207
73. ĐỊNH LƢỢNG GH
(Growth Hormon)
I. NGUYÊN LÝ
- Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự
kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn
với enzyme.
- Xét nghiệm DRG HGH ELISA là loại xét nghiệm dựa trên nguyên lý của Kỹ
thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme ở pha rắn (đáy giếng).
- Xét nghiệm này sử dụng một loại kháng thể anti-HGH ở cừu (còn gọi là kháng
thể bắt) cho pha rắn cố định (đáy giếng) và một loại kháng thể thứ 2 là kháng
thể đơn dòng anti-HGH ở chuột (còn gọi là kháng thể phát hiện), kháng thể này
được gắn kết với enzyme horseradish peroxidase. Mẫu xét nghiệm này cho
phép phản ứng đồng thời với 2 loại kháng thể, kết quả là những phân tử HGH
bị kẹp thành miếng sandwich giữa pha rắn và những kháng thể gắn kết với
enzyme.
- Sau khi ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng, các giếng được rửa bằng nước nhằm loại
bỏ những kháng thể dính không chuyên biệt. Dung dịch TMB được cho thêm
vào và ủ khoảng 20 phút, kết quả hỗn hợp có màu xanh dương. Tuy nhiên, hỗn
hợp này sẽ chuyển sang màu vàng khi cho HCl 1N vào, và được đo tại bước
sóng 450 nm. Nồng độ của HGH tỷ lệ với cường độ màu của mẫu xét nghiệm.
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện: người thực hiện xét nghiệm có trình độ phù hợp.
2. Phƣơng tiện, hóa chất
2.1. Hóa chất và thuốc thử trong bộ Kit của nhà cung cấp
Giếng chứa kháng thể
(1 đĩa, 96 giếng)
Đáy giếng có chứa kháng thể cừu anti-HGH
Thuốc thử gắn kết enzyme
(13 ml)
Thuốc thử có chứa kháng thể đơn dòng anti-
HGH ở chuột gắn kết với enzyme horseradish
peroxidase.
Bộ mẫu chuẩn tham chiếu
(1 ml/lọ)
Chứa 0, 2.5, 5.5, 10, 25 và 50 ng/ml hormone
tăng trưởng ở người.
Thuốc thử TMB
(1chai, 11 ml)
Chứa 3, 3’, 5, 5’ Tetramethylbenzidine
(TMB) được ổn định trong dung dịch đệm.
Dung dịch ngừng phản ứng
(1N HCl) (1 chai, 11 ml)
Chứa acid hydrochloric đã pha loãng
208
2.2. Vật liệu tự chuẩn bị
- Nước cất hoặc nước khử ion
- Pippet 0.05, 1.0, 0.2 và 1mL
- Đầu côn
- Giếng 96 lỗ
- Giấy thấm
- Giấy kẻ
- Máy vortex
- Mẫu QC (ví dụ: mẫu huyết thanh của hãng Biorad Lyphochek Control)
1. Dụng cụ
Giếng đọc tại độ rộng dải tần là 10nm hoặc thấp hơn và gới hạn của mật độ quang
học từ 0-2 OD hoặc ở bước sóng lớn hơn 45nm là độ hấp thụ đo được. Lƣu ý:
- Kit này chứa đựng những vật liệu từ người, do đó những nguồn vật liệu được dùng
để sản xuất bộ kit này đã được kiểm tra HBsAg, HIV ½ và HCV âm tính. Tuy
nhiên, không có phương pháp nào là đảm bảo chắc chắn rằng không có mặt những
tác nhân này. Do đó, tất cả những sản phẩm máu từ người, bao gồm cả mẫu huyết
thanh, đều phải được xem xét sự lây nhiễm tiềm ẩn, Việc xử lý và loại bỏ phải
được xác định thông qua hướng dẫn hay quy định về an toàn sinh học cấp quốc
gia.
- Không sử dụng thuốc thử hết hạn dùng và không trộn lẫn các thành phần thuốc
thử lại với nhau từ các bộ kit có số lô khác nhau.
- Không sử dụng thuốc thử bị đục hoặc bị nhiễm bẩn.
- Không sử dụng thuốc thử nếu chai lọ bị hỏng.
- Mỗi giếng chỉ sử dụng một lần.
- Không hút thuốc thử bằng miệng.
- Các dung dịch nên có chất bảo quản, không nên sử dụng trong phản ứng enzyme.
- Tránh tiếp xúc với HCl 1N nếu không sẽ gây rát và bỏng cho da. Nếu tiếp xúc
phải rửa lại nhiều lần với nước và bôi thuốc.
- Chỉ dùng trong chuẩn đoán.
2.4. Điều kiện bảo quản: Bộ kit khi chưa sử dụng nên bảo quản ở 2-80C, và xem hạn
sử dụng ghi trên nhãn.
- Thuốc thử được mở và sử dụng phải ổn định cho đến khi hết hạn dùng nếu được
bảo quản đúng ở 2-80C.
- Các đĩa phải được đặt trong túi hút ẩm để giảm thiểu không khí tiếp xúc.
3. Ngƣời bệnh
Người bệnh có triệu chứng lâm sàng về bệnh liên quan đến hormone HGH,…
Mục đích và chỉ định xét nghiệm
209
Xét nghiệm được sử dụng để chẩn đoán tình trạng rối loạn phát triển ở trẻ em:
Chứng lùn tuyến yên (do giảm tiết GH ở trẻ em); Chứng người khổn lồ (do tăng tiết
GH ở trẻ đang tuổi phát triển chiều cao) và chứng to đầu chi (do tăng tiết GH ở người
trưởng thành).
4. Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm cần ghi đầy đủ thông tin về tên, tuổi, giới tính, khoa phòng, chẩn
đoán của người bệnh và ghi rõ chỉ định xét nghiệm
III. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
- Huyết thanh lấy từ máu toàn phần. Tránh sử dụng những hóa chất thêm vào. Tránh
những mẫu xét nghiệm bị tán huyết hay mẫu bị đục.
- Mẫu bệnh phẩm nên được đậy và bảo quản ở nhiệt độ 2-80C trong 48h trước khi
dùng làm xét nghiệm, và mẫu bệnh phẩm bảo quản trên 6 tháng sẽ được đông khô
tại -200C .
2. Tiến hành kỹ thuật
- Đảm bảo số lượng giếng có trong ngăn chứa.
- Hút 50µL mẫu chuẩn, bệnh phẩm, và mẫu control vào trong các giếng tương ứng.
- Thêm 100 µL thuốc thử gắn kết enzyme vào mỗi giếng.
- Trộn đều trong 30 giây.
- Ủ ở nhiệt độ phòng (18-250C) trong 45 phút.
- Gõ nhẹ đáy giếng và rửa 5 lần bằng nước cất.
- Thêm 100 µL thuốc thử TMB vào mỗi giếng và trộn nhẹ nhàng trong 5 giây.
- Ủ ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối khoảng 20 phút.
- Thêm 100 µL dung dịch Stop Solution vào mỗi giếng để ngừng phản ứng.
- Trộn nhẹ nhàng trong 30 giây, phải đảm bảo rằng màu xanh dương trong mẫu đã
hoàn toàn chuyển sang màu vàng.
- Đọc độ hấp thụ tại bước sóng 450nm trong 15 phút.
Lƣu ý:
- Không nên dùng hơn 32 giếng để chạy xét nghiệm.
- Việc hút mẫu chuẩn, mẫu bệnh phẩm, mẫu control chỉ thực hiện trong vòng 3 phút.
- Tất cả các mẫu chuẩn, mẫu bệnh phẩm, mẫu control nên chạy 2 lần trong cùng
điều kiện xét nghiệm.
- Nên đọc kết quả trong 15 phút kể từ lúc cho dung dịch Stop Solution vào.
IV. TÍNH TOÁN KẾT QUẢ
- Tính toán độ hấp thụ trung bình tại bước sóng (OD 450) khi chạy lặp lại 2 lần trên
mẫu chuẩn, mẫu control và mẫu bệnh phẩm.
- Xây dựng đường cong chuẩn, vẽ đồ thị độ hấp thu của mẫu chuẩn trên trục Y và
nồng độ của chất chuẩn trên trục X.
210
- Sử dụng giá trị hấp thụ trung bình cho mỗi mẫu bệnh phẩm để xác định nồng độ
tương ứng của HGH, đơn vị tính bằng ng/mL từ đường chuẩn.
Giá trị mong đợi:
- Mỗi phòng xét nghiệm phải xây dựng ngưỡng bình thường dựa trên sự tập hợp
người bệnh. Ngưỡng bình thường của hormone tăng trưởng ở người rất khó xác
định do những thay đổi sinh lý bất thường của hormone HGH. Hầu hết ở người
trưởng thành sau một đêm nhịn đói thì mức độ của HGH trong huyết thanh là
7ng/mL hoặc thấp hơn. Những thay đổi của hormone HGH trong các phản ứng
kích thích đưa ra sự đánh giá chính xác hơn về rối loạn chức năng tuyến yên.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Không có mốc ảnh hưởng đối với xét nghiệm HGH có nồng độ ≥ 1000 ng/ml
- Các kết quả tin cây và tái lập có được khi quy trình xét nghiệm được thực hiện
theo các quy định trong “thực hành tốt trong xét nghiệm” và tuân thủ đóng gói
theo hướng dẫn đi kèm.
- Các kết quả có được sử dụng để sẽ hỗ trợ cho các quy trình chuẩn đoán khác và
cung cấp các thông tin có sẵn cho bác sĩ lâm sàng.
- Quy trình rửa rất quan trong, nếu rửa không đủ sẽ cho kết quả không chính xác
và đọc sai độ hấp thu.