intTypePromotion=3

Đồ án môn học: Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng

Chia sẻ: Hoang Linh | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:46

0
119
lượt xem
19
download

Đồ án môn học: Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mời các bạn cùng tìm hiểu lịch sử phát triển của enzym cố định; sơ lược về enzym cố định; ứng dụng của enzym cố định;... được trình bày cụ thể trong "Đồ án môn học: Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng". Mời các bạn cùng tìm hiểu và tham khảo nội dung thông tin tài liệu.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Đồ án môn học: Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC Bộ MÔN CÔNG NGHỆ THựC PHẨM C5S CQ ỈO ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM YÀ ỨNG DỤNG SVTH : NGUYỄN BẢO Dư MSSV : 60700443 GYHD : TS. TRẦN BÍCH LAM TP Hồ Chí Minh, 6/2011
  2. NH? N X? T C? A GI? O VI? N H? ? NG D? N ?? ?n m ?n h?c Tp. H?  Ch?  Minh, th? ng  6 n? m 2011 Ch?  k?  c ? a g i? o  vi? n /V ~
  3. /V ?? ?n m ?n h?c LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm  ơn TS. Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ  tôi   trong suốt thời gian thực hiện đồ án. Cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trường   Đại học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức quý báu  của mình giúp tôi hoàn thành đồ án. Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011  Nguyễn Bảo Dư iii ~
  4. ?? ?n m ?n h?c MỤC LỤC TRANG BÌA.................................................................................................................................i NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN.......................................................................ii LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................iii MỤC LỤC...................................................................................................................................iv DANH MỤC HÌNH....................................................................................................................vi DANH MỤC BẢNG...................................................................................................................vi Chương 1: TỒNG QUAN........................................................................................................1 11.Lịch sử phát triển của enzym cố định.....................................................................................1 12.Sơ lược về enzym cố định......................................................................................................2 1.21.Định nghĩa ...................................................................................................................2 1.22.Đặc điểm của enzym cố định.....................................................................................2 1.23.Ưu nhược điểm của enzym cố định ..........................................................................3 1.24.Các phương pháp cố định enzym................................................................................3 1.25.Vật liệu cố định........................................................................................................  5 1.26.Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme ...................................................7 Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH................................................................9 21.ứng dụng trong công nghệ thực phẩm...................................................................................9 2.11.Enzym ß­galactosidase.................................................................................................9 2.1.11.Giới thiệu về enzym ß­galactosidase .................................................................9 2.1.12.Nguồn thu nhận enzym ß­galactosidase................................................................9 2.1.13.Các phương pháp cố định enzym ß­galactosidase...............................................10 2.1.14.ứng dụng của enzym ß­galactosidase cố định....................................................13 2.1.1.41.Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum..................................................13 2.1.1.42.Tổng họp Galacto­Ohgosaccharides (GOSs)................................................16 2.12.Enzym lipase..............................................................................................................17 2.L2.1. Giới thiệu về enzym hpase................................................................................17 2.L2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase...........................................................................17 2.1.23.Các phương pháp cố định enzym lipase.............................................................18 2.1.24.ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm............................20 2.1.2.41.ứng dụng lipase cố định tổng họp các ester có hương trái cây...................20 /V ~
  5. ?? ?n m ?n h?c ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất Mên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ .......................................................................................................  21 2.13.Enzym a­galactosidase (raffinase)..............................................................................23 2.1.31.Giói thiệu về enzym a­galactosidase ..................................................................23 2.L3.2. Nguồn thu nhận enzym a­galactosidase........................................................23 2.L3.3. Cách phương pháp cố định enzym a­galactosidase.......................................23 2.L3.4. ứng dụng của enzym riffinase cố định.........................................................26 22.ứng dụng trong phân tích.....................................................................................................27 2.21.Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor)..........................................................27 2.2.11.Giới thiệu về cảm biến sinh học .......................................................................27 2.2.12.Lịch sử phát triển cảm biến sinh học ................................................................27 2.2.13.Phân loại..............................................................................................................28 2.2.14.Các yếu tố sinh học............................................................................................29 2.2.14.L Enzym ....................................................................................................29 2.2.1.42.Kháng thể ....................................................................................................29 2.2.1.43.Vi sinh vật ...................................................................................................30 2.2.15.Bộ chuyển đổi (transducer)................................................................................30 2.2.1.51.Chuyển đổi điện hóa....................................................................................30 2.2.1.52.Chuyển đổi quang........................................................................................30 2.2.1.53.Chuyển đổi nhiệt.........................................................................................30 2.2.1.54.Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) ......................................30 2.22.Cảm biến sinh học sử dụng L­glutamate oxidase và L­glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm................................31 2.2.21.Giới thiệu............................................................................................................31 2.2.22.Phương pháp thí nghiệm.....................................................................................31 2.2.2.21.Các hóa chất sử dụng ..................................................................................31 2.2.2.22.Sự cố định enzym .......................................................................................31 2.2.223.Điện cực ......................................................................................................32 2.2.2.2A Thử nghiệm ..........................................................................................32 /V ~
  6. ?? ?n m ?n h?c 2.2.2.25.Quá trinh phản ứng .....................................................................................33 2.2.22.Ó. Cấu hình nhiệt độ và pH .......................................................................33 2.2.223.Xác định giá trị Km và Vmax.........................................................................34 2.2.2.2.8. Sự ổn định của màng cố định................................................................35 /V ~
  7. ?? ?n m ?n h?c TÀI   LIỆU   THAM   KHẢO .................................................................................................................................................. 36DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mô hình biosensor.....................................................................................................27 Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L­GLOD­L­GLDH cố định.......32 Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L­GLOD­L­ GLDH cố định trong cảm biến sinh học..................................................................................33 Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 °c có mặt 2mM NADPH và lOmM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L..............’...........................’...............................................................................34 Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL.......................................................34 Hình 2.6: Hoạt túứi của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: L­ GLOD 25U­L­GLDH 143.2U; L­GLOD 25U­L­GLDH 35U; L­GLOD 25U..........................35 DANH MỤC BẢNG • Bảng 1.1: Ưu ­ Nhược điểm của các phưorng pháp cố định enzyme........................................4 Bảng 2.1: Tóm tắt các phưcmg pháp cố định enzym P­galactosidase.......................................13 Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau....................................15 Bảng 2.3: Nguồn vsv thu nhận enzym lipase và tứứi chất enzyme lipase ...............................18
  8. Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c Chương 1: TỔNG QUAN 11.Lịch sử phát triển của enzym cố định [1] ­Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men (EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả  năng thủy phân đường  saccharose. Sau đó  ữên thế  giới xuất hiện nhiều báo cáo về  khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang. Trước năm 1953 chưa có một nghiên cửu nào về   enzym không hòa tan  được ứng dụng vào thực tế. ­Năm 1953,  Grubhofer  và Schleith đã cố  định được một số  enzym  như  carboxy  peptidase, diastase, pepsin  và ribonuclease trên  polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cửu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot. ­Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng khi đưa enzym vào cơ thể. ­Năm 1963,  Bemfeld  và  Wan  đã thí nghiệm thành công việc nhốt các  enzym  như  amylase, trypsin, papain,  ribonuclease vào  gel polyacrylamide. ­Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong  năm này Chang đã triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase. ­Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định. ­Năm 1969, Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku ­ Nhật đã là những người đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzym cố  định vào sản xuất công nghiệp. Theo phương pháp cố  định enzym của các tác giả  người Nhật, enzym aminoacylase của nấm sợi đã được gắn vào DEAE­sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân. ­Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại  enzym: P­galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng hên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex. ­Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase. ­Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thành công trong việc cố  định tế  bào vi sinh vật để  sản xuất L­aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamid. Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao. ­Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến hành sản xuất sữo  fructose từ glucose theo qui  mô công nghiệp. Cho đến nay cổ khoảng 4,5 triệu tấn sừo fructose được sản xuất theo phưong pháp enzym cố định. ­Ngoài sàn phẩm trên, enzym cố định còn được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trường và cả trong y học. 11.Sơ luợc về enzym cố định 1.21.Định nghĩa [1] Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa: ­Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan là enzym được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này có thể tách riêng vói môi trường dung dịch   phàn ứng. Pha enzym không hòa tan trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn. ­Nghĩa rộng: cắc chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ờ trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghĩa /V ~
  9. Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c rộng, enzym không hòa tan bao gồm cả  enzym được cố định vào một chất mang, cả  enzym có trong tế bào sống, chúng được cố  định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần. ­Enzym không hòa tan hay enzym cố định thường là những enzym hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quấ trình gắn này mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan. 1.22.Đặc điểm của enzym cố định [1] Enzym cố định có đặc điểm như sau: ­Hoạt tính của enzym  cố  định thường nhỏ  hơn hoạt tính của  enzym tự  do cùng loại. Sở  dĩ có sự  thay đổi hoạt tính riêng của enzym cố định là do những nguyên nhân sau: •Do  ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự  khác biệt với điện tích của  enzym thì khi gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian của enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết họp giữa enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chứng cùng giảm. •Do enzym bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi. ­Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis ­ Menten nhưng có một số sai khác nhất định: •Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang. • Xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng. ­Enzym cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở của chất mang. ­Enzym cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzym tự do cùng loại. ­Enzym cố định do có chất mang che chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzym tự do. ­Enzym cố  định có thể  tái sử  dụng nhiều lần và dễ  dàng tách ra khỏi cơ  chất một cách dễ  dàng sau phản  ứng và độ  bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do. 1.23.Ưu nhược điểm của enzym cố định [1] Ưu điểm: ­Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài. ­Enzym cố định không lẫn vào trong sàn phẩm cuối của phản  ứng enzym, do đó nó không gây  ảnh hường xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không tốn chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm ­Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang ­ enzym ra khỏi dung dịch cơ chất. ­Enzym cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do. ­Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục. Nhươc điểm: ­Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym. ­Trong đa số trường họp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quấ trình cố định. ­Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà  enzym cố định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều /V
  10. Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c nghiên cứu về cố định enzym cũng như ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. 1.24.Các phương pháp cố định enzym [1] Các phương pháp cố định enzym được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý. /V ~
  11. Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c Bảng 1.1: Ưu ­ Nhược điểm của các phương pháp cổ định enzyme [1] Phương pháp hóa học Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Phương   pháp   gắn   enzym Liên kết giữa enzym và chất mang Hoạt   tính   enzym   có   thể   bị  lên   chất   mang   bằng   liên là Mên kết bền, do đó hạn chế tối  giảm   do   những   biến   đổi   về  kết cộng hóa trị đa   sự   mất   mát   enzym   trong   quá cấu trúc của enzym trong quá  trình phản ứng. trình cố định. Phương pháp gắn các phân Tạo được Mên kết rất bền trước Chi phí cao, thao tác thực hiên  tử   enzym   lại   với   nhau các tấc nhân pH, nhiệt độ... tương đối phức tạp. bằng liên kết cộng hóa trị Thường được dùng phối họp với Hoạt   tính   enzym   có   thể   bị  các phương pháp khác. giảm   do   những   biến   đổi   về  cấu trúc của enzym trong quấ  trình cố định. Phương pháp vật lý Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Thao tấc thực hiện đơn giản. Phương   pháp   gắn   enzym  Do lực tương tác giữa  enzym  lên   chất   mang   bằng   tác  và chất mang yếu nên dễ  xảy  nhân vật lý Điều   kiện   tiến   hành   cố   định  ra   hiện   tượng   nhả   hấp   phụ  enzym  ôn hòa nên không làm mất  trong quá trình sử  dụng enzym  hoạt   tính   của  enzym  trong   quá  cố  định do khuấy trộn hay do   trình cố định. thay đổi nhiệt độ, pH của môi  Có   khả   năng   tái   sử   dụng   chất   trường. mang. Phương pháp nhốt enzym Thao tác đơn giản. Chỉ   thích   họp   cho   phản   ứng  với   cơ   chất   có   khối   lượng   Không   đòi   hỏi   phải   có  các   nhóm phân tử nhỏ. tạo   Mên   kết   nên   phù   họp   với  nhiều loại enzym. Hiệu quả cố định enzym cao. Có   thể   cố   định   đồng   thòi   nhiều     enzym.  Phương pháp hóa  hoc: /V ~
  12. Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c ­Gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị. ­Gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị. Phương pháp vât lý: ­Hấp phụ  enzym lên chất mang bằng liên kết vật lý như  sau: lực mao quản, liên kết ion,  lực Van der Walls.... ­Phương pháp nhốt enzym trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể. 1.2.5. Vật liệu cố định [1] Vật liệu và phương pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả của   quá trình cố định enzym Trong đó, không có đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định nào thích  họp cho tất cả  các loại enzym và cũng không có enzym nào thích họp với tất cả  các loại vật  liệu cố định. Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu hữu  cơ. Vât liêu vô cơ: ­Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn mòn,   phân hủy, nhưng việc gắn với enzym thường khó khăn hơn. ­Một số  chất mang vô cơ  thông dụng như: thủy tinh xốp, cấc oxid kim loại như oxid nhôm,  oxid mangan, oxid magie, Silicagel... Vât liêu hữu cơ: ­Đặc điểm:  chất mang hữu cơ  thường có các nhóm hoạt động hóa học như: ­NH 2, ­  COOH, ­OH, ­SH,... nên dễ kết gắn với  enzym nhưng độ bền với tác động của môi trường   không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công. • Các   t  ư nhiên:     polymer    ­Tinh bột là vật liệu phong phú rẻ  tiền. Tinh bột dùng để  đóng mạch, diethanolamin tinh  bột   đã   được   dùng   làm   chất   mang   cố   định  enzym  như  lipase,  glucoisomerase,  trypsin,  amylase. Nhược điểm của tinh bột là độ  trương kém, thiếu các nhóm chức năng nên khả  năng cố định và hoạt tính enzym còn thấp. Tinh bột thường được ghép copolymer với các  vinyl  monomer  ưa nước như  acrylamide,  acrylic acid  để  cải thiện tính chất cơ  lý, độ  trương nở và tạo các nhóm chức năng trên bề mặt. ­Cellulose  và dẫn xuất của  Cellulose  là CM­cellulose, DEAE­cellulose,  nitrocellulose...  là  những vật liệu rẻ  hơn so với  agarose nhưng lại không đồng nhất, thường chỉ sử dụng  ở  dạng sợi, và dạng tinh thể   (microcrystalline). Cellulose  là vật liệu được nghiên cứu cố  định  enzym  đầu tiên, các quy trình cố  định trên vật liệu này được nghiên cứu khá hoàn   /V ~
  13. Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c chỉnh.  Cellulose  thường được dùng để  hấp thụ, hên kết ion, Mên kết cộng hóa trị  với  enzym hoặc nhốt trong gel. ­Chitin là họp chất được Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin từ năm   1823. Chitin là một polymer sinh học có nhiều triển vọng trong nghiên cứu và  ứng dụng   làm vật liệu cố định enzym và tế bào. Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự  nhiên, chỉ đứng sau cellulose. ­Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là một polymer của các gốc 2­acetoamide­2­ deoxy­ ß­D­glucoza, Mên kết với nhau bởi Mên kết ß­l,4­glycoside. Chitin có trong thành phần cấu  trúc vỏ  của côn trùng, vỏ  tôm cua, sò, vách tế  bào sinh vật,... Chitin  là một vật Mệu có  chứa nhóm chức ­OH và cho Mên kết với  enzym, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ  tốt, dễ  tạo màng.  Chitin  có cấu trúc mạng tinh thể  chặt chẽ, không chỉ  có các Mên kết   hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa cấc lóp với nhau trong mạng tinh thể. Chitin  là một polymer kỵ  nước, độ  trương thấp, diện tích bề  mặt tiếp xúc nhỏ  và bền về  mặt  hóa   học.   Gần  đây  có   rất   nhiều   nghiên   cứu   cố   định   enzym  trên   chitin,   chủ   yếu   bằng   phương pháp hấp thụ và Mên kết công hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde.  Chitin được tìm  thấy trong thành tế  bào của nấm sợi. Nó là chất hữu cơ  chiếm lượng lớn để  hình thành  nên lóp vỏ ngoài của động vật không xương sống (côn trùng, giáp xác...). về mặt cấu trúc,  chitin  có   cấu  trúc  tương   tự   như  cellulose,  điểm   khác   biệt   hóa   học   duy  nhất   là   nhóm  acetamido  ở  vị  trí số  2 trên khung carbon của chitin được thay thế  cho nhóm hydroxyl  (­ OH) ờ ceUulose. ­Chitosan là dẫn xuất của chitin khi được deacetyl hóa trong kiềm mạnh. Chitosan dễ tạo   màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm ­ NH 2. Chitosan có thể  cố  định enzym bằng  phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt   enzym  trong gel chitosan.  Chitosan không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như  acid formic, acid dipic, acid  acetic. Chitosan  là một  polymer  sinh học có trọng lượng phân tử  cao, có các nhóm amin   hoạt động, cấc nhóm hydroxyl có thể tham gia phàn ứng hóa học. ­Anginate, carrageenan, cả hai vật Mệu này tạo gel trong dung dịch CaCỈ2 dùng để nhốt tế  bào, enzym. /V ~
  14. Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c Chất mang protein thường là gelatin, keratin, albumin,... thường có khả  năng dễ  tạo  màng, tạo hạt, nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde; nhược   điểm của nhóm này là thường kém bền, dễ bị nhiễm khuẩn.• Các     polymer tone      ơp:   h ­Cấc polymer tổng họp được sử dụng làm chất mang cố định enzym như polyacrylamide,  polyester,  polyvinylalcohol,  polyvinylacetate,   polyacrylic,  polyhydroxyethylacrylate,  polystyrene,... ­Ưu điểm chung của các polymer tổng họp này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ  với sự  tấn công của vi khuẩn, độ  trương tốt, một số   polymer  có thể  điều chỉnh kích  thước siêu lỗ. ­Nhược điểm là một số  polymer  có giá thành cao, khả  năng tương họp sinh học kém,  không thể phân hủy trong môi trường tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trường. 1.2.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme [1]  Ảnh hưởne của chất  mans     ­Cấc tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ hóa, diện tích, tính háo   nước và kỵ  nước,.. .đều có  ảnh hưởng nhất định đến lượng enzym được liên kết, đến  tính bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzym không tan. ­Bản chất hóa học của chất mang cũng  ảnh hưởng đến khả  năng tạo thành dẫn xuất  enzym và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản   ứng. ­Sự định vị  enzym giúp cho dẫn xuất enzym không tan có tính bền nhiệt cao hơn enzym  tan. ­Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung môi, làm đứt nối  liên kết hydro và liên kết kỵ nước Ảnh hưởns của vH ­Khi lực ion thấp thì nồng độ  H+ gần chất mang tích điện âm cao hơn, còn gần chất   mang tích điện dương cao hơn trong dung dịch. Kết quả là pH tối ưu của enzym liên kết  đồng hóa trị với chất mang tích điện âm sẽ chuyển dịch sang pH kiềm so với enzym hòa  tan, trái lại nếu enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện dương thì  pH tối ưu  sẽ chuyển dịch sang phía pH acid. ­Khi lực ion lớn thì điện tích của chất mang được trung hòa bởi các ion trái dấu và  pH tối  ưu của enzym cố định gần giống enzym hòa tan.  Ảnh hưởne của  enzyme     Theo Poltorak, một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ của enzym cố định là 
  15. Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c sự tương tác protein­protein giữa các phân tử enzym đã được liên kết. Trong mọi trường họp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự  tăng lượng enzym được kết họp trên một đơn vị diện tích chất mang. 'J  /N/  /%/
  16. Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c Ảnh hưởne của phươns pháp cố đinh ­Khi cố định bằng phương pháp hấp phụ vật lí, các  enzym ít bị thay đổi cấu trúc không gian   do đó ft ảnh hường đến hoạt tính. Nhưng do phương pháp này sử dụng các liên kết yếu như  liên kết kị nước, liên kết hydro,... nên enzym dễ bị giải hấp phụ. ­Khi cố định bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị sẽ có độ ổn định cao khi sử dụng dưói   các điều kiện như nhiệt độ, pH, có khả năng chống chịu cao đối với sự ảnh hường của các   dung môi hữu cơ và các tác nhân vật lí khác. Tuy nhiên, liên kết cộng hổa trị sẽ làm thay đổi  mạnh mẽ cấu trúc không gian của  enzym nên hoạt tính của enzym cố định thường bị giảm đi  đáng kể. ­Khi cố  định bằng phương pháp bao gói, quá trình hoạt động của  enzym phụ  thuộc vào hai  yếu tố chính là kích thước chất mang polyme và trọng lượng của phân tử cơ chất. Hai yếu tố  này sẽ làm giảm tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác. Hơn nữa, cùng  với hoạt tính xúc tác cao của  enzym sẽ làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản   phẩm của dung dịch và chất mang chứa enzym cố định. Điều này làm cho các thông số công  nghệ thay đổi, đó là điều cần để ý khi thiết lập quy mô của quá trình. Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 21.ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 2.11.Enzym p­galactosidase 2.1.11.Giói thiệu về enzym Ịỉ­galactosỉdase [2] Enzym P­galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đường lactose thành các monomer là glucose và galactose. Việc sử dụng P­galactosidase để thủy phân lactose trong sữa  và whey là một trong những  ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế  biến thực phẩm và các   sàn phẩm từ sữa. Enzym này có thể được sử  dụng dưới dạng hòa tan hoặc dạng cố định nhưng  dạng hòa tan chỉ có thể  sử  dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng cố định có lợi thế  hon là có thể sử dụng tốt cho cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục. Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân  lactose  với  enzym  tự  do, nhưng  việc sử  dụng enzym P­galactosidase cố  định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm năng   của nó. 2.1.12.Nguồn thu nhận enzym p­galactosỉdase [2] Enzym P­galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi sinh vật, thực vật, và động vật. Tuy nhiên, tính chất của  enzym  được thu nhận từ  các nguồn khấc  nhau có sự  khác nhau rõ rệt.  Enzym  thu nhận từ  nguồn thực vật và động vật có giá trị  kinh tế  /V
  17. Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c thấp, nhưng thu nhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ưu thế như dễ dàng xử lí thu nhận, tốc độ  nhân giống vi sinh vật cao, năng suất thu nhận sản phẩm cao. Một số vi sinh vật được xem là  nguồn thu nhận tiềm năng của loại enzym này. Bacteria:  Alicyclobacỉllus   acidocaldarìus  subsp,  Rittmannii   Arthrobacter  sp,_Bacittus  acidocaldarỉus,   B.   circulans,   B.   coagulans,   B.   subtilis,   B.   megaterum,   B.   stearothermoph ỉlus,   Bacteriodes   polypragmatus,  Bifidobacterium   bifidum,  B.  infantis,   Clostridium   acetobutylicum,   c.thermosulfurogens,   Corynebacterium   murisepticum,   Enterobacter   agglomerans,E.   cloaceae,   Escherichia coll, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus,L. helviticus, L.   kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus, L. delbrueckii, Leuconostoc citrovorum,   Pediococcus  acidilactỉ,  p.   pento,   Propioionibacterium   shermanii,   Pseudomonas   fluorescens,   Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus   cremoris,  s.  lactis,  s.  thermophius,   Sulfolobus   solfatarius,   Thermoanaerobacter   sp.,Thermus rubus, T. aquaticus, Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris. Fungí: Alternaría alternate, A. palmi, Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A.   Carbonarius, A. Oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis,  Fusarium  monilliforme,   F.   oxysporum,   Mucor   meihei,   M.   pusillus,   Neurospora   crassa,   Penicillum   canescens,   p.   chrysogenum,   p.   expansum,   Saccharopolyspora   rectivergula,   Scopulariapsis   sp,   Streptomyces   violaceus. Yeast: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, s. lactis,  S.fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K.fragüis, K. lactis, K.marxianus. 2.1.13.Các phương pháp cố định enzym ß­galactosidase [2] Phươns pháp hấữ phu vât lý Cấc chất vô cơ  như  nhôm, silic, thủy tinh xốp,  đất sét,   bentonite,...  chất hữu cơ  như  cellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi  ion,... được sử dụng làm chất mang hấp phụ trong   cố định enzym. Hơn nữa có thể xử lí thêm với glutaraldehyde để tăng sự ổn định. Enzym ß­galactosidase  từ  K.  fragilis  và  K. lactis  được cố  định trên chitosan có hoạt độ  riêng 0.9­2.2 u/mg trọng lượng khô của tế  bào. Hoạt tính của enzym được cố định từ  K. fragilis  thì cao hơn nhưng độ ổn định của  enzym cố định từ A. oryzae thì cao hơn 5­14 lần tùy thuộc vào  phương pháp cố định. Khi dùng phương pháp hấp phụ người ta nhận thấy hoạt tính cao nhất thu  được khi dùng enzym từ  nấm men với chất mang là Ostsorb­DEAE. Hơn nữa, sự cố định tối đa  đạt được ở  pH 5.5 và kết quả tối  ưu thu được khi có mặt dung dịch đệm citrate/phosphate trong  suốt   quá   trình   cố   định   /?­galactosidase   từ  E.   coli  bằng   phương   pháp   hấp   phụ   vật   lí   trên  chromosorb­W. Một thiết bị phản ứng mới chứa /?­galactosidase t ừ  B. circulans được cố định trên  màng có gờ làm từ PVC và silica được sử dụng để thủy phân lactose trong sữa gầy. Việc cố định  /V ~
  18. Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c yổ­galactosidase   từ  Bullera  singularis  trên   hạt   Chitopearl  BCW  3510   (970   GƯ/g   nhựa)   bằng  phương pháp hấp phụ đơn giản cũng được thực hiện. Các   nghiên   cứu   về   động   học   của  enzym   ß­galactosidase  từ  Kluyveromces   marxianus   (Saccharomyces) lactis được cố định trên những chất mang khác nhau như  nhôm và  silica đã cho  thấy rằng hoạt tính của enzym cố định phụ vào bản chất hóa học tự nhiên và cấu trúc vật lí của   chất mang. Khi kích thước lỗ của các hạt chất mang tăng thì hoạt tính của enzym giảm mạnh. Sự  cố  định ß­ galactosidase từ  Thermus sp. diễn ra rất nhanh trên PEI­Sepabeads và DEAE­Agarose.   Tuy nhiên, độ mạnh hấp phụ thì cao hơn trong trường họp của PEI­ Sepabeads. Enzym ß­galactosidase từ  B. stearothermophilus chịu nhiệt được cố  định trên chitosan sử  dụng Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng để  thủy phân đường lactose  trong sữa. Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính của enzym ß­galactosidase được cố định  /V
  19. Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c trên   THP   thì   vượt   trội   hơn   so   với   enzym  tự   do   và  enzym  được   cố   định   bằng  glutaraldehyde. Enzym ß­galactosidase được cố  định trên THP cho thấy hoạt tính cao hơn enzym  tự do khi có mặt ion Ca2+ và ổn định trong suốt thời gian bảo quản  ờ  4°c trong 6 tuần, trong khi  enzym tự do bị mất 31% hoạt tính trong cùng điều kiện. Hai phương pháp quy hoạch thực nghiệm  là phương pháp “Response surfacemethodology” (RSM) và “Centre composite design” (CCD) được  dùng để tối ưu sự cố định enzym ß­galactosidase từ  Pisum sativum trên hai vật liệu khung mạng:  Sephadex G­75 và hạt chitosan. Hiệu suất cố  định đạt được 75.66% và 75.19% tương  ứng với   Sephadex G­75 và chitosan. Enzym ß­galactosidase từ A. oryzae được cố định trên một chất mang rẻ tiền concanavalin   A­cellulose. Chế  phẩm  ß­galactosidase  được  hấp phụ  và hên kết chéo bằng Concanavalin A­ cellulose, giúp giữ lại 78% hoạt tính ban đầu. Nhiệt độ tối ưu của enzym cố định tăng từ 50°c lên  60°c. Enzym cố định bằng phương pháp hấp phụ và liên kết chéo giữ được 93% hoạt tính sau 1  tháng bảo quản trong khi enzym tự nhiên chỉ giữ được 63% hoạt tính. Phươns pháp bao eói Khung mạng sử  dựng để  cố  định thường được làm từ  các nguyên liệu như  Ca­alginate,   agar, k­carragenin, polyacrylamide và collagen. Tuy nhiên, một vài khung mạng rắn như than hoạt   tính, ceramic,... cũng có thể dùng để  cố  định. Các loại màng dùng để  nhốt  enzym được sử dụng  phổ biến là nylon, cellulose, polysulfone, và polyacrylmide. Enzym ß­galactosidase  từ  nấm sợi được cố  định trong  gel polyvinyl alcohol  có tính chịu  nhiệt cao hơn enzym tự do, giữ được 70% hoạt tính sau 24h  ở   50°c. Các tế bào K. bulgarìcus có  chứa enzym ß­galactosidase được xử lí với glutaraldehyde được nhốt trong alginate sử dụng dung  dịch BaCỈ2. Cấc hạt alginate thu được sau khi xử lí tiếp theo với polyethyleneimine thì đạt được   độ   ổn định cao.  Enzym ß­galactosidase  của  E. coli  cũng được cố  định trong  gel polyacrylamide  thông qua việc chuẩn bị các dẫn xuất hên kết chéo của enzym với bisimidoesters. Tế bào K. marxianus có chứa lactase hoạt động được nhốt toong gel calcium pectate (CPG)  và toong  gel calcium alginate  (CAG) được làm cứng bằng polyethyleneimine và glutaraldehyde.   Các tế bào được cố định trong CPG đã thủy phân hơn 80% lactose trong quá trình liên tục và bán  hên tục. So sánh các phương pháp cố  định  enzym ß­galactosidase  từ  Thermus aquaticus  cho thấy  rằng việc cố định bằng hên kết chéo sau đó nhốt  enzym toong hạt agarose có thể  cho hiệu suất  hoạt động tốt hơn. Việc nhốt enzym ß­galactosidase từ  A. oryzae trong gel polyvinyl alcohol lạnh  xốp sẽ tăng cường độ ổn định với nhiệt độ, pH, lực ion hơn so với enzym tự do. Khung dạng sợi  được làm từ  alginate và gelatin được bổ  sung chất làm cứng là glutaraldehyde cổ  thể  giữ  được  56% hoạt tính của enzym trong 35 ngày mà không có bất kì sự giảm hoạt tính. ~
  20. Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c Người ta nhận thấy rằng chế phẩm  ß­galactosidase được liên kết chéo bằng canavalin A   có thể  thủy phân lactose vượt trội trong hàng loạt quá trình so với các chế  phẩm khác vì chúng  vẫn giữ  được hoạt tính cao, cụ  thể  là giữ  được 95% hoạt tính sau 7 lần sử  dụng, và giữ  được  93% hoạt tính sau 2 ngày bảo quản ở 4°c.  Phương pháp liên kấ cone      hóa tri     Các phân tử  enzym  liên kết với chất mang thông qua cấc nhóm chức năng không nằm   trong trung tâm hoạt động của enzym như amino, carboxyl, hydroxyl, và sulfydryl. Các nhóm chức  năng trên chất mang thường được hoạt hóa bằng cách sử  dụng các chất hóa học như  cyanogen  bromide, carbodimide, và glutaraldehyde. Enzym từ A. oryzae được cố định trên bột nylon­6 và zeolite. Zeolite thì không lý tưởng vì  lượng liên kết tạo thành ft trong khi đó nylon­6 tạo ra được khung mạng  ổn định. Các dẫn xuất   thu được hoạt hóa bằng diazo hoặc bằng carbodiimide cho thấy hoạt tính cao nhất trong suốt quá   trình cố định enzym trên thủy tinh xốp có phủ lóp glycophase. Enzym  ß­galactosidase  từ  E.  coli  được  cố  định  trên  gelatin  sử  dụng  chất  hoạt  hóa  là  chromium (III) acetate và glutaraldehyde vẫn giữ được tương  ứng 25% và 22% hoạt tính.  Enzym  được cố định trên silica­alumina ổn định hơn enzym tự do ở pH acid. Các dẫn xuất ß­galactosidase cố  định cho thấy nhiều sự cải thiện nhưng hoạt tính khấc  nhau sau khi được tạo điều kiện cho liên kết cộng hóa trị  đa điểm bằng cách  ủ  trong dung dịch  kiềm một thời gian dài, enzym được cố định trên Sepabeads­epoxy­boronic được xem là  ổn định  nhất. Dan xuất tốt nhất rất hoạt động trong việc thủy phân lactose thậm chí ờ 70°c. Gần đây sự liên kết ngang của ß­galactosidase trên các hạt từ tính có nguồn gốc khác nhau  được thực hiện với sự có mặt của glutaraldehyde. Ket quả là hoạt tính của enzym cố định được  tăng lên. Khi cố định ß­galactosidase chịu nhiệt trên Sepabeads để thủy phân lactose người ta nhận  thấy sự   ức chế  enzym do sản phẩm tạo ra giảm, điều này hữu dụng trong việc cải thiện hiệu  suất hoạt động của enzym trong công nghiệp. /V ~

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản