Định lượng ginsenoside RB1, RE, RG1 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2013<br /> <br /> ĐỊNH LƢỢNG GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP<br /> SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Trần Quang Trung*; Trịnh Văn Lẩu**; Nguyễn Văn Bạch*<br /> TÓM TẮT<br /> Xây dựng phương pháp định lượng 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng<br /> cao (HPTLC) với các điều kiện:<br /> + Bản mỏng: HPTLC silica gel 60F254.<br /> + Hệ dung môi: chloroform/AcOEt/MeOH/H2O = 15/40/22/10.<br /> + Bước sóng:  = 275 nm.<br /> * Từ khóa: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao; Phương pháp định lượng ginsenoside.<br /> <br /> QUANTITATIVE ANALYSIS OF GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 BY<br /> HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY<br /> SUMMARY<br /> Quantitative analysis method of ginsenoside Rb1, Re, Rg1 by high performance thin layer chromatography<br /> was built based on the following conditions:<br /> + Thin layer: HPTLC silica gel 60F254.<br /> + Solvens system: chloroform/AcOEt/MeOH/H2O = 15/40/22/10.<br /> + Wavelength:  = 275 nm.<br /> * Key words: High performance thin layer chromatography; Ginsenoside quantitative method.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> hoạt chất có trong các chế phẩm, đặc biệt<br /> <br /> Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao là một<br /> kỹ thuật hiện đại, nhưng còn khá mới ở<br /> nước ta do trang thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên,<br /> độ nhạy và độ chính xác cao trong phân<br /> tích<br /> <br /> chế phẩm có nguồn gốc dược liệu. Chúng<br /> tôi đã tiến hành xây dựng phương pháp này<br /> nhằm: Định tính và định lượng 3 ginsenoside<br /> Rb1, Re, Rg1.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW<br /> Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Nguyễn Liêm<br /> PGS. TS. Nguyễn Văn Minh<br /> <br /> 12<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Vật liệu nghiên cứu.<br /> * Nguyên liệu, dung môi, hoá chất:<br /> - Chất chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1<br /> loại SH (hãng Chromadex, Mỹ).<br /> - Các dung môi, hoá chất tinh khiết PA.<br /> * Dụng cụ và trang thiết bị:<br /> - Hệ thống HPTLC của hãng DESAGA;<br /> bản mỏng HPTLC 10 x 10 cm; 20 x 10 cm;<br /> 20 x 20 cm; pipet tự động 1 - 10 l, 1 - 20 l,<br /> 100 l, 200 l, 500 l; các loại dụng cụ thuỷ<br /> tinh có độ chính xác thích hợp.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp:<br /> - Chuẩn hỗn hợp 1: pha dung dịch<br /> ginsenoside Rb1 có nồng độ 51,1875 g/ml;<br /> ginsenoside Re có nồng độ 20,0625 g/ml<br /> và ginsenoside Rg1 có nồng độ 51,475 g/ml.<br /> - Chuẩn hỗn hợp 2: pha dung dịch<br /> ginsenoside Rb1 có nồng độ 150,9375 g/ml;<br /> ginsenoside Re có nồng độ 40,125 g/ml và<br /> ginsenoside Rg1 có nồng độ 200,575 g/ml.<br /> - Chuẩn hỗn hợp 3: pha dung dịch<br /> ginsenoside Rb1 có nồng độ 250,6875 g/ml;<br /> ginsenoside Re có nồng độ 60,1875 g/ml<br /> và ginsenoside Rg1 có nồng độ 351,45 g/ml.<br /> - Chuẩn hỗn hợp 4: pha dung dịch<br /> ginsenoside Rb1 có nồng độ 350,4375 g/ml;<br /> ginsenoside Re có nồng độ 80,25 g/ml và<br /> ginsenoside Rg1 có nồng độ 500,55 g/ml.<br /> - Chuẩn hỗn hợp 5: pha dung dịch<br /> ginsenoside Rb1 có nồng độ 450,1875 g/ml;<br /> ginsenoside Re có nồng độ 100,3125 g/ml<br /> và ginsenoside Rg1 có nồng độ 651,425 g/ml.<br /> <br /> - Khảo sát và lựa chọn pha động:<br /> Tiến hành khảo sát quá trình tách<br /> ginsenoside Rb 1, Re, Rg1 trong dung dịch<br /> chuẩn hỗn hợp với 3 hệ dung môi sau:<br /> chloroform/MeOH/H 2O = 13/7/2 (lớp<br /> dưới); n-Butanol/AcOEt/H 2O = 4/1/5 (lớp<br /> trên);<br /> chloroform/AcOEt/MeOH/H2O<br /> =<br /> 15/40/22/10.<br /> Dựa vào kết quả, giá trị Rf và phổ tử<br /> ngoại-khả kiến trên sắc ký đồ, lựa chọn<br /> pha động phù hợp sao cho tách ginsenoside<br /> Rb1, Re, Rg 1 cho các peak gọn và cân<br /> xứng nhất.<br /> * Khảo sát và lựa chọn bước sóng xác<br /> định ginsenoside Rb1, Re, Rg1:<br /> Dựa vào phổ hấp thụ tử ngoại của<br /> saponin khi phun thuốc thử hiện màu, tiến<br /> hành quét phổ UV mẫu thử và mẫu chuẩn<br /> ginsenoside Rb1, Re, Rg1 tại nhiều bước<br /> sóng trong khoảng từ 200 - 800 nm. Trên<br /> cơ sở phổ UV của saponin kết hợp với phổ<br /> của mẫu chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1<br /> tại nhiều bước sóng khác nhau, lựa chọn<br /> bước sóng sao cho cường độ tín hiệu peak<br /> của ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lớn nhất.<br /> * Xây dựng phương pháp định lượng<br /> ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng HPTLC:<br /> - Khảo sát tính thích hợp của hệ thống<br /> sắc ký:<br /> Chấm 5 lần hỗn hợp dung dịch chuẩn<br /> ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lên bản mỏng đã<br /> chuẩn bị sẵn và tiến hành sắc ký theo điều<br /> kiện lựa chọn. Ghi diện tích peak thu được.<br /> Đánh giá độ thích hợp của hệ thống sắc ký<br /> trên cơ sở xác định sai số tương đối của 5<br /> lần chấm mẫu thử phải < 5%.<br /> <br /> * Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký:<br /> <br /> 14<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> - Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ<br /> ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với diện tích<br /> peak.<br /> Pha một dãy 5 dung dịch chuẩn có nồng<br /> độ biến thiên trong khoảng từ 51,1875 g/ml<br /> đến 450,1875 g/ml (đối với ginsenoside Rb1),<br /> 20,0635 g/ml đến 100,3125 g/ml (đối<br /> với ginsenoside Re) và 51,475 g/ml đến<br /> 651,425 g/ml (đối với ginsenoside Rg1).<br /> Dựa trên điều kiện sắc ký đã chọn, chấm<br /> lần lượt 20 l mỗi dung dịch lên bản mỏng<br /> đã được chuẩn bị sẵn. Ghi diện tích peak<br /> thu được.<br /> - Xác định giới hạn định tính, định lượng<br /> của phương pháp:<br /> Chấm 5 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp<br /> ginsenoside Rb1, Re, Rg1 có các nồng độ<br /> tương ứng: 51,1875 g/ml; 20,0625 g/ml;<br /> 51,475 g/ml lên bản mỏng đã chuẩn bị sẵn<br /> và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.<br /> Ghi diện tích peak thu được.<br /> - Khảo sát độ lặp lại của phương pháp:<br /> Dung dịch chuẩn hỗn hợp ginsenoside<br /> Rb1, Re, Rg1 trong ethanol tuyệt đối.<br /> <br /> Hình 1: Phổ HPTLC của hỗn hợp<br /> (Rb1, Re, Rg1) từ 200 - 800 nm (3D).<br /> (Hệ dung môi: chloroform/AcOEt/MeOH/<br /> H2O = 15/40/22/10).<br /> Trên sắc phổ thu được tại bước sóng<br /> 275 nm, các peak tách gọn, cân xứng và<br /> cường độ tín hiệu của peak ginsenoside<br /> Rb1, Re, Rg1 lớn nhất. Vì vậy, chúng tôi<br /> chọn bước sóng này.<br /> * Kết quả khảo sát và lựa chọn pha động:<br /> <br /> Chấm hỗn hợp dung dịch chuẩn ginsenoside<br /> Rb1, Re, Rg1 lên bản mỏng sắc ký đã chuẩn<br /> bị sẵn, tiến hành sắc ký trong điều kiện đã<br /> chọn. Ghi diện tích peak thu được trên sắc<br /> đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng.<br /> Đánh giá độ lặp lại trên cơ sở xác định<br /> độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử<br /> song song.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả khảo sát và lựa chọn điều<br /> kiện sắc ký.<br /> <br /> Hình 2: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn Rb1, Re,<br /> Rg1 ở bước sóng 275 nm (3D).<br /> <br /> * Kết quả khảo sát và lựa chọn bước sóng<br /> xác định ginsenoside Rb1, Re, Rg1:<br /> <br /> (Hệ dung môi: cloroform/AcOEt/MeOH/<br /> H2O = 15/40/22/10).<br /> <br /> 15<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> Kết quả khảo sát hệ dung môi cho thấy: có sự tách rõ rệt giữa các vết ginsenoside Rb1,<br /> Re, Rg1 trong mẫu thử và cho peak gọn. Có thể sử dụng hệ dung môi này để định tính và<br /> định lượng các ginsenoside.<br /> 2. Kết quả xây dựng phƣơng pháp định lƣợng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng<br /> HPTLC.<br /> * Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký:<br /> Bảng 1: Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký.<br /> DIỆN TÍCH PEAK (AU)<br /> STT<br /> <br /> Ginsenoside Rb1<br /> <br /> Ginsenoside Re<br /> <br /> Ginsenoside Rg1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 187,1300<br /> <br /> 82,5000<br /> <br /> 300,4500<br /> <br /> 2<br /> <br /> 175,2300<br /> <br /> 79,4600<br /> <br /> 292,4900<br /> <br /> 3<br /> <br /> 198,8100<br /> <br /> 76,8400<br /> <br /> 320,2500<br /> <br /> 4<br /> <br /> 186,2600<br /> <br /> 74,0200<br /> <br /> 328,6200<br /> <br /> 5<br /> <br /> 190,0300<br /> <br /> 80,0200<br /> <br /> 318,0900<br /> <br /> 187,4920<br /> <br /> 78,5680<br /> <br /> 311,9800<br /> <br /> SD<br /> <br /> 8,4638<br /> <br /> 3,2417<br /> <br /> 14,9617<br /> <br /> RSD%<br /> <br /> 4,5142<br /> <br /> 4,1260<br /> <br /> 4,7957<br /> <br /> Hệ thống có tính thích hợp tốt với độ lệch chuẩn tương đối RSD < 5%, phù hợp với yêu<br /> cầu của Dược điển Trung Quốc (2005), bảo đảm định tính và định lượng ginsenoside Rb1,<br /> Re, Rg1 trong dược liệu.<br /> * Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng:<br /> Bảng 2: Kết quả xác định khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak.<br /> GINSENOSIDE Rb1<br /> DUNG<br /> DỊCH<br /> <br /> GINSENOSIDE Re<br /> <br /> GINSENOSIDE Rg1<br /> <br /> Nồng độ<br /> (g/ml)<br /> <br /> Diện tích pic<br /> (AU)<br /> <br /> Nồng độ<br /> (g/ml)<br /> <br /> Diện tích pic<br /> (AU)<br /> <br /> Nồng độ<br /> (g/ml)<br /> <br /> Diện tích pic<br /> (AU)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 51,1875<br /> <br /> 41,5800<br /> <br /> 20,0629<br /> <br /> 14,3300<br /> <br /> 51,4750<br /> <br /> 54,3400<br /> <br /> 2<br /> <br /> 150,9375<br /> <br /> 239,7667<br /> <br /> 40,1250<br /> <br /> 100,2433<br /> <br /> 200,5750<br /> <br /> 351,7767<br /> <br /> 3<br /> <br /> 250,6875<br /> <br /> 411,3633<br /> <br /> 60,1875<br /> <br /> 178,8933<br /> <br /> 351,4500<br /> <br /> 636,6433<br /> <br /> 4<br /> <br /> 350,4375<br /> <br /> 597,0800<br /> <br /> 80,2500<br /> <br /> 248,66<br /> <br /> 500,5500<br /> <br /> 952,7067<br /> <br /> 5<br /> <br /> 450,1875<br /> <br /> 767,6867<br /> <br /> 100,3125<br /> <br /> 332,4133<br /> <br /> 651,4250<br /> <br /> 1257,9900<br /> <br /> Phương trình hồi quy: ginsenoside Rb1: Y1 = 1,8141X1 - 43,267; ginsenoside Re:<br /> Y2 = 3,9107X2 - 60,467; ginsenoside Rg1: Y3 = 2,0055X3 - 53,455.<br /> Hệ số tương quan r1 = 0,9997; r2 = 0,9994; r3 = 0,9998<br /> <br /> 16<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> Kết quả trên cho thấy: trong khoảng nồng<br /> độ khảo sát, có sự tương quan tuyến tính<br /> giữa nồng độ các ginsenoside Rb1, Re và<br /> Rg1 với diện tích peak với hệ số tương<br /> quan bằng 0,9997; 0,9999 và 0,9998. Các<br /> khoảng tuyến tính của 3 ginsenoside Rb1,<br /> Re, Rg1 phù hợp để định lượng chúng.<br /> <br /> * Kết quả xác định giới hạn định tính, định<br /> lượng của phương pháp:<br /> Xác định giới hạn định tính (LOD) và giới<br /> hạn định lượng (LOQ) dựa trên đáp ứng<br /> của dung dịch chuẩn có nồng độ thấp nhất<br /> trong khoảng tuyến tính và hệ số góc của<br /> đường hồi quy.<br /> <br /> Bảng 3: Kết quả xác định độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu chuẩn có nồng độ 51,1875 g<br /> ginsenoside Rb1 trong ethanol.<br /> STT<br /> Diện tích peak<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 44,4400<br /> <br /> 39,5400<br /> <br /> 43,5400<br /> <br /> 42,2400<br /> <br /> 41,0800<br /> <br /> Thống kê<br /> <br /> Trung bình = 42,1680; SD = 1,9455 RSD = 4,6137<br /> <br /> Bảng 4: Kết quả xác định hệ số góc (a) của đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích peak và<br /> nồng độ ginsenoside Rb1.<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0.9997<br /> <br /> 1.8141<br /> <br /> 43.2670<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0.9987<br /> <br /> 1.8217<br /> <br /> 32.6710<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0.9980<br /> <br /> 1.822<br /> <br /> 35.4880<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0.9991<br /> <br /> 1.7258<br /> <br /> 39.5520<br /> <br /> 5<br /> <br /> 0.9985<br /> <br /> 1.8531<br /> <br /> 35.1450<br /> <br /> Trung b×nh = 1,8073<br /> SD = 0,0480<br /> RSD = 2,6549<br /> <br /> Giới hạn định tính và định lượng của ginsenoside Rb1 là: 3,2368 g/ml và 10,6814 g/ml.<br /> * Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp:<br /> Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại.<br /> <br /> STT<br /> <br /> LƯỢNG<br /> CÂN THỬ<br /> (gam)<br /> <br /> DIỆN TÍCH PEAK (AU)<br /> <br /> HÀM LƯỢNG (%)<br /> <br /> Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside<br /> Rb1<br /> <br /> Re<br /> <br /> Rg1<br /> <br /> Rb1<br /> <br /> Re<br /> <br /> Rg1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1,0333<br /> <br /> 992,8900<br /> <br /> 190,2800<br /> <br /> 1437,0200<br /> <br /> 1,1055<br /> <br /> 0,1241<br /> <br /> 1,4385<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1,0253<br /> <br /> 954,9300<br /> <br /> 177,3400<br /> <br /> 1384,7900<br /> <br /> 1,0733<br /> <br /> 0,1186<br /> <br /> 1,3989<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1,0254<br /> <br /> 958,8700<br /> <br /> 180,3000<br /> <br /> 1390,8800<br /> <br /> 1,0775<br /> <br /> 0,1201<br /> <br /> 1,4047<br /> <br /> 17<br /> <br />