏ có tên khoa học là Vigna angularis,<br /> tên tiếng anh là Azuki bean và được gọi là<br /> đậu đỏ Azuki. Đậu đỏ được trồng ở hơn 30<br /> quốc gia trên thế giới, đặc biệt là Đông Á [7].<br /> Hạt của đậu đỏ là một nguồn cung cấp<br /> protein, tinh bột, khoáng và vitamin quan<br /> trọng [13]. Trong đậu đỏ, hàm lượng calo và<br /> chất béo thấp; protein và các chất có hoạt tính<br /> sinh học nhiều nên đậu đỏ được gọi là đậu<br /> giảm cân [7]. Đậu đỏ được sử dụng trong<br /> nhiều loại thực phẩm khác nhau như bánh, đồ<br /> tráng miệng, sữa và kem. Trong y học, đậu đỏ<br /> còn được coi như một loại thuốc truyền thống<br /> giúp lợi tiểu và giải độc gan, làm giảm bớt<br /> các triệu chứng thần kinh, tê phù [9].<br /> Ở Việt Nam, đậu đỏ phân bố ở một số tỉnh Hà<br /> Giang, Lào Cai, Lai Châu, Thừa Thiên Huế<br /> và phát triển mạnh ở điều kiện nhiệt độ từ 1530°C. Các giống đậu đỏ này thường chưa<br /> được nghiên cứu nhiều về đặc điểm hình thái,<br /> giải phẫu, hóa sinh và di truyền.<br /> Trong thực tế, việc định danh chính xác các<br /> mẫu đậu đỏ bằng phương pháp hình thái chưa<br /> đem lại kết quả chính xác khi vật liệu nghiên<br /> cứu đã được xử lý thô hoặc một phần. Do đó,<br /> sử dụng mã vạch DNA kết hợp với phương<br /> pháp phân tích hình thái sẽ khắc phục hạn chế<br /> *<br /> <br /> Tel: 0369 238303, Email: quannh@dhsptn.edu.vn<br /> <br /> trên. Vùng ITS của hệ gen nhân có tính bảo<br /> thủ cao được sử dụng trong phân biệt các loài<br /> dựa trên mức độ đột biến trong trình tự<br /> nucleotide. Vùng ITS bao gồm các gen mã<br /> hóa RNA ribosome (18S; 5,8S; 28S) và xen kẽ<br /> bởi hai đoạn không mã hóa ITS1 và ITS2 [12].<br /> Trong bài báo này, chúng tôi sử dụng vùng ITS<br /> kết hợp với phương pháp hình thái để nhận<br /> diện mẫu đậu đỏ thu thập tại tỉnh Hà Giang.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Vật liệu: Mẫu đậu đỏ (ĐĐ10-HG) thu tại tỉnh<br /> Hà Giang được trồng tại Vườn Thực nghiệm<br /> của Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm<br /> - Đại học Thái Nguyên để nghiên cứu hình<br /> thái, hóa sinh và phân lập vùng ITS.<br /> Phương pháp<br /> Nghiên cứu đặc điểm hình thái: Hình thái (rễ,<br /> thân, lá, hoa, quả và hạt) của mẫu đậu đỏ<br /> được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn<br /> Tiến Bân (2013) [2] và Phạm Hoàng Hộ<br /> (1999) [3].<br /> Nghiên cứu giải phẫu hiển vi: Rễ, thân, lá<br /> được giải phẫu theo phương pháp của Nguyễn<br /> Bá (1977) [1], quan sát và chụp ảnh với kính<br /> hiển vi quang học kết nối với phần mềm<br /> Microscope Manager.<br /> Phân lập vùng ITS: DNA tổng số được phân<br /> lập dựa trên phương pháp của Shaghai và<br /> cộng sự (1984) [11]. Khuếch đại vùng ITS<br /> 105<br /> <br /> Nguyễn Thị Vân và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> bằng phản ứng PCR với cặp mồi được tổng<br /> hợp theo Kress và cộng sự (2005) [8]. Kích<br /> thước mồi và trình tự mong muốn của đoạn<br /> DNA khuếch đại được mô tả theo bảng 1.<br /> Hỗn hợp phản ứng PCR (tổng thể tích 25 μl)<br /> gồm: 12,5 μl master mix (2X); 0,5 μl mồi mỗi<br /> loại (10 pmol/μl); 1,0 μl DNA khuôn (10<br /> ng/μl); 9,5 μl nước cất. Phản ứng PCR được<br /> thực hiện theo chương trình: 94C/4 phút; 35<br /> chu kỳ (94C/30 giây; 55C/30 giây; 72C/45<br /> giây); 72C/10 phút và giữ ở 4C. Sản phẩm<br /> PCR được điện di trên gel agarose 1,0% và<br /> được tinh sạch theo kit tinh sạch của hãng<br /> Qiagen. Trình tự DNA được xác định trên<br /> máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100<br /> Avant Genetic Analyzer. Trình tự nucleotid<br /> của gen được đọc trên phần mềm BLAST và<br /> BioEdit.<br /> Định lượng protein tan: 0,05 g mẫu hạt đậu<br /> đỏ đã sấy khô tuyệt đối được chiết qua đêm<br /> bằng 1,0 ml đệm photphatcitrat (pH 8,0). Ly<br /> tâm 12000 vòng/phút trong 30 phút ở 4°C<br /> (lặp lại 3 lần) thu dịch trong và định mức lên<br /> 5 ml. Lấy 0,25 ml dung dịch mẫu bổ sung 2<br /> ml dung dịch C lắc đều trong 10 phút và bổ<br /> sung 0,25 ml dung dịch folin Ciocalteau (1:1)<br /> để 30 phút và đo ở bước sóng 750 nm.<br /> Xác định hàm lượng isoflavon: Phân tích hàm<br /> lượng daidzen và genistein từ mầm đậu đỏ 3<br /> ngày tuổi được thực hiện bằng phương pháp<br /> sắc ký lỏng cao áp theo Chen và cộng sự<br /> (2001) [5]. Dịch chiết thu được sau đó loại<br /> tạp, làm sạch bằng phương pháp HPLC.<br /> Xác định hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu<br /> đỏ bằng cách đo hàm lượng đường glucose<br /> giải phóng khi thủy phân tinh bột bởi enzyme<br /> theo phương pháp của Miller (1959) [10].<br /> Lượng đường giải phóng được xác định bằng<br /> <br /> 187(11): 105 - 111<br /> <br /> cách đo độ hấp phụ ở 540 nm, dựa vào cường<br /> độ màu tạo phức với thuốc thử [10].<br /> Xác định hoạt tính protease từ mầm hạt đậu<br /> đỏ bằng phương pháp của Anson và phản ứng<br /> màu được đo ở bước sóng 750 nm dựa vào<br /> cường độ màu tạo phức với thuốc nhuộm<br /> Folin Ciocalteau [4].<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Nhận diện mẫu đậu đỏ bằng phương pháp<br /> hình thái<br /> Mẫu đậu đỏ thu tại Hà Giang được định danh<br /> thuộc chi Vigna, thuộc loại cây một năm, thân<br /> thảo cao từ 30-90 cm, tồn tại dạng leo hoặc<br /> nằm bò trên mặt đất, thân cây thường có màu<br /> xanh và có lông tơ nhám. Rễ của đậu đỏ có<br /> một rễ cọc dài 40-50 cm và các rễ bên có nốt<br /> sần. Lá của đậu đỏ là lá kép, có 3 lá chét trên<br /> một cuống dài mọc dọc thân; lá nhỏ, hình tim<br /> dài 5-10 cm và rộng từ 5-8 cm. Hoa của đậu<br /> đỏ có màu vàng hoặc vàng sáng, hoa mọc<br /> thành chùm từ 6-10 hoa. Quả đậu đỏ có hình<br /> trụ, vỏ mỏng và mịn; khi còn non quả có màu<br /> xanh và khi chín chuyển sang màu xám. Kích<br /> thước của quả dao động từ 5-13 cm x 0,5 cm,<br /> với 2-14 hạt/quả (Hình 1). Hạt đậu đỏ có vỏ<br /> mịn, hình trụ dài 5,0-9,1 mm, rộng 4,6-6,3<br /> mm, dày 4,1-6,0 mm. Khối lượng 100 hạt là<br /> 56,8 g (Bảng 2).<br /> Nhận diện mẫu đậu đỏ bằng mã vạch ITS<br /> DNA tổng số từ mầm cây đậu đỏ được kiểm<br /> tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose<br /> 0,8% và đo quang phổ. DNA thu được đảm<br /> bảo chất lượng cho phản ứng nhân gen. Vùng<br /> gen ITS được phân lập bằng phản ứng PCR từ<br /> DNA hệ gen sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Sản<br /> phẩm PCR thu được có kích thước khoảng<br /> 480 bp ứng với vùng ITS từ mẫu cây đậu đỏ<br /> thu tại tỉnh Hà Giang (Hình 2).<br /> <br /> Bảng 1. Thông tin về cặp mồi nhân vùng ITS sử dụng trong nghiên cứu<br /> Tên mồi<br /> ITS-F<br /> ITS-R<br /> <br /> 106<br /> <br /> Trình tự (5′3′)<br /> ATGCGATACTTGGTGTGAAT<br /> GACGCTTCTCCAGACTACAAT<br /> <br /> Nhiệt độ gắn mồi<br /> <br /> Sản phẩm dự kiến<br /> <br /> 55°C<br /> <br /> ~ 500 bp<br /> <br /> Nguyễn Thị Vân và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> A<br /> <br /> 187(11): 105 - 111<br /> <br /> D<br /> <br /> C<br /> <br /> B<br /> <br /> F<br /> H<br /> G<br /> E<br /> Hình 1. Đặc điểm hình thái thân, rễ, lá, hoa, quả và hạt của đậu đỏ thu tại tỉnh Hà Giang<br /> A: Rễ; B: Thân; C: Mặt trước lá; D: Mặt sau lá; E: Quả còn non; F; Quả già; G: Quả chín khô; H: Hạt<br /> Bảng 1. Đặc điểm hình thái hạt của đậu đỏ ĐĐ10-HG<br /> TT<br /> <br /> Mẫu<br /> <br /> Hình dạng<br /> hạt<br /> <br /> Hình dạng<br /> vỏ hạt<br /> <br /> Màu vỏ hạt<br /> <br /> Màu rốn<br /> hạt<br /> <br /> Khối lượng<br /> 100 hạt<br /> <br /> 1<br /> <br /> ĐĐ10-HG<br /> <br /> Thận<br /> <br /> Rạn vỏ<br /> <br /> Tím đỏ<br /> <br /> Trắng<br /> <br /> 56,84<br /> <br /> Vùng ITS của đậu đỏ thu tại tỉnh Hà Giang được xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình<br /> tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer có kích thước là 479 nucleotide (Hình 3).<br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số của đậu đỏ<br /> 1: Vùng ITS, M: DNA marker<br /> <br /> Kết quả phân tích bằng phần mềm BLAST trong NCBI cho thấy, đoạn DNA phân lập từ mẫu đậu<br /> đỏ thu tại tỉnh Hà Giang có độ tương đồng 98-100% với các trình tự ITS thuộc chi Vigna; trong<br /> đó tương đồng 100% với loài Vigna angularis có mã số JF421525.1 (Hình 4). Từ kết quả phân<br /> tích trên, có thể nhận xét rằng đoạn DNA của mẫu đậu đỏ Hà Giang thuộc vùng ITS và mẫu cây<br /> đậu đỏ thu tại tỉnh Hà Giang thuộc loài Vigna angularis.<br /> <br /> 107<br /> <br /> Nguyễn Thị Vân và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 187(11): 105 - 111<br /> <br /> Hình 3. Trình tự vùng ITS của đậu đỏ thu tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang<br /> <br /> Hình 4. Kết quả phân tích tương đồng đoạn DNA phân lập từ mẫu đậu đỏ thu tại tỉnh Hà Giang với các<br /> trình tự trên GenBank bằng BLAST trong NCBI<br /> <br /> Giải phẫu rễ, thân và lá của đậu đỏ<br /> Giải phẫu lá gồm 08 lớp: Biểu bì trên, mô<br /> giậu, mô xốp, biểu bì dưới, gỗ, libe, mô mềm<br /> và mô dày (Hình 5). Nằm ở lớp ngoài cùng là<br /> biểu bì (1), được cấu tạo gồm những tế bào<br /> hình chữ nhật, xếp xít nhau, có chức năng bảo<br /> vệ. Mô giậu (2) gồm 2-3 lớp tế bào dài, xếp<br /> thẳng vuông góc với bề mặt cơ quan, nằm tiếp<br /> giáp ngay dưới biểu bì trên, chứa nhiều lục<br /> lạp. Mô xốp (3) nằm dưới mô giậu và trên<br /> biểu bì dưới. Biểu bì dưới (4) có nhiệm vụ bảo<br /> vệ các tế bào bên trong. Lớp mô dày gồm 4-5<br /> lớp tế bào sống, có hình đa giác, vách dày,<br /> bằng xenlulose (bắt màu đỏ đậm); các tế bào<br /> nằm sát dưới biểu bì chuyên hóa với chức<br /> năng cơ học. Gỗ sơ cấp (5) gồm 3-4 lớp tế<br /> bào chết, bắt màu xanh, có kích thước khác<br /> nhau, nằm phía trong libe tạo nên bó xếp<br /> chồng. Lớp libe sơ cấp (6) gồm các tế bào<br /> sống (bắt màu hồng của cacmin), có hình đa<br /> giác, nhỏ, xếp cạnh nhau tạo thành một vòng<br /> không liên tục. Lớp mô mềm vỏ (7) gồm 7-8<br /> lớp tế bào có kích thước không đồng đều<br /> 108<br /> <br /> chiếm phần lớn diện tích. Mô dày (8) gồm 4-5<br /> lớp tế bào sống, có hình đa giác, vách dày,<br /> bằng xenlulose (bắt màu đỏ đậm).<br /> <br /> Hình 5. Giải phẫu lá của đậu đỏ<br /> 1. Biểu bì trên; 2. Mô giậu; 3. Mô xốp; 4. Biểu bì<br /> dưới; 5. Gỗ; 6. Libe; 7. Mô mềm vỏ; 8. Mô dày<br /> <br /> Giải phẫu thân cây: Lớp biểu bì (1) phủ ngoài<br /> thân là một lớp tế bào dày gồm những tế bào<br /> hình trứng xếp xít nhau uốn lượn theo thân<br /> tạo thành vòng ngoài cùng. Mô dày (2) gồm<br /> 3-5 lớp tế hình đa giác tập trung chủ yếu ở<br /> phía các mấu lồi. Các lớp tế bào mô mềm vỏ<br /> (3) có kích thước lớn hơn ăn sâu xen kẽ với<br /> các tế bào nội bì. Các bó gỗ (4) xếp cạnh nhau<br /> <br /> Nguyễn Thị Vân và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> được ngăn cách bởi các tia ruột rộng tạo ra<br /> khoảng trống khá xa nhau. Phía ngoài đối<br /> diện với các bó gỗ là các bó libe (5) tương<br /> ứng bắt màu hồng. Xen giữa gỗ và libe là tầng<br /> phát sinh (6) gồm các tế bào dẹt có màng rất<br /> mỏng. Mô mềm ruột (8) nằm ở phần giữa<br /> thân gồm các tế bào hình đa giác có kích<br /> thước khác nhau. Đây là các tế bào sống thực<br /> hiện chức năng chủ yếu là dự trữ. Ngoài ra<br /> còn có lông che chở (8) (Hình 6).<br /> <br /> Hình 6. Giải phẫu thân của đậu đỏ<br /> 1. Bần; 2. Mô dày; 3. Mô mềm vỏ; 4. Libe; 5.<br /> Tầng phát sinh; 6. Gỗ; 7. Mô mềm ruột;<br /> 8. Lông che trở<br /> <br /> Rễ cây: Ngoài cùng của rễ là lớp bần (1) được<br /> cấu tạo bởi một lớp tế bào biểu bì hình đa<br /> giác có độ dày khoảng 0,3 µm và có thành tế<br /> bào hóa bần. Bên trong lớp bần là vỏ thứ cấp<br /> gồm nhiều lớp tế bào mô mềm vỏ (2), mô<br /> cứng (3) và libe (4). Phần mô cứng gồm 4<br /> đám mô cứng xếp đối xứng nhau qua phần gỗ<br /> từng đôi một; bó libe có hình tam giác tạo<br /> thành các dãy lồi ra phía ngoài. Trong cùng là<br /> trụ giữa chiếm phần lớn diện tích gồm các<br /> mạch gỗ (5) to bắt màu xanh và tia gỗ đó là<br /> gỗ thứ cấp và mô mềm ruột (6) (Hình 7).<br /> <br /> Hình 7. Giải phẫu rễ của đậu đỏ<br /> 1. Bần; 2. Mô mềm vỏ; 3. Đám mô cứng;<br /> 4. Libe; 5. Gỗ; 6. Mô mềm ruột<br /> <br /> 187(11): 105 - 111<br /> <br /> Hoạt tính α-amylase từ mầm đậu đỏ<br /> α-amylase thuỷ phân tinh bột tạo thành<br /> đường. Đường tạo thành có vai trò làm tăng<br /> áp suất thẩm thấu của tế bào, từ đó làm tăng<br /> tính chống chịu của thực vật với các yếu tố<br /> cực đoan từ môi trường, giúp cây non phát<br /> triển bình thường. Hoạt tính α-amylase từ<br /> mầm hạt đậu đỏ ở 3 ngày tuổi đạt 1,2 U/mg.<br /> Hoạt tính α-amylase được định tính trên đĩa<br /> thạch có chứa 1% tinh bột. Kết quả hình 8<br /> xuất hiện vòng phân giải tinh bột màu trắng<br /> khi nhuộm đĩa thạch bằng thuốc nhuộm lugol.<br /> Như vậy, mầm hạt đậu đỏ Hà Giang có hoạt<br /> tính α-amylase.<br /> <br /> Hình 8. Định tính α-amylase từ mầm đậu đỏ<br /> trên đĩa thạch<br /> <br /> Hoạt tính protease từ mầm đậu đỏ<br /> Protease đóng vai trò rất quan trọng trong quá<br /> trình nảy mầm của hạt, sự phát triển của cây<br /> non và liên quan đến khả năng chịu mất nước<br /> của tế bào. Nghiên cứu hoạt tính protease từ<br /> mầm đậu đỏ nhằm đánh giá mối liên quan với<br /> hàm lượng protein có trong hạt. Kết quả nhận<br /> thấy, hoạt tính protease ở mầm 3 hạt đậu đỏ<br /> ngày tuổi đạt 1,4 U/mg. Hoạt tính protease<br /> được định tính trên đĩa thạch có chứa 1%<br /> casein. Kết quả hình 9 xuất hiện vòng phân<br /> giải casein màu trắng khi nhuộm đĩa thạch<br /> bằng comasine blue. Như vậy, mầm hạt đậu<br /> đỏ Hà Giang có hoạt tính protease.<br /> <br /> Hình 9. Định tính protease từ mầm đậu đỏ trên<br /> đĩa thạch<br /> <br /> 109<br /> <br />