FoxG1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần kinh ở nơron – một cơ chế tiềm năng trong sinh lý bệnh của hội chứng West

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> <br /> FOXG1 THÚC ĐẨY SỰ HÌNH THÀNH CÁC GAI THẦN KINH Ở<br /> NƠRON – MỘT CƠ CHẾ TIỀM NĂNG TRONG SINH LÝ BỆNH CỦA<br /> HỘI CHỨNG WEST<br /> Mai Phương Thảo*, Đỗ Đức Minh**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của sự biểu hiện vượt mức của protein FoxG1 đối với sự hình thành các gai<br /> thần kinh (dendritic spine) ở tế bào thần kinh (neuron) trên mô hình nuôi cấy tế bào.<br /> Đối tượng – Phương pháp: Mô tả hàng loạt ca, nuôi cấy các tế bào thần kinh não chuột.<br /> Kết quả: Biểu hiện vượt mức protein FoxG1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần kinh trên các sợi đuôi gai<br /> của tế bào thần kinh.<br /> Kết luận: Nghiên cứu này góp phần củng cố mối liên quan giữa hội chứng West và protein FoxG1 đồng thời<br /> cũng phần nào làm sáng tỏ cơ chế sinh bệnh của hội chứng West vốn chưa được hiểu biết tường tận.<br /> Từ Khóa: Protein FoxG1, biểu hiện vượt mức, tế bào thần kinh (neuron), sợi thần kinh (neurite), sợi trục<br /> (axon), đuôi gai (dendrite), gai thần kinh (dendritic spine), hội chứng West.<br /> ABSTRACT<br /> FOXG1 PROMOTES THE FORMATION OF DENDRITIC SPINES – A POTENTIAL MECHANISM FOR<br /> WEST SYNDROME PATHOPHYSYOLOGY<br /> Mai Phuong Thao, Do Duc Minh* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016: 24 - 28<br /> <br /> Objective: Evaluating effects of FoxG1 overexpression in the formation of dendritic spines in vitro.<br /> Materials – Methods: Case series report using mouse neuronal culture.<br /> Results: Overexpression of FoxG1 promotesthe formation of dendritic spine.<br /> Conclusion: These findings consolidate the role of FoxG1 in West syndrome pathophysiology which remains<br /> unclear.<br /> Key words: FoxG1 (forkhead box protein G1), overexpression, neuron, neurite, axon, dendrite, dendritic<br /> spine, West syndrome.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ sinh của hội chứng West và protein FoxG1, cụ<br /> thể là khi được tăng cường biểu hiện protein<br /> Các gai thần kinh (dendritic spine) là phần<br /> FoxG1, các nơron thần kinh có khuynh hướng<br /> màng tế bào lồi ra trên sợi đuôi gai thần kinh, là hình thành nhiều sợi thần kinh (neurite) hơn,<br /> nơi tiếp hợp của các xi náp thần kinh, mà chủ đặc biệt là các sợi đuôi gai (dendrite). Forkhead<br /> yếu là các xi náp kích thích (excitatory synapses) box protein G1 (FoxG1) là protein được mã hóa<br /> của vùng vỏ đại não(15). Các gai thần kinh này<br /> từ gen FOXG1 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 14<br /> được hình thành và biến mất nhanh chóng,<br /> (14q12). Đây là protein kiểm soát phiên mã có<br /> thông thường, chúng sẽ được tăng cường hình<br /> vai trò quan trọng trong việc hình thành não bộ<br /> thành tại khu vực có hoạt động điện thế mạnh<br /> trong giai đoạn phôi thai (hình thành não bộ,<br /> với vai trò hỗ trợ các tín hiệu điện thế trong quá<br /> phân vùng não bộ, kiểm soát sự phân bào của<br /> trình dẫn truyền thần kinh(16). Gần đây, chúng tôi<br /> các tế bào đầu dòng thần kinh…)(10,11) và trong<br /> phát hiện được mối liên quan giữa cơ chế bệnh<br /> <br /> * Bộ sinh Sinh lý học, ĐH Y Dược TPHCM ** Trung tâm Y sinh học phân tử, ĐH Y Dược TPHCM<br /> Tác giả liên lạc: TS. Đỗ Đức Minh, ĐT: 0932999989, Email: mdt14284@yahoo.com<br /> 24 Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> giai đoạn trưởng thành (duy trì sự tân tạo các bào/giếng trong đĩa nuôi cấy 24 giếng. Môi<br /> neuron nhằm phục vụ cho các chức năng thần trường nuôi cấy được thay mới mỗi 3,5 ngày.<br /> kinh cao cấp)(6,14). Hội chứng West (West Lenti virus vector<br /> syndrome), được đặt theo tên của bác sĩ người<br /> Lenti virus thế hệ thứ 3 được chuẩn bị theo<br /> anh William James West, là mội hội chứng động<br /> protocol của Follenzi và Naldini bằng cách biến<br /> kinh hiếm gặp ở trẻ em và trẻ nhũ nhi. Tần suất<br /> nạp các plasmid khung của virus và các plasmid<br /> mắc bệnh ở trẻ mới sinh vào khoảng 1/2000 đến<br /> mang bộ gen cần biểu hiện vào tế bào<br /> 1/4000(8). Biểu hiện lâm sàng của hội chứng West<br /> HEK293T(7). Sau 24 – 48 giờ, đem môi trường<br /> gồm có tam chứng: động kinh, bất thường trên<br /> nuôi cấy tế bào ly tâm 100.000g để thu các virion<br /> EEG đột ngột, lan tỏa với hình ảnh sóng cao<br /> và hòa tan virion trong PBS. Nồng độ virion<br /> không đồng dạng (hypsarrhythmia) đặc trưng<br /> được định lượng bằng RT-PCR(13).<br /> và chậm phát triển trí tuệ. Các biểu hiện lâm<br /> sàng này có thể giải thích bằng tình trạng tăng Miễn dịch huỳnh quang<br /> hoạt động điện quá mức ở não bộ(3, 5). Như đã mô Tế bào nuôi cấy được cố định bằng dung<br /> tả ở trên, các gai thần kinh sẽ được tăng cường dịch paraformaldehyt 4% trong 20 phút. Sau đó,<br /> hình thành tại khu vực hoạt động điện thế các tế bào được ủ với dung dịch blocking (1X<br /> mạnh, vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu PBS, 10% FBS, 1mg/ml BSA và 0.1% Triton X100)<br /> này nhằm khảo sát sự thay đổi của mật độ gai trong 1 giờ, kháng thể 1 được ủ qua đêm ở nhiệt<br /> thần kinh trên các sợi đuôi gai của các tế bào độ 4oC, và kháng thể 2 được ủ trong 2 giờ ở nhiệt<br /> thần kinh khi chúng được tăng cường biểu hiện độ phòng. Cuối cùng, các tế bào được nhuộm với<br /> protein FoxG1. dung dich DAPI (4’,6’-diamino-2-phenylindone)<br /> ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.<br /> Phân tích và xử lý hình ảnh<br /> Động vật thực nghiệm<br /> Hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi<br /> Dòng chuột CD1 wild-type (wt) được dùng<br /> Confocal Leica vật kính 63X và sau đó được xử<br /> trong nghiên cứu này được nuôi dưỡng và phát<br /> lý bằng phần mềm GIMP 2.6 và Image J để phân<br /> triển tại cơ sở động vật của viện SISSA, Trieste-<br /> tích. Các gai thần kinh sẽ được đếm số lượng và<br /> Italy.<br /> chia cho diện tích bề mặt của sợi đuôi gai để thu<br /> Nuôi cấy tế bào thần kinh được thông số mật độ gai thần kinh trên một<br /> Mô não chuột 16.5 ngày tuổi sẽ được cắt nhỏ điện tích sợi đuôi gai.<br /> trong vòng 5-8 phút trong dung dịch lạnh chứa Phân tích thống kê<br /> 1X PBS-0,6% glucose-0,1% DNaseI. Các mẫu này<br /> Các thí nghiệm đều được thực hiện lặp lại<br /> sau đó được ủ với dung dịch trypsin nồng độ<br /> ít nhất 3 lần. Kết quả được kiểm định bằng t-<br /> 1mg/ml trong 5 phút. Dung dịch trypsin được<br /> test và được cho là có ý nghĩa thống kê khi trị<br /> trung hòa bằng FBS 10%, các mẫu mô lớn sẽ lắng<br /> số p < 0,05.<br /> xuống đáy ống nghiệm sau 5 phút và được tách<br /> bỏ, phần tế bào trong dung dịch phía trên sẽ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> được thu và đếm số lượng. Cuối cùng các tế bào FoxG1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần<br /> này sẽ được nuôi cấy trong môi trường dành<br /> kinh trên các nơron<br /> riêng cho nơron: 1:1 Neurobasal A, 1X Glutamax<br /> Để đánh giá tác động của FoxG1 trên sự<br /> (Gibco), 1X yếu tố B27 (Invitrogen), 0,5mM<br /> hình thành các gai thần kinh, chúng tôi phân<br /> glutamine, 25μM β-Mercaptoethanol, 1X<br /> lập các tế bào thần kinh từ phôi chuột 16,5 ngày<br /> Penicillin/Streptomycin (Gibco), 10 pg/ml<br /> tuổi và sau đó gây nhiễm các tế bào này với<br /> fungizone (Gibco) với mật độ ban đầu là 3*105 tế<br /> <br /> <br /> Thần kinh 25<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> phức hợp các vector lenti virus như hình 1. Mỗi ở các nơron khi các tế bào này tăng cường hoạt<br /> vector virus sẽ được dùng để gây nhiễm với hệ động điện(9).<br /> số là 8 (MOI=8, trong đó MOI: Multiplicity of<br /> infection), nghĩa là dùng 8 virion để gây nhiễm<br /> 1 tế bào. Để có thể kích hoạt và bất hoạt gen<br /> FoxG1 vào bất kì thời điểm nào trong quá trình<br /> thí nghiệm, chúng tôi sử dụng kĩ thuật<br /> TetON(2). Trong kĩ thuật này, FoxG1 sẽ không<br /> được biểu hiện trực tiếp dưới sự tác động của<br /> Hình 2: Tóm tắt quy trình thực hiện nghiên cứu<br /> promoter ptα1 mà sẽ được kích hoạt gián tiếp<br /> qua promoter TRE (tetracycline respone Cuối cùng các tế bào này sẽ được nhuộm<br /> element), promoter TRE lại chịu sự kiểm soát miễn dịch huỳnh quang với Map2 (nhằm đánh<br /> của phức hợp ptα1-rtTA. Trong môi trường giá cấu trúc của các sợi đuôi gai) và PSD95 (đánh<br /> nuôi cấy có chứa Doxycycline (dẫn xuất của giá các gai thần kinh) (hình 3).<br /> nhóm tetracycline) thì rtTA sẽ kích hoạt TRE và<br /> từ đó phiên mã gen FoxG1 và ngược lại trong<br /> môi trường không có Doxycycline, quá trình<br /> này sẽ bị bất hoạt. Các tế bào được chia làm 2<br /> nhóm, nhóm được gây nhiễm với vector giúp<br /> tăng biểu hiện protein FoxG1 (phức hợp a-b1)<br /> và nhóm chứng được gây nhiễm với vector<br /> biểu hiện protein PLAP (phức hợp a-b2); một<br /> protein không có hoạt tính sinh học trên tế bào<br /> thần kinh.<br /> Hình 3: Kết quả miễn dịch huỳnh quang các sợi đuôi<br /> gai (MAP2) và các gai thần kinh (PSD95)<br /> Vì hình ảnh thu được từ kính hiển vi<br /> confocal là các hình ảnh 2 chiều, đồng thời do<br /> cấu trúc của các sợi đuôi gai khác nhau, nên<br /> Hình 1: Các vector lenti virus dùng trong nghiên cứu chúng tôi lựa chọn phân tích mật độ của các gai<br /> Sau khi được gây nhiễm, các tế bào này sẽ thần kinh trên một đơn vị diện tích đuôi gai. Từ<br /> được nuôi cấy và biệt hóa trong vòng 5 ngày mà các hình ảnh thu được sau khi chụp với kính<br /> không có doxycyclin (các gen tăng biểu hiện hiển vi confocal, chúng tôi đếm số lượng các gai<br /> protein FoxG1 và PLAP chưa được kích hoạt). thần kinh trên từng sợi đuôi gai, diện tích của<br /> Sau 5 ngày, 2μg/ml Doxycyclin được thêm vào các sợi đuôi gai sẽ được tính bằng phần mềm<br /> môi trường nuôi cấy nhằm kích hoạt sản xuất ImageJ. Như đã được mô tả trước đó, khi ta khử<br /> protein FoxG1 và PLAP ở các tế bào. Đến ngày cực các nơron bằng dung dịch kali clorua, mật<br /> thứ 10 (5 ngày sau khi thêm Doxycyclin), các tế độ các gai thần kinh tăng lên 1,66 lần. Điều đặc<br /> bào ở 2 nhóm FoxG1 và PLAP lại được chia làm biệt là đối với các tế bào được tăng cường biểu<br /> 2 nhóm với 1 nhóm chứng và một nhóm được hiện FoxG1 đơn thuần, mật độ gai thần kinh<br /> kích thích gây khử cực bằng cách thêm vào môi tăng lên 2,63 lần so với các tế bào chứng, và khi<br /> trường nuôi cấy 50mM KCl trong vòng 12 giờ kết hợp kali clorua và tăng biểu hiện protein<br /> (hình 2). Mục đích của việc khử cực này nhằm FoxG1, mật độ gai thần kinh tăng lên đến 3,34<br /> đánh giá khả năng hình thành các gai thần kinh<br /> <br /> <br /> 26 Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> lần (mật độ gai thần kinh của nhóm chứng trung<br /> bình là 0,17±0,03/μm2) (hình 4).<br /> <br /> <br /> Hình 5: Cơ chế phân tử giả thiết để giải thích hiện<br /> tượng FoxG1 thúc đẩy hình thành các gai thần kinh<br /> KẾT LUẬN<br /> Các nơron thần kinh biểu hiện vượt mức<br /> protein FoxG1 hình thành nhiều gai thần kinh<br /> hơn như là một bằng chứng gián tiếp cho thấy<br /> sự tăng cường hoạt động điện thế ở các nơron<br /> này. Từ đó cho thấy protein FoxG1 là một<br /> nguyên nhân tiềm năng trong sinh lý bệnh của<br /> hội chứng West.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Araki S, Eitel JA, Batuello CN, Bijangi-Vishehsaraei K, Xie XJ,<br /> Danielpour D, Pollok KE, Boothman DA, Mayo LD (2010).<br /> TGF-beta1-induced expression of human Mdm2 correlates<br /> with late-stage metastatic breast cancer. J Clin Invest,<br /> Hình 4: Biểu đồ so sánh mật độ gai thần kinh trên<br /> 120(1):290–302<br /> một diện tích đuôi gai ở các thí nghiệm (so với nhóm 2. Brancaccio M, Pivetta C, Granzotto M, Filippis C, Mallamaci<br /> chứng không khử cực bằng kali clorua và không tăng A (2010). Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote<br /> neuronogenesis. Stem Cells Dayt Ohio, 28(7):1206–1218<br /> cường biểu hiện FoxG1) 3. Chugani HT, Shields WD, Shewmon DA, Olson DM, Phelps<br /> ME, Peacock WJ (1990). Infantile spasms: I. PET identifies focal<br /> BÀN LUẬN cortical dysgenesis in cryptogenic cases for surgical treatment.<br /> Ann Neurol, 27(4):406–413<br /> Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi có thể<br /> 4. Colledge M, Snyder EM, Crozier RA, Soderling JA, Jin Y,<br /> kết luận rằng việc tăng cường biểu hiện FoxG1 Langeberg LK, Lu H, Bear MF, Scott JD (2003). Ubiquitination<br /> trên tế bào thần kinh sẽ thúc đẩy sự hình thành regulates PSD-95 degradation and AMPA receptor surface<br /> expression. Neuron, 40(3):595–607<br /> các gai thần kinh nhiều hơn so với các tế bào 5. Desguerre I, Pinton F, Nabbout R, Moutard ML, N’Guyen S,<br /> thần kinh thông thường. Kết quả này như là một Marsac C, Ponsot G, Dulac O (2003). Infantile spasms with<br /> bằng chứng gián tiếp cho thấy sự tăng cường basal ganglia MRI hypersignal may reveal mitochondrial<br /> disorder due to T8993G MT DNA mutation. Neuropediatrics,<br /> hoạt động điện của các nơ ron thần kinh được 34(5):265–269<br /> tăng biểu hiện protein FoxG1 và từ đó cho thấy 6. Fasano CA, Phoenix TN, Kokovay E, Lowry N, Elkabetz Y,<br /> Dimos JT, Lemischka IR, Studer L, Temple S (2009). Bmi-1<br /> mối liên quan giữa tình trạng lặp đoạn trên<br /> cooperates with Foxg1 to maintain neural stem cell self-<br /> nhiễm sắc thể số 14 mang gene FOXG1 và hội renewal in the forebrain. Genes Dev, 23(5):561–574<br /> chứng West. Cơ chế phân tử của việc thúc đẩy 7. Follenzi A, Naldini L (2002). HIV-based vectors. Preparation<br /> and use. Methods Mol Med, 69:259–274<br /> hình thành các gai thần kinh bởi FoxG1 được 8. Hrachovy RA, Frost JD (1989). Infantile spasms. Pediatr Clin<br /> kiến nghị như hình 5, trong đó FoxG1 ức chế các North Am, 36(2):311–329<br /> protein pSmad (pSmad2,3), các protein pSmad 9. Kim TK, Hemberg M, Gray JM, et al (2010). Widespread<br /> transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature,<br /> này cần thiết cho sự hình thành protein Mdm2 465(7295):182–187<br /> để 1 lần nữa ức chế PSD95 là một protein rất 10. Martynoga B, Morrison H, Price DJ, Mason JO (2005). Foxg1 is<br /> required for specification of ventral telencephalon and region-<br /> quan trọng trong việc hình thành và duy trì sự<br /> specific regulation of dorsal telencephalic precursor<br /> ổn định của các gai thần kinh(1,4, 12). Bước tiếp theo proliferation and apoptosis. Dev Biol, 283(1):113–127<br /> chúng tôi sẽ đào sâu con đường tín hiệu này 11. Muzio L, Mallamaci A (2005). Foxg1 confines Cajal-Retzius<br /> neuronogenesis and hippocampal morphogenesis to the<br /> nhằm hiểu biết rõ hơn về vai trò phân tử của dorsomedial pallium. J Neurosci Off J Soc Neurosci,<br /> FoxG1 trong hôi chứng West. 25(17):4435–4441<br /> <br /> <br /> <br /> Thần kinh 27<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> 12. Rodriguez C, Huang LJ, Son JK, McKee A, Xiao Z, Lodish HF 15. Spruston N (2008). Pyramidal neurons: dendritic structure and<br /> (2001). Functional cloning of the proto-oncogene brain factor-1 synaptic integration. Nat Rev Neurosci, 9(3):206–221<br /> (BF-1) as a Smad-binding antagonist of transforming growth 16. Yuste R (2013). Electrical compartmentalization in dendritic<br /> factor-beta signaling. J Biol Chem, 276(32):30224–30230 spines. Annu Rev Neurosci, 36:429–449<br /> 13. Sastry L, Johnson T, Hobson MJ, Smucker B, Cornetta K<br /> (2002). Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA<br /> and marker expression methods. Gene Ther, 9(17):1155–1162<br /> Ngày nhận bài báo: 24/11/2015<br /> 14. Shen L, Nam HS, Song P, Moore H, Anderson SA (2006). Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015<br /> FoxG1 haploinsufficiency results in impaired neurogenesis in<br /> the postnatal hippocampus and contextual memory deficits. Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016<br /> Hippocampus, 16(10):875–890<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 28 Chuyên Đề Nội Khoa II<br />