Định lượng metformin trong huyết tương chó bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG<br /> SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> *; Nguyễ<br /> <br /> ă<br /> <br /> *;<br /> <br /> **; ũ uấn Anh**<br /> u ***;<br /> u<br /> **<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> <br /> o<br /> <br /> fortis phenyl (5 µm, 1<br /> <br /> -<br /> <br /> 2HPO4<br /> <br /> - 2 µg/m<br /> 97,<br /> <br /> -<br /> <br /> - 103,29%.<br /> ự<br /> <br /> ể ử<br /> <br /> * ừ<br /> <br /> DETERMINATION OF METFORMIN IN DOG PLASMA BY<br /> HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY<br /> SUMMARY<br /> Metformin is an oral biguanide medication, it has effective in reducing blood glucose levels in<br /> patients with type 2 diabetes. The aim of this study was to validate the analytical method of<br /> metformin in dog plasma by high pressure liquid chromatography (HPLC) with detector UV<br /> (at 232 nm) using ranitidin as an intenal standard. After precipating protein in plasma by<br /> acetonitrile, metformin and internal standard were eluted from fortis phenyl column (5 m, 150 x<br /> 4.6 mm) at 25C with a mobile phase consisting of acetonitrile and 20 mM Na2HPO4 (60:40, v/v),<br /> at a flow rate of 1.0 ml/min. The lower limit of quantitation was 0.05 µg/ml, with a relative standard<br /> deviation of less than 20%. A linear range of 0.05 - 2 µg/ml was established. This HPLC method<br /> was validated with between - batch and within - batch precision of 2.70 - 6.35% and 3.59 - 6.76%,<br /> respectively. The between - batch and within - batch accuracy was 97.43 - 100.96% and 94.62 103.29%, respectively. This validated method is sensitive and repeatable enough to be used in<br /> bioavailability studies in dogs.<br /> * Key words: Metformin; Plasma; HPLC.<br /> * Trường Cao đẳng Dược Phú Thọ<br /> ** Học viện Quân y<br /> *** Trường Đại học Dược Hà Nội<br /> N<br /> N<br /> <br /> 13<br /> <br /> ờ p ả ồ (C esp d<br /> y<br /> ậ b : 12/08/2014; N<br /> N<br /> <br /> ): N uyễ<br /> ă<br /> (<br /> v@<br /> a l.c<br /> yp ả b<br /> đá<br /> á b bá : 16/09/2014<br /> y b bá đ ợc đă : 25/09/2014<br /> <br /> )<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> c ký l ng hi<br /> W<br /> ),<br /> detector UV, máy ly tâm l nh UNIVERSAL<br /> c), t l nh âm sâu DF8514<br /> (Ilshinlab, Hàn Qu c).<br /> <br /> K ô<br /> ô<br /> <br /> P<br /> <br /> ừ<br /> ô<br /> <br /> X<br /> ô<br /> <br /> q<br /> <br /> Ở<br /> q<br /> <br /> ô<br /> ừ<br /> <br /> ng d n c<br /> gi i h<br /> t l thu h<br /> <br /> ặ<br /> [ ]<br /> <br /> [ ]<br /> ì<br /> ọ<br /> <br /> ử<br /> <br /> ặc hi u,<br /> tuy n tính,<br /> [ ]<br /> <br /> 1. K t quả<br /> q<br /> <br /> Q<br /> <br /> ự<br /> F A Vì ậ<br /> <br /> ì<br /> F A<br /> <br /> ì<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> ọ<br /> q<br /> <br /> ự<br /> <br /> Kỳ<br /> ô<br /> <br /> trong huy<br /> <br /> ng metformin<br /> c xây dựng<br /> <br /> ể<br /> ữ<br /> ô<br /> <br /> é<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> N<br /> <br /> p<br /> ng vật thí nghi m, Học vi n Quân y<br /> cung c p.<br /> W<br /> ử<br /> c c t<br /> (HPLC-Merck), các dung môi hoá ch t khác<br /> t tiêu chu n PA.<br /> chu n do Vi n Kiểm nghi<br /> cung c<br /> ữ -250<br /> <br /> 14<br /> <br /> L y 0,2 ml huy<br /> u tr ng/chu n/<br /> thử) cho vào ng ly tâm. Thêm 50 µl dung<br /> d ch ranitidin 7,5 µg/ml (n i chu n) và 50 µl<br /> c c t; 0,4 ml dung d ch acetonitril,<br /> l<br /> , ly tâm 10.000<br /> vòng/phút trong 10 phút. L y d ch n i, lọc<br /> qua màng lọc 0,45 m. D ch lọ<br /> c<br /> ể tiêm s c ký.<br /> K q<br /> ự<br /> ọ<br /> c t fortis phenyl (5 m, 150 x 4,6 mm).<br /> Nhi<br /> c t: 25<br /> ng: acetonitril m Na 2NPO 4<br /> (v/v). T<br /> dòng 1,0 ml/phút. Detector UV<br /> c sóng 232 nm. Thể tích tiêm<br /> m u: 50 l. N i chu n ranitidin có n ng<br /> 7,5 g/ml.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> K<br /> <br /> ả<br /> <br /> nh<br /> <br /> * Độ đặc hiệu - chọn lọc:<br /> Phân tích các m u huy<br /> và n i chu n ranitidin (7,5 µg/ml).<br /> <br /> ng và huy<br /> <br /> n (0,05 µg/ml)<br /> <br /> b<br /> <br /> a<br /> <br /> Hình 1: S<br /> m u huy<br /> <br /> và s<br /> <br /> m u huy<br /> <br /> UV<br /> <br /> ể<br /> <br /> ng (a)<br /> a metformin và ranitidin (b).<br /> <br /> ô<br /> ẳ<br /> <br /> ự<br /> <br /> q<br /> <br /> 3.107 Peak 1<br /> <br /> 322.7<br /> 0.014<br /> <br /> 3.092 Peak 1<br /> <br /> 233.8<br /> <br /> 227.9<br /> <br /> a<br /> <br /> 0.012<br /> <br /> 0.12<br /> <br /> AU<br /> <br /> AU<br /> <br /> 0.08<br /> <br /> 0.008<br /> 0.006<br /> <br /> 0.06<br /> <br /> 0.004<br /> <br /> 0.04<br /> <br /> 0.002<br /> <br /> 0.02<br /> <br /> 391.8<br /> <br /> 0.000<br /> 200.00<br /> <br /> b<br /> <br /> 0.10<br /> <br /> 0.010<br /> <br /> 0.00<br /> <br /> 250.00<br /> <br /> 300.00<br /> <br /> 350.00<br /> <br /> 200.00<br /> <br /> 250.00<br /> <br /> 300.00<br /> <br /> nm<br /> <br /> 350.00<br /> <br /> nm<br /> <br /> Hình 2: Ph h p th c a các pic có tR = 3,33 (ranitidin-a) và tR = 4,26 (metformin-b).<br /> Bảng 1: K t qu kiể<br /> STT<br /> <br /> ặc hi u - chọn lọc c<br /> <br /> DiÖn tÝch pic mÉu tr¾ng (mAU*s)<br /> <br /> Rt từ 3,1 - 3,7 phút<br /> <br /> Tr ng/metformin<br /> <br /> Tr ng/ranitidin<br /> <br /> 1<br /> <br /> 328<br /> <br /> -<br /> <br /> < 20%<br /> <br /> < 5%<br /> <br /> 2<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> < 20%<br /> <br /> < 5%<br /> <br /> 3<br /> <br /> -<br /> <br /> 276<br /> <br /> < 20%<br /> <br /> < 5%<br /> <br /> 4<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> < 20%<br /> <br /> < 5%<br /> <br /> 5<br /> <br /> -<br /> <br /> 652<br /> <br /> < 20%<br /> <br /> < 5%<br /> <br /> 6<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> < 20%<br /> <br /> < 5%<br /> <br /> (“-“: không có tín hiệu đáp ứng)<br /> 15<br /> <br /> Tû lÖ ®¸p øng pic<br /> <br /> Rt từ 4,0 - 4,4 phút<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> ểm trùng v i th<br /> <br /> T i th<br /> <br /> ô<br /> <br /> c<br /> ng pic<br /> c a m u tr<br /> ≤<br /> n tích pic c a<br /> m u chu n (di n tích pic trung bình c a<br /> m u chu n metformin có n<br /> g n<br /> gi i h<br /> i là 3.028 mAu.s).<br /> Trong kho ng th<br /> ừ 3,1 - 3,7 phút,<br /> di n tích pic m u tr<br /> ≤<br /> n tích pic<br /> n i chu n (di n tích pic ranitidin trung bình<br /> 68.279 mAu.s).<br /> ậ<br /> ậ<br /> <br /> metformin<br /> <br /> ảng : ự<br /> <br /> ọ<br /> <br /> ọ<br /> <br /> * Độ tuy n tính:<br /> <br /> 1,0; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 µg/ml<br /> q<br /> ì<br /> ự<br /> X<br /> q<br /> ữ<br /> metformin/<br /> ranitidin.<br /> <br /> ữ<br /> .<br /> <br /> Tªn mÉu<br /> <br /> S1<br /> <br /> S2<br /> <br /> S3<br /> <br /> S4<br /> <br /> S5<br /> <br /> S6<br /> <br /> 1,95<br /> <br /> 0,98<br /> <br /> 0,44<br /> <br /> 0,22<br /> <br /> 0,11<br /> <br /> 0,05<br /> <br /> Di n tích pic metformin (mAU.s)<br /> <br /> 154.984<br /> <br /> 80.963<br /> <br /> 33.419<br /> <br /> 16.853<br /> <br /> 7.086<br /> <br /> 1.549<br /> <br /> Di n tích pic ranitidin (mAU.s)<br /> <br /> 70.580<br /> <br /> 74.280<br /> <br /> 70.937<br /> <br /> 74.727<br /> <br /> 71.096<br /> <br /> 69.951<br /> <br /> T l di n tích chu n/n i chu n<br /> <br /> 2,196<br /> <br /> 1,090<br /> <br /> 0,471<br /> <br /> 0,226<br /> <br /> 0,100<br /> <br /> 0,022<br /> <br /> N<br /> <br /> thực (µg/ml)<br /> <br /> ì<br /> <br /> 2<br /> <br /> i quy (Y = aX + b)*<br /> <br /> N<br /> nh từ<br /> so v i giá tr thực (%)<br /> <br /> ng chu n<br /> <br /> Y = 1,1438X - 0,0303; R = 0,998<br /> 97,32<br /> <br /> 97,94<br /> <br /> 87,67<br /> <br /> 111,82<br /> <br /> 113,60<br /> <br /> 91,65<br /> <br /> (*Y: tỷ lệ diện tích pic metformin/ranitidin; X: nồng độ metformin trong mẫu)<br /> ừ<br /> <br /> q<br /> <br /> -<br /> <br /> ữ<br /> q<br /> <br /> ừ<br /> é<br /> n<br /> <br /> ự<br /> -<br /> <br /> iv in<br /> <br /> th p nh t và 85 - 115% cho các<br /> <br /> còn l i).<br /> *<br /> <br /> i i hạn đ nh ượng dư i (<br /> <br /> X<br /> <br /> Q:<br /> <br /> ng pic c a m u chu n, m u tr ng. Tính n<br /> <br /> chu n từ t l di<br /> ng cách so sánh v i giá tr thực có trong m u.<br /> 16<br /> <br /> -<br /> <br /> metformin trong m u<br /> <br /> ng chu n; từ<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> ảng : K<br /> <br /> q<br /> DiÖn tÝch pic (mAU.s)<br /> <br /> M u chu n (metformin 0,05 µg/ml)<br /> <br /> STT<br /> <br /> M u tr ng<br /> <br /> Metformin<br /> (Rt = 4,3 phút)<br /> <br /> Ranitidin<br /> (Rt = 3,3 phút)<br /> <br /> Rt từ 4,0 - 4,4 phút<br /> <br /> Rt từ 3,1 - 3,7 phút<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2.483<br /> <br /> 68944<br /> <br /> 328<br /> <br /> -<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3.764<br /> <br /> 64835<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 3<br /> <br /> 3.051<br /> <br /> 68432<br /> <br /> -<br /> <br /> 276<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3.742<br /> <br /> 68211<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 5<br /> <br /> 3.471<br /> <br /> 68552<br /> <br /> -<br /> <br /> 652<br /> <br /> X<br /> <br /> 3.302<br /> <br /> SD<br /> <br /> 541<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 16,37<br /> <br /> ặ<br /> ậ<br /> ọ<br /> * Độ đúng độ chính ác trong ngày và<br /> khác ngày:<br /> Ti<br /> ể<br /> 3m cn<br /> LQC (0,15 µg/ml), MQC<br /> (0,4 µg/ml) và HQC (1,5 µ<br /> Q<br /> ậ<br /> ặ<br /> ử<br /> ữ<br /> ự<br /> ọ K<br /> q<br /> 100,96% (n m trong gi i h<br /> é<br /> é<br /> ọ<br /> 17<br /> <br /> * Tỷ ệ thu hồi:<br /> X<br /> nh t l thu h i c a ch t chu n<br /> và n i chu n b ng cách so sánh di n tích<br /> pic c a metformin và ranitidin từ m u huy t<br /> i di n tích pic c a chúng trong<br /> m u ph<br /> ng có ch a cùng n<br /> K<br /> q<br /> l<br /> 90,23% (n = 4), c a metformin các n ng<br /> LQC, MQC và HQC l<br /> t là 70,94%,<br /> ặ<br /> D < 5%<br /> v i n i chu n, RSD < 10% v i chu n).<br /> * Độ n đ nh:<br /> n i chu n g<br /> <br /> q<br /> v i metformin và<br /> <br /> ch chu n g c,<br /> <br /> ể<br /> nhi<br /> -200<br /> <br /> -800<br /> i<br /> i v i ranitidin.<br /> <br />