Định lượng diethyltoluamid trong kem bôi da bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

28
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng diethyltoluamid (DEET) trong kem bôi da bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Từ đó ứng dụng phương pháp để đánh giá chất lượng một số chế phẩm kem DEET.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Định lượng diethyltoluamid trong kem bôi da bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Định lượng diethyltoluamid trong kem bôi da bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Phạm Đức Thịnh1, Nguyễn Trọng Điệp1, Phan Thị Tú Uyên1 Phan Đình Châu2, Nguyễn Văn Thư 1, Vũ Bình Dương1 1 Học viện Quân y 2 Đại học Bách khoa Hà Nội TÓM TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định được phương Diethyltoluamid (DEET) là hoạt chất có tác pháp định lượng diethyltoluamid (DEET) trong dụng xua đuổi nhiều loại côn trùng như ruồi, muỗi, kem bôi da bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Từ đó bọ chét [1]. Đặc biệt DEET có phổ tác dụng rộng ứng dụng phương pháp để đánh giá chất lượng một và có hiệu quả trên hầu hết các loài muỗi (cả các số chế phẩm kem DEET. véc-tơ truyền bệnh sốt xuất huyết) [2], thời gian Phương pháp: Khảo sát chọn điều kiện sắc ký huy tác dụng kéo dài có thể tới 6 giờ [3]. Vì vậy, phù hợp; thẩm định phương pháp định lượng theo DEET được coi là hoạt chất tiềm năng để bào chế hướng dẫn của ICH gồm: Tính tương thích hệ các sản phẩm xua đuổi côn trùng nói chung và các thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ loại muỗi nói riêng. Các sản phẩm chứa DEET có đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định thể được sử dụng thích hợp cho bộ đội trong luyện lượng (LOQ). tập và chiến đấu ở những khu vực nguy cơ cao mắc Kết quả: đã lựa chọn được các điều kiện sắc ký như rừng rậm, đồi núi, sình lầy… Năm 2018, Học gồm: cột C18, 5µm, 4,6 x 250 mm, detector UV tại viện Quân y được Bộ Quốc phòng cho triển khai đề bước sóng 235 nm, pha động hỗn hợp acetonitril và tài nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu và bào chế kem acid phosphoric 0,1% tỉ lệ 60:40 (v/v), tốc độ dòng bôi da chứa DEET nhằm phục vụ cho bộ đội. Để 0,5 ml/phút. Phương pháp đã được thẩm định đạt có căn cứ đánh giá chất lượng sản phẩm trong quá yêu cầu về độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp trình sử dụng và bảo quản, cũng như tiêu chuẩn hóa lại, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng chất lượng chế phẩm kem chứa DEET cần có quy theo yêu cầu của ICH. trình định lượng hoạt chất này bằng những phương Kết luận: Đã xây dựng và thẩm định được pháp phân tích hiện đại có độ chính xác cao. Do phương pháp lượng DEET trong chế phẩm kem vậy, nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu bằng HPLC, từ đó ứng để xác định hàm lượng xây dựng và thẩm định quy trình định lượng DEET DEET trong kem bôi da. trong chế phẩm kem bằng phương pháp sắc ký lỏng Từ khóa: N,N-diethyl-m-toluamid, HPLC. hiệu năng cao (HPLC). Ngày nhận bài: 2/7/2020 Ngày phản biện: 12/8/2020 Ngày chấp nhận đăng: 18/8/2020 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 77
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thể tích tiêm 10 µl, tốc độ dòng 1 ml/phút, Nguyên liệu và thiết bị nhiệt độ cột 26°C. Qua các khảo sát thực nghiệm, * Nguyên liệu và hóa chất chọn được điều kiện sắc ký thích hợp sao cho peak - DEET hàm lượng 97% (Sigma - Aldrich, Đức). DEET tách hoàn toàn khỏi các peak tạp (nếu có) và - Acid phosphoric đặc (H3PO4) PA, Methanol có hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 - 1,5. (CH3OH) PA, Acetonitril, nước cất đạt tiêu chuẩn Tốc độ dòng: Khảo sát các tốc độ dòng pha tinh khiết phân tích. động khác nhau: 0,5; 0,75 và 1 ml/phút. Căn cứ vào - Kem DEET 20% (số lô 1, 2, 3). hệ số bất đối, khả năng tách riêng biệt với các peak * Thiết bị còn lại trên sắc ký đồ, đồng thời đảm bảo thời gian Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Water 2489, lưu (tR) phù hợp để lựa chọn tốc độ dòng phù hợp. Detector UV/Visible, Singapor, 2 kênh dung môi, * Khảo sát điều kiện xử lý mẫu thử detector UV/VIS; bình chiết siêu âm Soniclean; Dung môi chiết mẫu: Căn cứ vào USP 41 [4], cân phân tích Sartorius độ chính xác 0,1 mg. tiến hành khảo sát các dung môi chiết: ethanol Phương pháp nghiên cứu tuyệt đối, hỗn hợp MeOH - nước (45 : 55). Cân * Chuẩn bị mẫu chính xác khoảng 0,1gam kem DEET vào bình Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc DEET có định mức 100ml, bổ sung khoảng 80ml dung môi nồng độ 200 µg/ml trong hỗn hợp MeOH - nước chiết mẫu, lắc siêu âm trong 60 phút, để nguội, (45 : 55). Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với cùng bổ sung vừa đủ đến vạch với cùng dung môi rồi dung môi để có các dung dịch chuẩn làm việc. pha loãng 10 lần. Lọc qua màng 0,45µm, phân Mẫu trắng: hỗn hợp methanol - nước (45 : 55). tích HPLC, tính hiệu suất chiết. Mỗi khảo sát lặp * Khảo sát điều kiện sắc ký lại 3 lần. Dung môi được chọn có khả năng hòa Bước sóng định lượng: Tham khảo tài liệu [4], [5], tan tối đa dược chất và hòa tan tối thiểu các tá [6], tiến hành khảo sát các bước sóng định lượng dược; độ lặp lại tốt giữa các lần. 230, 235 và 240 nm. Lựa chọn bước sóng có tỉ lệ Thời gian chiết: Tiến hành xử lý mẫu như đã đáp ứng diện tích peak/nhiễu đường nền lớn nhất. nêu ở phần trước với thời gian lắc siêu âm trong các Hệ dung môi pha động: Căn cứ vào [4], [7], khoảng thời gian 30 phút và 60 phút. Tính hiệu suất khảo sát các hệ pha động khác nhau với thành phần chiết. Lặp lại mỗi thời gian khảo sát 3 lần. Thời gian như trong bảng 1. lựa chọn là thời gian chiết được DEET với hiệu suất cao, độ lặp lại tốt giữa các lần. Bảng 1. Thành phần các hệ pha động sử dụng trong * Thẩm định phương pháp phân tích Phương pháp phân tích được thẩm định theo Thành phần Tỷ lệ hướng dẫn chung ICH (International conference on Harmonisation) về thẩm định phương pháp MeOH : acid phosphoric 45 : 55 phân tích [8] gồm: 0,1% 70 : 30 - Tính tương thích hệ thống; 20 : 80 - Độ đặc hiệu; ACN : acid phosphoric - Khoảng nồng độ tuyến tính; 80 : 20 0,1% - Độ lặp lại; 60 : 40 - Độ đúng; 78 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG - Giới hạn định tính (LOD) và giới hạn định (với tỷ lệ 60:40); tốc độ dòng 0,5 ml/phút chạy lượng (LOQ). trong 13 phút; thể tích bơm mẫu 10 µl; cột ở nhiệt * Xử lý số liệu độ phòng. Với các điều kiện đã lựa chọn, kết quả Số liệu được phân tích thống kê trên phần mềm trên sắc ký đồ hình 1 cho thấy píc của DEET đẹp, Microsoft Excel Office 2013. cân đối và thời gian lưu khoảng 9,48 phút là phù hợp cho phân tích DEET trong kem xua muỗi. Vì KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN vậy, chúng tôi lựa chọn điều kiện này cho quá trình Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký khảo sát tiếp theo. Trên cơ sở tham khảo các tài liệu [4-6] và Kết quả lựa chọn điều kiện xử lý mẫu qua khảo sát tìm điều kiện sắc ký phù hợp, chúng Căn cứ theo mô tả đã được trình bày phần tôi đã lựa chọn được điều kiện sắc ký cho định phương pháp, chuẩn bị các mẫu có nồng độ khoảng lượng DEET như sau: Cột Select C18 (5µm 4,6 x 20,02 µg/ml để tiến hành khảo sát lựa chọn dung 250mm); detector UV ở bước sóng 235 nm; pha môi chiết và thời gian chiết. Kết quả được thể hiện động: dung dịch Acetonitril : acid phosphoric 0,1% ở bảng 2 và 3: Bảng 2. Kết quả lựa chọn dung môi chiết mẫu MeOH : nước = 45:55 Cồn tuyệt đối Dung môi Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 m DEET lý thuyết (g) 0,0196 0,0202 0,0200 0,0222 0,0198 0,0205 m DEET thực tế (g) 0,0210 0,0212 0,0210 0,0266 0,0227 0,0242 Hiệu suất (%) 107,1 104,9 105,0 119,8 114,6 118,0 X ± SD (%) 105,7 ± 1,24 117,5 ± 2,64 RSD (%) 1,17 2,25 Kết quả bảng 2 cho thấy: Mỗi dung môi khảo phân tích. Sử dụng dung môi MeOH: nước (45:55) sát đều có sự lặp lại giữa các lần đo. Tuy nhiên, khi theo tài liệu [8] thu được hiệu suất chiết là 105,7 ± dùng cồn tuyệt đối hiệu suất chiết rất lớn (117,5 ± 1,24%, độ lệch chuẩn giữa các lần phân tích là 1,17% 2,64%, nằm ngoài khoảng 95 -110%) do cồn tuyệt (
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Từ kết quả khảo sát nhận thấy: Chiết siêu âm Từ kết quả bảng 2 và bảng 3, đề tài lựa chọn trong thời gian 30 phút chưa chiết được hoàn toàn dung môi pha mẫu là MeOH: nước (45 : 55) và thời DEET ra khỏi cốt tá dược, hiệu suất chiết thấp và gian chiết mẫu là 60 phút cho quá trình thẩm định không có sự lặp lại giữa các mẫu (50,9 ± 2,29%, phương pháp định lượng. RSD = 4,5%). Khi tăng thời gian chiết lên 60 phút, Kết quả thẩm định phương pháp định lượng cả 3 lần phân tích riêng biệt đều có hiệu suất chiết * Tính tương thích hệ thống gần như tối đa (99,93 ± 1,42%), độ lệch chuẩn giữa Phân tích sắc ký 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn DEET các lần 1,42% (
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 3000000 tính toán giá trị trung bình và RSD. Tính % hàm y = 25975x - 10485 2500000 R2 = 0.9999 lượng DEET tìm lại được so với lượng DEET Diện tích peak 2000000 1500000 chuẩn thêm vào. Kết quả thẩm định độ đúng thể 1000000 hiện trong bảng 5. 500000 0 0 20 40 60 80 100 120 Bảng 5. Kết quả thẩm định độ đúng quy trình định Nồng độ (µg/ml) lượng DEET trong kem bôi da Hình 2. Đồ thị mối quan hệ tuyến tính của diện tích peak và nồng độ DEET trong khoảng khảo sát Thêm vào Tìm lại Hiệu suất thu STT (mg) (mg) hồi (%) Phân tích sắc ký dãy chuẩn DEET có nồng độ từ 6,275 - 100,4 µg/ml theo điều kiện đã lựa chọn 1 0,1076 0,1064 98,88 được. Kết quả cho thấy, đường hồi quy của DEET 2 0,2152 0,2085 96,89 là đường thẳng (y = 25795x - 10485) với hệ số xác 3 0,3228 0,3157 97,80 định R2 gần bằng 1 (0,9999) nên trong khoảng 4 0,5380 0,5318 98,85 nồng độ khảo sát có mối liên hệ tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích peak và nồng độ DEET (Hình 2). Vì Kết quả cho thấy tại mỗi mức nồng độ, hiệu suất vậy, có thể sử dụng phương pháp đã xây dựng để thu hồi lại từ 96,89 - 98,88% (đều nằm trong khoảng định lượng DEET bằng cách so sánh diện tích píc 95 - 105%). Như vậy, phương pháp xử lý mẫu là phù của dung dịch thử với dung dịch chuẩn có nồng độ hợp, chiết được gần như hoàn toàn hoạt chất khỏi nằm trong khoảng tuyến tính. cốt tá dược kem. * Độ đúng * Độ lặp lại Độ đúng được thẩm định bằng phương pháp Độ lặp lại của phương pháp được tiến hành bằng thêm chuẩn: Thêm chính xác một lượng chuẩn cách định lượng DEET với các lượng cân khác nhau DEET tương đương lần lượt với 25%, 50%, 75%, trên cùng một mẫu kem. Phân tích sắc ký theo điều 100% so với lượng DEET trong mẫu thử. Tiến kiện đã lựa chọn. Tính hàm lượng trung bình DEET hành xử lý mẫu và phân tích HPLC trong điều trong mẫu kem, RSD (%). Kết quả được trình bày kiện đã lựa chọn. Tiêm lặp lại mỗi mẫu 3 lần để ở bảng 6. Bảng 6. Kết quả thẩm định độ lặp lại quy trình định lượng DEET trong kem bôi da Khối lượng DEET Hàm lượng DEET Lần Diện tích peak (µAU*s) Thời gian lưu (phút) trong kem (g) trong kem (%) 1 0,0199 506890 9,494 100,40 2 0,0204 513837 9,496 101,50 3 0,0201 509490 9,487 100,81 4 0,0202 510723 9,487 100,99 5 0,0200 508670 9,494 100,70 6 0,0204 511023 9,487 100,95 X ± SD 100,89 ± 0,37 RSD (%) 0,36 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 81
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Theo ICH RSD% tối đa chấp nhận được là 2%. tích ở nồng độ này. Kết quả cho thấy RSD ở các điểm khảo sát là 0,36%. Từ các kết quả khảo sát trên cho thấy: Phương Như vậy, quy trình định lượng DEET trong kem bôi pháp định lượng DEET bằng HPLC đáp ứng yêu da đảm bảo được độ lặp lại. cầu phân tích theo quy định của ICH. *Xác định LOD và LOQ Kết quả định lượng DEET trong một số mẫu Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn nhiều lần kem rồi tiến hành sắc ký song song với mẫu trắng cho tới Từ phương pháp đã xây dựng và thẩm định, khi tỷ lệ chiều cao của pic so với nhiễu đường nền chúng tôi áp dụng để định lượng DEET trong một khoảng 3/1 thì lấy làm giới hạn phát hiện. Giới hạn số mẫu kem 20% DEET do Trung tâm Nghiên cứu, định lượng được tính bằng 3,33 lần giới hạn phát ứng dụng, sản xuất thuốc, Học viện Quân y cung hiện. cấp cũng như sản phẩm trên thị trường có hàm Đã khảo sát và xác định được nồng độ mẫu thử lượng 15% DEET (ký hiệu: R). Chuẩn bị các mẫu khoảng 0,47 µg/ml và 1,57 µg/ml lần lượt là giới thử có nồng độ khoảng 20 µg/ml để tiến hành định hạn định tính và giới hạn định lượng, đáp ứng với lượng. Kết quả xác định hàm lượng DEET trình bày độ đúng và độ lặp lại ở mức có thể tiến hành phân trong bảng 7. Bảng 7. Kết quả định lượng DEET trong một số mẫu kem Mẫu KL DEET trong Diện tích peak Hàm lượng KL kem % so với nhãn kem mẫu thử (g) (µAU*s) (%) 1 0,1000 0,0200 506890 19,92 99,59 2 0,1005 0,0201 513837 20,07 100,4 3 0,0995 0,0199 509490 20,03 100,6 R 0,1331 0,0197 500599 14,99 99,90 Kết quả cho thấy hàm lượng DEET trong các 235 nm; pha động: dung dịch Acetonitril: acid mẫu kem 20% đạt được từ 99,59 - 100,6%, cũng phosphoric 0,1% (với tỷ lệ 60:40); tốc độ dòng 0,5 như mẫu sản phẩm R trên thị trường là 99,90%. ml/phút chạy trong 13 phút; thể tích bơm mẫu 10 Các công thức đều đạt yêu cầu theo qui định tại µl; cột ở nhiệt độ phòng. Phương pháp xây dựng chuyên luận diethyltoluamid công thức dùng ngoài đáp ứng yêu cầu về tương thích với hệ thống sắc ký, của Dược điển Mỹ (USP 41). Điều này cho thấy, đảm bảo độ chọn lọc đặc hiệu; độ đúng (độ thu hồi phương pháp phân tích là tin cậy, có thể áp dụng từ 96,89 - 98,88% ) và độ lặp lại tốt (RSD < 2 %), để định lượng DEET trong các sản phẩm có hàm có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích lượng khác nhau. píc và nồng độ chất phân tích trong khoảng nồng độ từ 6 - 100 µg/ml với hệ số tương quan r ≈ 1,000. Đã KẾT LUẬN ứng dụng phương pháp này để định lượng DEET Đã xây dựng và thẩm định được phương pháp trong một số mẫu kem. Như vậy, có thể sử dụng định lượng DEET trong kem xua muỗi bằng phương phương pháp để định lượng DEET trong kem xua pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng Cột Select muỗi trên thị trường cũng sử dụng để định lượng C18 (5µm 4,6 x 250mm); detector UV ở bước sóng DEET trong các chế phẩm nghiên cứu. 82 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG SUMMARY Objectives: To establish and validate methods to assay N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) in topical formulations by high performance liquid chromatography (HPLC) and apply to test quality of some pharmaceutical preparations. Methods: Chromatographic conditions were studied; the method was validated according to the ICH guidelines, including: System suitability, specificity, linear range, repeatability, accuracy, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ). Results: Chromatographic analysis was performed on a Select column (C18, 5 µm, 250 x 4.6 mm) with a mixture of acetonitril and acid phosphoric 0.1% (60:40, v/v) as mobile phase, at flow rate of 0.5 mL/min, and UV detection at 235 nm. LOD and LOQ of the method were 0.47 and 1.57 µg/mL respectively, the linear range was from 6 – 100 µg/ml with the repeatability and accuracy within the permissible limits. The content of DEET in some preparations circulated which were determined by this method was in the range of 100.4 – 100.99% of the amount. Conclusion: The established HPLC method is appropriate and reliable enough to quantify DEET in cream. Keywords: DEET; High performance liquid chromatography. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. WHO/Department of control of neglected tropical diseases (2009), “Guilines for Efficacy Testing of Mosquito Repellents for Human Skin”, pp. 4. 2. Moore S., Debboun M., (2006), “Insect Repellents”, History of insect repellents, pp. 3 - 30. 3. Tavares M., Silva M. R. M., Siqueria L. B. O. et al. (2019), “Trends in insect repellent formulation: A review”, International journal of Pharmaceutics, Elsevier journal, 539, pp. 190 - 209. 4. The United States Pharmacopeia 41, pp. 1281-1283. 5. Qui H., McCall J. W., Jun H. W. (1997), “Formulation of topical insect repellent N,N-diethyl-m-toluamide (DEET): vehicle effects on DEET in vitro skin permeation”, International Journal of Pharmaceutics, 163 (1998), pp. 167–176. 6. McGredy R., Hamilton K. A., Simpson J. A. et al. (2001), “Safety of the insect repellent N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) in pregnancy”, The American Society of Tropical Medicine and Hygiene, 65(4), pp. 285 – 289. 7. Lê Việt Đức (2020), “Nghiên cứu định lượng DEET trong kem xua muỗi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí Y học Quân sự. tr. 57 - 60. 8. ICH (2019), “Bioanalytical method validation M10”. ICH M10 guideline. TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 83