Giải trình tự gen vùng đích phát hiện đột biến dị hợp tử mới trên gen TGM1 gây bệnh vảy da cá ở một bệnh nhi tại Việt Nam: Báo cáo ca bệnh

GIẢI TRÌNH TỰ GEN VÙNG ĐÍCH PHÁT HIỆN<br /> ĐỘT BIẾN DỊ HỢP TỬ MỚI TRÊN GEN TGM1<br /> GÂY BỆNH VẢY DA CÁ Ở MỘT BỆNH NHI TẠI<br /> VIỆT NAM: BÁO CÁO CA BỆNH<br /> Trần Vân Khánh1, Lương Hoàng Long1, Diệp Minh Quang2, Đinh Thị Lan Oanh2,<br /> Nguyễn Đình Tưởng2, Phạm Vân Anh2, Ngô Kim Ngân2, Bùi Văn Tuấn2<br /> <br /> TÓM TẮT NGHIÊN CỨU<br /> Khái quát: Bệnh vảy da cá di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (ARCI) là một nhóm<br /> tập hợp các rối loạn của sự sừng hoá da, bao gồm ba thể bệnh là vảy da cá dạng phiến mỏng<br /> (LI), chứng đỏ da dạng vảy da cá bẩm sinh (CIE) và dạng Harlequin. Trong các thể bệnh<br /> trên, LI và CIE có các dấu hiệu lâm sàng tương tự nhau, phần lớn các trường hợp đều do đột<br /> biến trên một số gen, bao gồm gen mã hoá Transglutaminase 1 (TGM1) nằm trên Nhiễm sắc<br /> thể 14q12.<br /> Báo cáo ca bệnh: Báo cáo này phân tích di truyền của một trường hợp sơ sinh nữ được<br /> chẩn đoán bệnh vảy da cá thể (ARCI). Bệnh nhi là con thứ ba trong gia đình, tiền sử gia đình<br /> không ghi nhận bất cứ trường hợp bệnh có kiểu hình tương tự. Bệnh nhi được sinh ra với<br /> biểu hiện đặc trưng dạng Collodion baby. Chẩn đoán trước sinh không phát hiện bất thường.<br /> Tại thời điểm của nghiên cứu này, lớp da Collodion đã được thay thế bằng lớp da sừng hoá<br /> dày với các vảy da tối màu, kết tạo mảng. Giải trình tự gen vùng đích với panel 56 gen thực<br /> hiện bởi kỹ thuật Giải trình tự gen thế hệ mới, đột biến được phát hiện sau đó được kiểm<br /> chứng bằng kỹ thuật Sanger. Chúng tôi đã tìm thấy 3 đột biến dị hợp tử trên gen TGM1:<br /> c.968G>A(p.Arg323Gln), c.1756C>T(p.Gln586Ter) và c.2185G>A(p.Glu729X). Trong đó,<br /> đột biến c.968G>A(p.Arg323Gln) đã được báo cáo trước đây, hai đột biến còn lại là đột biến<br /> mới. Theo sự hiểu biết của chúng tôi thì hai biến thể này chưa được từng công bố trước đây.<br /> Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành phân tích di truyền phả hệ 3 đời của ca bệnh này nhằm<br /> nhận biết tính di truyền của các đột biến trên.<br /> <br /> 1<br /> Đại Học Y Hà Nội<br /> 2<br /> Bệnh viện Sản Nhi tỉnh Quảng Ninh<br /> Chịu trách nhiệm chính: Trần Trọng Kiểm. Email: kiemthuytb@gmail.com <br /> Ngày nhận bài: 15/01/2019; Ngày phản biện khoa học: 22/02/2019; Ngày duyệt bài: 28/02/2019<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) I 71<br />  NGHIÊN CỨU<br /> <br /> <br /> <br /> Kết luận: Hiểu biết được các đột biến gen này cho phép xác định người mang đột biến từ<br /> đó có ích cho việc tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh hoặc chẩn đoán di truyền tiền làm<br /> tổ cho các đối tượng có nguy cơ mắc rối loạn này.<br /> Từ khoá: Bệnh vảy da cá, ARCI, Giải trình tự gen đích, TGM1, đột biến mới.<br /> <br /> I. GIỚI THIỆU nếu được điều trị bằng các phương pháp làm<br /> Bệnh vảy da cá di truyền lặn trên nhiễm mềm da. Ở thể bệnh LI, màng bọc collodion<br /> sắc thể thường (ARCI) là một nhóm tập hợp được thay thế bằng các mảng sừng da tối<br /> các rối loạn của sự sừng hoá da, bao gồm ba màu, dính. Tật lộn mắt cũng là một dấu hiệu<br /> thể bệnh là vảy da cá dạng phiến mỏng (LI), lâm sàng nổi bật kèm theo tăng sừng hoá của<br /> chứng đỏ da dạng vảy da cá bẩm sinh (CIE) da (dày da lòng bàn tay và chân) cũng là dấu<br /> và dạng Harlequin. Không có một sự tương hiệu thường xuất hiện. Ở thế bệnh CIE, các<br /> quan rõ ràng giữa kiểu gen và kiểu hình trong mảng sừng hoá của da thường nhẹ hơn thể<br /> những bệnh này, các đột biến ở cùng một gen LI, với đa dạng các biểu hiện của chứng đỏ da<br /> và lộn mi mắt.<br /> có thể có các biểu hiện đa dạng về kiểu hình.<br /> Trong ARCI thì các biến thể của gen<br /> LI và CIE: mặc dù được xem xét là hai<br /> TGM1 được xác nhận là có tần suất xuất<br /> biến thể khác nhau của bệnh vảy da cá tuy<br /> hiện phổ biến hơn so với các gen khác [2].<br /> nhiên hai thể này có dấu hiệu lâm sàng và<br /> Trước đây người ta cho rằng chỉ có các đột<br /> kiểu gen trùng lặp nhau tương đối [1]. Phần biến đồng hợp tử mới dẫn tới suy giảm chức<br /> lớn các trường hợp gây ra bởi đột biến trên năng của enzym transglutaminase làm phá<br /> một số gen như TGM1, NIPAL4, ALOX12B, vỡ sự tạo thành lớp vỏ bao bọc tế bào và hậu<br /> ALOXE3, ABCA12, PNPLA1 và CYP4F22. quả là gây nên giảm chức năng của da [3]. Tuy<br /> LI và CIE thường có biểu hiện lúc sinh nhiên, một nghiên cứu gần đây ở Nhật Bản<br /> với dấu hiệu “Màng Collodion”, là một màng cho thấy rằng dạng dị hợp tử kép của một số<br /> da mờ kín bao phủ cơ thể của trẻ sơ sinh và biến thể cũng có thể gây ra các biểu hiện kiểu<br /> thường bong ra sau khi sinh một vài tuần hình nặng nề [8].<br /> Bảng 1. Danh sách panel gen giải trình tự.<br /> No. Gene name No. Gene name No. Gene Name<br /> 1 ABCA12 21 SPINK5 41 DUSP6<br /> 2 ALOX12B 22 ST14 42 FGF17<br /> 3 ALOXE3 23 STS 43 FLRT3<br /> 4 CLDN1 24 TGM1 44 PROKR2<br /> 5 COL7A1 25 KAL1 45 ABHD5<br /> 6 CYP4F22 26 FGRR1 46 PHYH<br /> 7 FLG 27 PROKR2 47 PEX7<br /> <br /> 72 I TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019)<br /> GIẢI TRÌNH TỰ GEN VÙNG ĐÍCH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DỊ HỢP TỬ MỚI TRÊN GEN TGM1<br /> GÂY BỆNH VẢY DA CÁ Ở MỘT BỆNH NHI TẠI VIỆT NAM: BÁO CÁO CA BỆNH<br /> <br /> <br /> <br /> No. Gene name No. Gene name No. Gene Name<br /> 8 ITGA6 28 CHD7 48 ALDH3A2<br /> 9 ITGB4 29 FGF8 49 DDB2<br /> 10 KRT14 30 FGFR1 50 ERCC1<br /> 11 KRT5 31 SPRY4 51 ERCC2<br /> 12 LAMA3 32 PROKR2 52 ERCC3<br /> 13 LAMB3 33 CHD7 53 ERCC4<br /> 14 LAMC2 34 GNRHR 54 ERCC5<br /> 15 MBTPS2 35 KISS1R 55 POLH<br /> 16 NIPAL4 36 TACR3 56 XPA<br /> 17 PLEC 37 GNRH1 57 XPC<br /> 18 PNPLA1 38 KISS1 58 TAC3<br /> 19 SLC27A4 39 WDR11 59 COL17A1<br /> 20 SNAP29 40 IL17RD 60 FGF8<br /> <br /> II. BÁO CÁO CA BỆNH<br /> 2.1. Phương pháp Bảng 2. Thông số giải trình tự NGS.<br /> Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu Number of Genes 60<br /> một ca bệnh sơ sinh và gia đình của bé với Length of target region (bp) 155295<br /> bệnh lý vảy da cá di truyền lặn trên Nhiễm<br /> Coverage of target region (%) 100%<br /> sắc thể thường. Chúng tôi kết hợp giải trình<br /> tự gen vùng đích NGS để phát hiện các gen bị Average depth of target region (X) 354.84<br /> biến đổi (Bảng 1) và sau đó kiểm tra lại bằng Proportion of target region with<br /> kỹ thuật giải trình tự gen Sanger với các gen sequencing depth more than 30X 99.90%<br /> nhận từ kết quả phân tích NGS. (%)<br /> DNA được tách chiết từ mẫu ối máu của Kiểu gen bình thường của TGM1 được<br /> bệnh nhân. DNA sau đó được chia nhỏ ra và tìm thấy tại Ensembl Genome Browser.<br /> được dùng để tạo thư viện, và sau đó được tập Các biến thể được lựa chọn sau đó được<br /> trung vào các vùng mã hoá và cạnh vùng mã giải trình tự theo phương pháp Sanger sử<br /> hóa bằng cách sử dụng các chip đặc biệt, cuối dụng các primers thiết kế bằng phần mềm<br /> cùng được giả trình tự bằng phương pháp Primers3plus. Các exon đích được PCR từ<br /> NGS. Các đột biến điểm, vi mất đoạn thêm mẫu DNA cùng với GoTaq green master mix<br /> đoạn và nhân đoạn dưới 20bp cũng như các (Promega, USA). Các sản phẩm này sau đó<br /> mất đoạn đồng hợp tử ở mức độ exon đều có được chạy trên máy giải trình tự ABI 3500<br /> thể được phát hiện cùng một lúc (Bảng 2) (Life Technologies, USA). Dữ liệu giải trình<br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) I 73<br />  NGHIÊN CỨU<br /> <br /> <br /> <br /> tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit trình mang thai bình thường. Da của bệnh<br /> Công cụ Variant effect predictor (VEP) được nhi khô ráp với các biểu hiện tăng sừng hoá (<br /> sử dụng để tiên đoán khả năng gây bệnh của dày da lòng bàn tay và chân). Da vùng bụng<br /> các biến thể TGM1 tìm thấy. Sử dụng VEP bị nứt. Vùng lưng và thân trên nổi bật bởi các<br /> cùng với Human Genome Assembly GRCh37. mảng vảy da tối màu. Những mảng này cũng<br /> Các miêu tả chi tiết của VEP về đầu vào, xuất hiện ở tay và chân. Bệnh nhi mọc răng<br /> đầu ra và nguyên lý được miêu tả trong phần bình thường. Các bộ phận khác của cơ thể<br /> trích dẫn [4]. Từ kết quả đầu ra chúng tôi lựa không phát hiện bất thường.<br /> chọn điểm Mendelian Clinically Applicable<br /> 3.2. Giải trình tự gen thế hệ mới<br /> Pathogenicity (M- CAP) cho các đột biến sai<br /> nghĩa để hiểu được kết quả của các biến thể. Có 192 biến thể được tìm thấy từ dữ liệu<br /> ban đầu của NGS. Tất các các biến thể này<br /> III. KẾT QUẢ đều được ghi nhận trước đây có liên quan đến<br /> 3.1. Bệnh sử bệnh vảy da cá bẩm sinh. Trong đó có 11 biến<br /> Bệnh nhi được sinh ra trong một gia đình thể có khả năng nhất gây ra bệnh. Cuối cùng<br /> không có kết hôn cận huyết. Bố mẹ của bệnh 3 biến thể được lựa chọn có khả năng cao<br /> nhân kể lại không có ghi nhận bệnh tương nhất gây ra các biểu hiện về kiểu hình, bao<br /> tự trong gia đình. Bệnh nhi được sinh ra với gồm 1 biến thể pathogenic, 1 biến thể likely<br /> hình ảnh đặc trưng của Collodion baby. Quá pathogenic và 1 biến thể VUS.<br /> Ảnh 1: Biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân (a) (b) 2 ngày sau sinh: màng colodion điển<br /> hình kèm theo lộn mi mắt. (c) 3 tuần sau sinh, lớp màng collodion được thay thế bằng<br /> các mảng vảy tối màu<br /> a c<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> b<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 74 I TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019)<br /> GIẢI TRÌNH TỰ GEN VÙNG ĐÍCH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DỊ HỢP TỬ MỚI TRÊN GEN TGM1<br /> GÂY BỆNH VẢY DA CÁ Ở MỘT BỆNH NHI TẠI VIỆT NAM: BÁO CÁO CA BỆNH<br /> <br /> <br /> <br /> 3.3. Giải trình tự Sanger cho các biến thể biến này từ ông nội còn người mẹ nhận đột<br /> của TGM1 biến từ ông ngoại.<br /> Giải trình tự gen Sanger xác nhận 3 biến 3.4. Phân tích Protein của biến thể gen<br /> thể phát hiện bởi NGS. Ba đột biến đó là TGM1<br /> c.968G>A (p.Arg323Gln; Het) taị exon 6 và Có 3 biến thể được tìm thấy bao gồm: 1 biến<br /> c.1756C>T(p.Gln586Ter; Het) tại exon 12 và thể đã được công bố C.968G>A (p.Arg323Gln)<br /> c.2185G>A(p.Glu729X; Het) tại exon 14. và 2 đột biến mới c.1756C>T(p.Gln586Ter)<br /> Tất cả các biến thể này đều nằm trên gen và c.2185G>A(p.Glu729X. Chúng tôi chỉ tập<br /> TGM1. Đột biến c.968G>A đã được báo cáo trung phân tích hai biến thể mới.<br /> trước đây với biểu hiện bệnh. Hai đột biến Công cụ VEP cho thấy rằng biến thể<br /> còn lại chưa được công bố. c.1756C>T là đột biến sai nghĩa ở vùng gen<br /> Chúng tôi sử dụng phương pháp Sanger mã hoá với điể điểm SIFT và Polyphen lần<br /> để kiểm chứng lại các đột biến được miêu lượt là 0.23 và 0.015. Phân tích protein sản<br /> tả ở trên cho các thành viên khác trong gia phầm được mã hoá từ đột biến trên cho thấy<br /> đình bao gồm anh em (Ảnh 3a), bố mẹ và điểm M-CAP là 0.019, với bất cứ biến đổi nào<br /> ông bà (Ảnh 3b). Kết quả: người mẹ mang có điểm M- CAP > 0.5 được cho là có nguy<br /> đột biến dị hợp tử c.968G>A tại exon 6 gen cơ cao gây hại so với protein bình thường [5].<br /> TGM1. Người bố mang hai đột biến dị hợp tử Vì vậy p.Gln586Ter là biến thể có khả năng<br /> c.1756C>T tại exon 12 và c.2185G>A tại exon không gây bệnh chủ yếu trong trường hợp<br /> 14 gen TGM1. Người bố thừa hưởng hai đột này. (ảnh 2b)<br /> Ảnh 2:<br /> (a) the VEP calling of variant c.1756C>T.<br /> (b) M-CAP score of variant c.1756C>T<br /> <br /> <br /> <br /> a<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> b<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) I 75<br />  NGHIÊN CỨU<br /> <br /> <br /> <br /> Ảnh 3a: Kết quả giải trình tự Sanger của các biến thể TGM1.<br /> Panel bên trái thể hiện bố là người mang đột biến c.1756C>T và c.2185G>A. Panel bên phải<br /> thể hiện người mẹ là ngừoi mang gen c.968G>A. Panel ở giữa thể hiện bệnh nhân mang cả 3<br /> đột biến ở dạng dị hợp tử kép.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Với biến thể c.2185G>A, công cụ VEP thể hiện rằng đây là đột biến hình thành bộ ba kết<br /> thúc, kết quả dẫn tới tạo ra 1 protein có kích thước ngắn hơn một protein bình thường.<br /> Ảnh 4: the VEP calling of variant c.1285G>A<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> IV. THẢO LUẬN mang hai đột biến dị hợp tử. Điểm đặc biệt<br /> NGS ngày nay được sử dụng rộng rãi như là người bố dù mang hai đột biến nhưng đều<br /> là một công cụ hiệu quả để chẩn đoán các là đột biến mới và không gây ảnh hưởng tới<br /> bệnh lý di truyền đơn gen. Kết hôn cận huyết chức năng của protein. Bệnh nhân mang cả<br /> làm tăng nguy cơ mắc các bệnh lý di truyền 3 đột biến thể và có lẽ sự kết hợp của 3 biến<br /> lặn trên nhiễm sắc thể thường. thể này ảnh hưởng tới chức năng của protein.<br /> Do đó bệnh nhân có biểu hiện kiểu hình của<br /> Enzym TGM-1 được tìm thấy trong biểu<br /> ARCI. Anh trai của bệnh nhân cũng có kiểu<br /> bì, nơi chịu trách nhiệm cho các liên kết chéo gen tương tự người bố và không mắc bệnh.<br /> của tiền chất của keratin và để định hình lớp<br /> Một điểm thú vị khác nữa là trong quá<br /> bao bọc bên ngoài tế bào. Liên kết này cung trình theo dõi lâm sàng, tác giả nhận thấy<br /> cấp sự mạnh mẽ cơ học và tính ổn định của rằng các dấu hiện trên da như các mảng sừng<br /> lớp biểu bì da. hoá thẫm màu dần dần biến mất và được<br /> Người bố và mẹ của bệnh nhân đều là thay thế bằng lớp da bình thường. Hiện tại<br /> người lành mang gen, trong đó người bố sau sinh 5 tháng, phần da của bệnh nhân hầu<br /> 76 I TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019)<br /> GIẢI TRÌNH TỰ GEN VÙNG ĐÍCH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DỊ HỢP TỬ MỚI TRÊN GEN TGM1<br /> GÂY BỆNH VẢY DA CÁ Ở MỘT BỆNH NHI TẠI VIỆT NAM: BÁO CÁO CA BỆNH<br /> <br /> <br /> <br /> Ảnh 3b: Phả hệ<br /> Mũi tên chỉ vào người bệnh. Phả hệ thể hiện các biến thể của gen TGM1 ảnh hưởng tới một số<br /> thành viên trong gia đình. Người mẹ thừa hưởng gen từ ông ngoại, Người bố nhận gen từ ông<br /> nộ. Tất cả họ đều không có biểu hiện lâm sàng của ARCI<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> như bình thường. Nhóm tác giả cho rằng trường hợp này là một biến thể của ARCI có tên là<br /> Collodion baby tự lành ( Self-healing baby collodion). Cho đến nay chỉ có 1 vài ca bệnh được<br /> báo cáo trên thế giới.<br /> Ảnh 5: Bệnh nhân hiện tại (sau sinh 5 tháng)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) I 77<br />  NGHIÊN CỨU<br /> <br /> <br /> V. KẾT LUẬN là một trong các hạn chế chính để biết chắc<br /> chắn về vai trò của gen TGM1 với gia đình<br /> Dựa vào các kết quả có được chúng tôi cho<br /> này. Cụ thể, chúng tôi chưa làm sáng tỏ được<br /> rằng ARCI ở bệnh nhân này là sự kết hợp của<br /> mối liên quan giữa đột biến c.2185G>A đối<br /> 3 đột biến được thừa hưởng từ bố mẹ. Tất cả<br /> các đột biến góp phần làm giảm chức năng với chức năng của protein. Sự kết hợp của 3<br /> của enzym TGM1 dẫn tới bất thường chức đột biến làm ảnh hưởng tới protein ở mức<br /> năng của lớp ngoài cùng của biểu bì và dẫnđộ cụ thể như thế nào cũng là một câu hỏi<br /> chưa được giải đáp hoàn toàn. Tuy nhiên, dữ<br /> tới bất thường của da và gây biểu hiện bệnh<br /> ARCI. liệu thu nhận được từ nghiên cứu này có vai<br /> trò quan trọng đối với chẩn đoán trước sinh,<br /> VI. GIỚI HẠN CỦA NGHIÊN CỨU phòng ngừa bệnh ở những nhóm, cá nhân có<br /> Nghiên cứu này thừa nhận rằng thiếu các nguy cơ cao và trải đường cho các liệu pháp<br /> phương tiện phân tích chức năng sinh học tương lai về cá thể hoá y học.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO:<br /> 1. Rodríguez-Pazos L, Ginarte M, Vega A, Toribio J. Autosomal recessive congenital<br /> ichthyosis. Actas Dermosifiliogr 2013; 104:270.<br /> 2. Takeichi T, Akiyama M. Inherited ichthyosis: non-syndromic forms. J Dermatol.<br /> (2016) 43:242–51. doi: 10.1111/1346- 8138.13243<br /> 3. Hennies HC, Raghunath M, Wiebe V, Vogel M, Velten F, Traupe H, et al. Genetic<br /> and immunohistochemical detection of mutations inactivating the keratinocyte<br /> transglutaminase in patients with lamellar ichthyosis. Hum Genet. (1998) 102:314–8.<br /> 4. McLaren W, Gil L, Hunt SE, Riat HS, Ritchie GR, Thormann A, et al. The ensembl<br /> variant effect predictor. Genome Biol. (2016) 17:122. doi: 10.1186/s13059-016-<br /> 0974-4<br /> 5. Jagadeesh KA, Wenger AM, Berger MJ, Guturu H, Stenson PD, Cooper DN, et al.<br /> M-CAP eliminates a majority of variants of uncertain significance in clinical exomes<br /> at high sensitivity. Nat Genet. (2016) 48:1581–6. doi: 10.1038/ng.3703<br /> 6. Zhang H, Ericsson M, Westrom S, Vahlquist A, Virtanen M, Torma H. Patients with<br /> congenital ichthyosis and TGM1 mutations overexpress other ARCI genes in the<br /> skin: part of a barrier repair response? Exp Dermatol. (2018) doi: 10.1111/exd.13813.<br /> [Epub ahead of print.<br /> 7. Rasheed M, Karim N, Shah FA, Naeem M. Novel TGM1 mutation in a Pakistani<br /> family affected with severe lamellar ichthyosis. Pediatr Neonatol. (2018) 59:628–9.<br /> doi: 10.1016/j.pedneo.2018.01.003<br /> 8. Takeda M, Nomura T, Sugiyama T, Miyauchi T, Suzuki S, Fujita Y, et al. Compound<br /> heterozygous missense mutations p.Leu207Pro and p.Tyr544C in TGM1 cause a<br /> severe form of lamellar ichthyosis. J Dermatol. (2018) 45:1463–7. doi: 10.1111/1346-<br /> 8138.1467<br /> <br /> 78 I TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019)<br />