Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 6

Chia sẻ: Song Song Cuoc | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:23

Thêm vào BST

Báo xấu

140
lượt xem 57
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chương 6 Chöông 6: CLONING VECTOR CHO E.COLI Ngaøy nay, nhöõng thí nghieäm cô baûn lieân quan ñeán vieäc taïo cloning gene ñöôïc quan taâm. Trong chöông 3,4 vaø 5 chuùng ta ñeà caäp ñeán vaán ñeà laøm theá naøo ñeå coù theå tinh saïch DNA töø phaàn chieát cuûa teá baøo? Laøm theá naøo ñeå phaân töû DNA taùi toå hôïp coù theå ñöôïc taïo ra trong oáng nghieäm? Laøm theá naøo ñeå phaân töû DNA coù theå ñöôïc chuyeån vaøo trong teá baøo soáng? Laøm theá naøo recombinant clones ñöôïc ñaët leân haøng ñaàu? ÔÛ chöông naøy chuùng ta seõ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 6

Chương 6 Chöông 6: CLONING VECTOR CHO E.COLI Ngaøy nay, nhöõng thí nghieäm cô baûn lieân quan ñeán vieäc taïo cloning gene ñöôïc quan taâm. Trong chöông 3,4 vaø 5 chuùng ta ñeà caäp ñeán vaán ñeà laøm theá naøo ñeå coù theå tinh saïch DNA töø phaàn chieát cuûa teá baøo? Laøm theá naøo ñeå phaân töû DNA taùi toå hôïp coù theå ñöôïc taïo ra trong oáng nghieäm? Laøm theá naøo ñeå phaân töû DNA coù theå ñöôïc chuyeån vaøo trong teá baøo soáng? Laøm theá naøo recombinant clones ñöôïc ñaët leân haøng ñaàu? ÔÛ chöông naøy chuùng ta seõ tìm hieåu nhöõng cloning vector ñöôïc caùc nhaø SH phaân töû thöôøng duøng, tìm hieåu veà tính chaát, caùch söû duïng cuûa caùc loaïi cloning vector. Sự đa dạng lớn các lọai vector toàn taïi cuøng vôùi vieäc söû duïng E.Coli nhö laø sinh vaät chuû. Ñieàu naøy khoâng coù gì ngaïc nhieân bôûi vì vai troø chính cuûa vi khuaån ñaõ ñöôïc phaùt hieän trong nghieân cöùu cô baûn hôn 50 naêm qua. Nguoàn thoâng tin phong phuù veà vi sinh, sinh hoïc di truyeàn veà E.Coli ñaõ ñoùng goùp vaøo haàu heát caùc nghieân cöùu chuû yeáu veà caáu truùc vaø chöùc naêng cuûa gene, ñaõ ñöôïc ñöa vaøo vi khuaån naøy nhö laø sinh vaät thöïc nghieäm. Nhöõng naêm gaàn ñaây, vieäc nghieân cöùu taïo doøng gene vaø sinh hoïc phaân töû coù moái quan heä laãn nhau – trôû thaønh 1 thaønh töïu quan troïng trong taïo doøng gen, ñaõ taùc ñoäng kích thích nghieân cöùu. Nhu caàu cuûa vieäc nghieân cöùu thoâi thuùc vieäc phaùt trieån nhieàu cloning vector ngaøy caøng tinh vi vaø phöùc taïp hôn. Chöông naøy chuû yeáu ñeà caäp ñeán nhöõng loaïi cloning vector E.Coli quan troïng vaø coâng duïng ñaëc bieät cuûa chuùng. 6.1) Nhöõng vector taïo doøng döïa vaøo plasmid cuûa E.Coli: Nhöõng vector taïo doøng ñôn giaûn nhaát vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát trong vieäc taïo doøng gene laø nhöõng plasmid cuûa vi khuaån nhoû. Moät soá löôïng lôùn vector plasmid khaù nhau coù theå ñöôïc söû duïng vôùi E.Coli, có töø nhöõng nhaø cung caáp thöông maïi. Chuùng laø söï keát hôïp cuûa vieäc deã daøng tinh saïch vaø ñaëc tính mong muoán nhö laø hieäu quaû chuyeån gene cao, thuaän lôïi cho vieäc choïn löïa maker ñeå chuyeån gene vaø taùi toå hôïp vaø khaû naêng taïo doøng thích hôïp vôùi nhöõng DNA lôùn (leân ñeán 8kb). Haàu heát nhöõng thí nghieäm phoå bieán ñaõ söû duïng 1 hay nhieàu caùc loaïi vector plasmid khaùc nhau. Vector ñaàu tieân ñöôïc phaùt trieån vaø vaãn ñöôïc söû duïng phoå bieán ñeán ngaøy nay laø PBR322, ñaõ ñöôïc trình baøy ôû chöông 5. Ñeå minh hoaï cho nhöõng nguyeân taéc chung cuûa vieäc choïn loïc bieán ñoåi vaø nhaän bieát söï taùi toå hôïp (Tr.95). Chuùng ta baét ñaàu nghieân cöùu plasmid vector E.Coli baèng vieäc tìm hieåu caën keõ PBR322. 6.1.1) Danh phaùp cuûa vector plasmid trong cloning: 1
Chương 6 Teân “PBR322” tuaân thuû theo quy ñònh chuaån cho danh phaùp vector. “P” – chæ ra ñaây laø plasmid. “BR” – mieâu taû thí nghieäm nôi maø vector ñoù ñöôïc xaùc ñònh caáu truùc laàn ñaàu tieân (BR la vieát taéc cuûa 2 nhaø baùc hoïc Bolivar vaø Rodirge nhöõng ngöôøi phaùt trieån PBR322 ). 322 – ñeå phaân bieät plasmid naøy vôùi nhöõng loaïi plasmid khaùc ñöôïc taïo ra trong cuøng 1 ñôït thí nghieäm (1 soá plasmid goïi laø PBR325, PBR327, PBR328, ……). 6.1.2) Ñaëc tính coù lôïi cuûa PBR322: Baûn ñoà di truyeàn vaø tính chất vật lyù cuûa PBR322 giaûi thích taïi sao plasmid laø 1vector taïo doøng phoå bieán. Ñaëc tính höõu duïng ñaàu tieân cuûa PBR322 laø veà kích côõ cuûa noù, ôû chöông 2 noùi roõ raèng 1 vector taïo doøng phaûi nhoû hôn 10kb ñeå traùnh nhöõng vaán ñeà nhö laø DNA bò gaõy trong suoát quaù trình tinh saïch. PBR322 coù kích thöôùc laø 4363bp, đieàu ñoù coù nghóa laø noù khoâng chæ coù theå ñöôïc tinh saïch 1 caùch deã daøng maø noù coøn coù theå xaây döïng ñöôïc phaân töû DNA taùi toå hôïp. Ngay caû khi theâm ñoaïn DNA 6kb thì phaân töû PBR322 taùi toå hôïp vaãn coù kích thöôùc phuø hôïp. 2
Chương 6 Ñaëc tröng thöù hai cuûa PBR322 ñöôïc ñeà caäp trong chöông 5, noù coù mang 2 vò trí gen khaùng khaùng sinh,kháng ampiciline hoaëc tetracyline, coù theå ñöôïc söû duïng nhö laø 1 maker choïn loïc cho nhöõng teá baøo chöùa plasmid. Vaø moãi gen maker coù 1vò trí caét duy nhaát duøng cho thí nghieäm cloning. Vieäc cheøn vaøo DNA môùi trong PBR322 ñöôïc caét bôûi PstI, PvuI hay Scal seõ baát hoaït gen ampR vaø söû duïng 1 trong 8 loaïi enzyme endonuclease giôùi haïn (ñaùng chuù yù laø BamHI vaø HindIII) baát hoaït gen khaùng Tetracyline. Caùc vò trí caét ña daïng naøy coù theå ñöôïc söû duïng cho vieäc baát hoaït do xen ñoaïn, ñieàu ñoù coù nghóa là l PBR322 coù theå söû duïng ñeå clone nhöõng ñoaïn phaân töû DNA coù kieåu ñaàu sole. Thuận lợi thöù ba cuûa PBR322 laø khaû naêng sao cheùp cao, thoâng thöôøng thì coù khoaûng 15phaân töû toàn taïi sau khi bieán naïp teá baøo E.Coli nhöng soá löôïng naøy coù theå taêng leân (khoaûng 1000-3000) baèng söï khuyeách ñaïi plasmid khi coù, söï hieän dieän cuûa chaát öùc cheá söï toång hôïp protein chaúng haïn nhö laø Chloramphenicol. Vieäc nuoâi caáy E.Coli seõ cung caáp 1 löôïng lôùn phaân töû PBR322 taùi toå hôïp coù trieån voïng. 6.1.3) Caùc doøng PBR322: Ñieåm thuaän lôïi ñaùng chuù yù cuûa PBR322 khi laø cloning vector khoâng phaûi ngaãu nhieân. Trong thöïc teá plasmid ñöôïc thieát keá ñeå caáu truùc cuoái cuøng seõ coù tính chaát maø ta mong muoán. Yù töôûng veá caáu truùc cuûa PBR322 ñaõ ñöôïc chæ ra ôû (H 6.2a). 3
Chương 6 H6.2(a) thao tác thiết kế pBR322 Vieäc saûn xuaát PBR322 mang tính thöông maïi thì yeâu caàu nhöõng kyõ thuaät thao taùc DNA ñaày ñuû vaø kheùo leùo ñöôïc trình baøy ôû chöông 4. Toùm taét veà keát quaû thao taùc naøy nhö (H 6.2b )Töø ñoù cho thaáy raèng PBR322 trong thöïc teá bao goàm daãn xuaát töø 3 plasmid khaùc nhau trong töï nhieân. Gen ampR coù plasmid R1 1 loaïi plasmid khaùng khaùng sinh ñieån hình ñaõ tìm thaáy trong quaàn theå E.Coli tö ï nhieân (Tr17). Gen TetR laáy töø R6-S laø 1 plasmid khaùng sinh thöù hai, vaø ñieåm khôûi ñaàu sao cheùp coù nguoàn goác töø PMB1 giuùp söï nhaân leân tröïc tieáp cuûa vector trong teá baøo. PMB1 coù moái quan heä chaët cheõ vôùi saûn phaåm do E.Coli taïo ra laø plasmid ColE1 coù khaû naêng saûn xuaát ra coliein. 6.1.4) Nhöõng cloning vector plasmid E.coli ñieån hình khaùc: PBR322 thì ñöôïc phaùt trieån sau thaäp nieân 1970, nhöõng bài báo ñaàu tieân nghieân cöùu mieâu taû noù ñöôïc xuaát baûn naêm 1977 laø töø ñoù thì nhöõng cloning vector plasmid ñöôïc thieát keá vaø ña soá chuùng laø daãn xuaát töø PBR322, baèng nhöõng thao taùc töông töï ñöôïc toùm taét ôû (H 6.2a). Khoâng theå naøo mieâu taû heát taát caû caùc loaïi vector naøy ñaëc bieät khi chuùng coù nhieàu söï bieán ñoåi, 3 döï aùn sau ñaây seõ chöùng minh cho haàu heát caùc ñaëc tröng quan troïng nhaát cuûa cloning vector plasmid öùng duïng trong kyõ thuaät di truyeàn ngaøy nay. a) PBR327 – Moät plasmid coù soá löôïng sao cheùp cao:(h 6.3a) PBR327 ñöôïc xaây döïng baèng vieäc loaïi boû 1 ñoaïn DNA coù kích thöôùc 1089bp töø PBR322. Söï loaïi boû naøy khoâng aûnh höôûng ñeán ampR vaø tetR nhöng khaû naêng 4
Chương 6 sao cheùp vaø tieáp hôïp cuûa pasmid naøy thì bò thay ñoåi vaø keát quaû laø PBR327 seõ coù 2 ñieåm quan troïng khaùc vôùi PBR322. H6.3 2 plasmid cloning vector Ecoli 1) PBR327 coù 1 soá löôïng sao cheùp cao hôn PBR322, coù khoaûng 30-45 phaân töû cho moãi teá baøo E.Coli. Ñieàu naøy khoâng lieân quan nhieàu ñeán vieäc taêng soá löôïng plasmid maø ta quan taâm, khi maø caû 2 plasmid naøy coù theå khuyeách ñaïi soá löôïng baûn sao lôùn hôn 1000. Tuy nhieân khaû naêng sao cheùp cao cuûa PBR327 trong teá baøo bình thöôøng thì laøm cho vector naøy phuø hôïp hôn neáu muïc ñích cuûa caùc cuoäc thí nghieäm laø nghieân cöùu chöùc naêng cuûa gen ñöôïc clone. Trong nhöõng tröôøng hôïp naøy lượng gen ñoùng vai troø quan troïng, vì gen ñöôïc clone coù nhieàu baûn sao hôn, vieäc tìm ra hieäu quaû cuûa gen trong teá baøo chuû deå phaùt hieän hôn, PBR327 vôùi khaû naêng copy cao vì theá ñoù laø söï löïa choïn toát hôn PBR322 trong vieäc cloning naøy. 2) Vieäc loaïi cuõng nhö phaù huyû khaû naêng tieáp hôïp cuûa PBR322 laøm cho PBR327 laø 1 plasmid khoâng coù khaû naêng tieáp hôïp neân khoâng theå tröïc tieáp chuyeån noù vaøo trong nhieàu teá baøo E.Coli khaùc, ñieàu naøy thì quan troïng cho biological containment (kieåm soaùt sinh học: phöông phaùp phoøng ngöøa ñeå ngaên chaën söï sao cheùp cuûa phaân töû DNA taùi toå hôïp trong vsv 5
Chương 6 trong moâi tröôøng töï nhieân, phoøng ngöøa Sh bao goàm vieäc söû duïng caùc vector vaø sinh vaät chuû ñaõ ñöôïc bieán ñoåi ñeå chuùng khoâng toàn taïi beân ngoaøi phoøng thí nghieäm). Haïn cheá khaû naêng tiếp hợp cuûa phaân töû PBR327 taùi toå hôïp laø giaûi phaùp ñeå ngaên chaën söï laây nhieãm cuûa chuùng vaøo vi khuaån ñònh cö trong ruoät khi coù söï coá kyõ thuaät xaûy ra. Ngöôïc laïi, PBR322 coù theå taêng soá löôïng 1 caùch töï nhieân trong E.Coli veà maët lí thuyeát baèng söï tieáp hôïp neân thöïc teá PBR322 ñöôïc ít söû duïng hôn (maëc duø PBR322 ít phöùc taïp hôn) ñeå giaûm möùc toái thieåu cô hoäi xaûy ra nhöõng vaán ñeà treân. Tuy nhieân PBR327 cuõng coù theå xaûy ra tröôøng hôïp töông töï neáu gene ñöôïc clone chöùa tieàm naêng coù haïi. b) PUC8-plasmid choïn loïc gen Lac: Caùc loaïi vector naøy ñöôïc ñeà caäp ôû chöông 5, khi nhaän bieát söï taùi toå hôïp baèng söï baát hoaït do xen ñoaïn cuûa gen -Galactocidase (Tr 97). pUC8 laø daãn xuaát töø PBR322 maëc duø chæ coøn vuøng khôûi ñaàu sao cheùp vaø gen khaùng ampR. Trình töï nucleotid của gen ampR ñaõ ñöôïc bieán ñoåi khoâng chöùa 1vò trí caét duy nhaát. Taát caû caùc vò trí cloning naøy ñöôïc taäp trung vaøo 1 ñoaïn ngaén cuûa gen lac Z’ chöùa trong pUC8. pUC8 coù 3 thuaän lôïi quan troïng vì theá noù laø 1 trong nhöõng cloning vector phoå bieán nhaát trong E.Coli. Đầu tiên là tính ngaãu nhieân: Trong quaù trình thao taùc xaây döïng pUC8, xaûy ra ñoät bieán ôû ñieåm khôûi ñaàu sao cheùp. Tröôùc khi khuyeách ñaïi thì plasmid naøy coù khoaûng 500-700 baûn sao. Ñieàu naøy là hieäu quaû coù yù nghóa đối với sản lượng saûn löôïng DNA clone coù theå ñaït ñöôïc töø vieäc chuyeån ñoåi vào teá baøo E.Coli vôùi nhöõng plasmid pUC8 taùi toå hôïp. Thuaän lôïi thöù hai :Ta có thể xaùc ñònh phaân töû taùi toå hôïp coù theå thaønh coâng baèng 1 tieán trình ñôn giaûn nhôø vaøo moâi tröôøng agar chöùa ampiciline vaø X-gal (Tr 98). Ñoái vôùi PBR322 vaø PBR327 , söï choïn loïc taùi toå hôïp laø 1 kyõ thuaät goàm nhieàu böôùc ñoøi hoûi caáy töø moâi tröôøng khaùng khaùng sinh naøy sang moâi tröôøng khaùng khaùng sinh khaùc(Tr 96). Vì vaäy thí nghieäm veà cloning vôùi pUC8 chỉ cần một nữa thời gian so vôùi PBR322 hay PBR327. Thuaän lôïi thöù ba cuûa pUC8 laø vieäc taäp hôïp nhöõng vò trí caét giôùi haïn, ñieàu ñoù cho pheùp 1 ñoaïn DNA coù 2 ñaàu sole (Stich end) (1vò trí cuoái EcoRI vaø BamHI ôû vò trí khaùc) ñeå clone maø khoâng caàn coù söï tham gia caùc ñoaïn linker(linker laø chuoãi maõ DNA nhaân taïo, boå sung vaøo caùc ñoaïn phaân töû DNA muïc tieâu nhaèm taïo ra 1vò trí phaân caét haïn cheá cuûa E caét giôùi haïn). (H6.4a). 6
Chương 6 H6.4 plasmid pCU (a) nhóm các vị trí cắt trong gene LacZ’ của pCU8 (b) nhóm các vị trí cắt trong gene LacZ’ của pCU18 (c) chuyển một đọan DNA từ pCU8 đến M13mp8 Nhöõng vector pUC khaùc coù theå keát hôïp nhöõng vò trí caét khaùc nhau vaø taïo neân tính linh ñoäng cho vieäc clone caùc ñoaïn DNA (H.6.4b). Hôn theá nöõa, nhoùm vò trí caét trong những vector này töông töï nhö nhöõng nhoùm trong M13mp (Tr119). DNA ñöôïc clone vaøo laø 1 thaønh phaàn cuûa nhoùm pUC8 coù theå ñöôïc chuyeån tröïc tieáp vaøo M13mp. Baèng kyõ thuaät giaûi trình töï DNA hay söï phaùt sinh ñoät bieán Invitro có thể xác định cấu truc của nó(H 6.4c) (xem trang 193-223 ñeå mieâu taû quaù trình naøy.) c) pG EM3Z-söï dòch maõ Invitro cuûa DNA ñöôïc clone (H.6.5a): 7
Chương 6 .5 H6.5 pGEM3Z (a) sơ đồ của vector pGEM3Z (b) tổng hợp RNA trong invitro gồm các vị trí căt ( EcoRI, …………, HindIII) pGEM3Z raát gioáng vector pUC, noù cuõng mang gene ampR vaø gene lac Z’ vaø chứa caùc nhoùm vò trí caét giôùi haïn, coù kích thöôùc gaàn gioáng nhau. Ñieåm ñaëc tröng cuûa pGEM3Z laø theâm vaøo 2 ñoaïn DNA ngaén, moãi ñoaïn hoaït ñoäng nhö laø 1vò trí nhaän bieát cho vieäc gaén 1 enzyme RNA polymerase, 2 trình töï promotor ñeàu naèm ngoaøi nhoùm caùc vò trí caét và ñöôïc söû duïng cho vieäc chuyeån 1 ñoaïn DNA môùi vaøo trong phaân töû pGEM3Z. Ñeàu naøy coù nghóa laø neáu 1 phaân töû pGEM3Z taùi toå hôïp ñöôïc troän vôùi 1 RNA polymerase thuaàn khieát trong oáng nghieäm thì söï phieân maõ seõ xuaát hieän vaø baûn sao RNA cuûa ñoaïn clone ñöôïc toång hôïp. Ñoaïn RNA ñöôïc taïo ra vaø söû duïng nhö laø mẫu lai (Tr.168) hoaëc ñaùp öùng cho caùc muïc ñích thí nghieäm cuûa vieäc nghieân cöùu veà tieán trình RNA (chuù yù coù söï loaïi boû cuûa caû ñoaïn intron) hay söï toång hôïp protein. Nhöõng promotor ñöôïc mang bôûi pGEM3Z vaø nhöõng vector khaùc cuûa loaïi naøy thì khoâng coù caùc trình töï chuaån ñöôïc nhaän ra bôûi RNA polymerase cuûa E.Coli. Trong khi ñoù 1 trong nhöõng promotor ñaëc hieäu cho RNA polymerase ñöôïc ghi maõ bôûi bacteriophage T7 vaø promotor coøn laïi thì ñaëc hieäu RNA polymerase SP6. Nhöõng RNA polymerase naøy ñöôïc toång hôïp trong suoát quaù trình xaâm nhaäp E.Coli vôùi 1 hay nhieàu loaïi phage vaø chòu traùch nhieäm phieân maõ 8
Chương 6 caùc gene cuûa phage. Chuùng ñöôïc choïn ñeå phieân maõ invitro vì ñoù laø nhöõng enzyme coù hoaït tính cao (Löu yù laø toaøn boä quaù trình xaâm nhaäp phaân giaûi chæ maát 20 phuùt) coù theå toång hôïp 1-2 g RNA moãi phuùt, taïo ra nhieàu hôn so vôùi dùng E.Coli chuaån. 6.2) Cloning vector ñöa vaøo bacteriophage M13: Colning vector coù1 yeáu toá thieát yeáu laø noù phaûi coù phöông tieän sao cheùp trong teá baøo chuû, vôùi yeâu caàu naøy thì vector plasmid phaûi deã ñaùp öùng ngay caû khitrình töï DNA ngaén coù theå hoaït ñoäng nhö laø ñieåm khôûi ñaàu sao cheùp plasmid. Phaàn lôùn nhöõng enzyme caàn cho sao cheùp ñöôïc cung caáp bôûi teá baøo chuû. Nhöõng thao taùc phöùc taïp chaúng haïn nhö laø vieäc taïo ra PBR322 raát laâu (H.6.2a) sao cho caáu truùc cuoái cuøng cuûa noù coù chöùa ñieåm khôûi ñaàu sao cheùp khoâng bò aûnh h öôûng vôùi bacteriophage nhö M13 coù lieân quan ñeán söï taùi taïo thì phöùc taïp hôn nhieàu. Thoâng thöôøng caùc phaân töû DNA phage coù mang nhieàu gen, caàn thieát cho söï sai cheùp bao goàm nhöõng gen ñöôïc ghi maõ cho lôùp voû protein phage vaønhững enzyme sao cheùp chuyeân bieät cuûa phage. Söï thay ñoåi hay laø söï loaïi boû 1 trong nhöõng gen nay seõ laøm hö haïi hay phaù huûy khaû ngaêng sao cheùp cuûa phage, vì vaäy phaân töû DNA phage ít coù cô hoäi thay ñoåi. Noùi chung cloning vector phage khoâng coù söï khaùc bieät ñaùng keå so vôùi nhöõng phaân töû boá meï. Vaán ñeà trong thieát keá cloning vector phage ñöôïc trình baøy khi xem xeùt M13. Boä gen M13 thoâng thöôøng laø 6,4kb, haàu heát boä gen ngöôøi thöôøng chöùa 10 gen ñöôïc gaén keát nhau (H.6.6). H6.6 vị trí gene 1-10 của M13 Moãi gene thì caàn thieát cho söï sao cheùp cuûa phage, ñaây laø trình töï ñôn có 507 nucleotide maø ta coù theå gaén thêm vaøo maø khoâng laøm ñöùt gaõy caùc gene naøy. 9
Chương 6 Thöïc teá vùng này bao goàm ñieåm khôûi ñaàu sao cheùp vaãn coøn nguyeân veïn.Rõ ràng , ôû ñaây cuõng coù chuùt khoù khaên ñeå söûa ñoåi boä gen cuûa M13. Tuy nhieân 1 söï haáp daãn ñaùng ñöôïc löu yù cuûa M13 laø coù theå chöùa theâm 1 phieân baûn DNA ñöôïc clone maïch ñôn (Tr.26) ñaëc ñieåm naøy hoaït ñoäng nhö 1 taùc nhaân kích thích cho söï phaùt trieån cuûa cloning vector M13. 6.2.1) Vieäc hoaøn thieän cloning vector M13mp2: Böùôc ñaàu tieân trong xaây döïng cloning vector M13 laø cheøn theâm gen lac Z’vào trong trình tự liên gene(trình tự khác gene). Việc này sẽ làm tăng các điểm tan trong môi trường X-gal. M13mp1 không chứa một vị trí cắt duy nhất trong gene LacZ’. Tuy nhieân noù chöùa hexanucleotide GGATTG ôû gaàn ñieåm khôûi ñaàu sao cheùp,1 sự thay ñoåi chuoãi nucleotide ñôn seõ laøm cho GAATTG nhö laø 1 vò trí caét bôûi EcoRI. Nhôø vaøo söï ñoät bieán in vitro taïo ra caùc sữa đổi treân. Vaø keát quaû laø taïo ra M13mp2 (H.6.7b) H6.7 (a) cấu trúc của M13mp1 (b) M13mp2 bắt nguồn từ bộ gene của M13 hoang dại , M13mp2 coù 1 söï thay ñoåi ñaùng keå veà gen lac Z’ (boä 3 thöù 6 maõ hoaù cho asparagine thay vì aspatic acid) nhöng enzyme B-galactosidase ñöôïc taïo ra khi M13mp2 xaâm nhieãm teá baøo vaãn coù chöùc naêng toát. 10
Chương 6 M13mp2 laø cloning vector M13 ñôn giaûn nhaát. Ñoaïn DNA ñaàu sticky enh ñöôïc caét bôûi EcoRI coù theå cheøn vaøo vò trí clone vaø taùi toå hôïp laøm ñieåm tan hieän roõ trong môi tröôøng x-gal agar. 6.2.2) M13mp7-Vò trí clone ñoái xöùng: Caùc böôùc tieáp theo trong vieäc phaùt trieån vector M13 là theâm vò trí caét giôùi haïn vaøo gen lac Z’. Vieäc laøm naøy thaønh coâng khi toång hôïp 1 ñoaïn oligonucleotide ngaén trong oáng nghieäm goïi laø polylinker(ñieåm ña taùch doøng). Ñoaïn naøy goàm nhöõng vò trí caét vaø coù nhöõng ñaàu Sticky end ñöôïc caét bôûi EcoRI (H.6.8a), ñoaïn polylinker naøy gaén vaøo vò trí EcoRI cuûa M13mp2 taïo ra M13mp7 (H6.8b) laø 1 vector phöùc taïp hôn vôùi 4 vò trí clone (EcoRI, BamHI, SalI, pstI). H6.8 cấutrúc của M13mp7 (a0 đọan polylinker (b) đọan chèn vào vị trí EcoRI của M13mp2 chú ý rằng vị trí cắt SalI cũng đuợc nhân biết giống AccI và HinCII Ñoaïn polylinker ñöôïc thieát keá ñeå noù khoâng laøm ñöùt gaõy hoaøn toaøn gen lac Z’, vieäc ñoïc thöù töï cuûa gen ñöôïc duy trì suoát ñoaïn polylinker. Maëc duø vector naøy thay ñoåi chöùc naêng nhưng enzyne B- galactosidase vaãn ñöôïc taïo ra. Khi M13mp7 ñöôïc bò phaân caét vôùi caû EcoRI, BamHI, Sal, 1phần hay taát caû caùc ñoaïn polylinker thì ñöôïc caét boû (H6.9a) 11
Chương 6 H6.9 tạo dòng M13mp7( bảng chi tiết ) Trong quaù trình naøy noù seõ taïo 1 ñoaïn DNA môùi, 1 trong 3 vaán ñeà coù theå xuaát hieän: 1) Ñoaïn DNA môùi ñöôïc gaén vaøo. 2) Ñoaïn polylinker töï noái laïi. 3) Vector ñoù töï ñoäng gaén laïi maø khoâng coù söï cheøn theâm ñoaïn DNA môùi. Luùc naøo cuõng vaäy, vieäc gaén ñoaïn DNA môùi haàu nhö seõ ngaên chaën quaù trình toång hôïp ra enzyme B-galactosidase vì theá nhieàu veát tan taùi toå hôïp khoâng maøu leân moâi tröôøng agar X-gal (H.6.9c). Thoâng thöôøng neáu nhö ñoaïn polylinker gaén laïi 1 laàn nöõa M13mp7 ñöôïc caûi thieän, keát quaû coù nhöõng veát tan maøu xanh döông. Nhưng neáu vector töï noái laïi maø khoâng cheøn theâm 1 ñoaïn DNA môùi cuõng nhö khoâng chèn thêm ñoaïn polylinker thì chuyeän gì seõ xaûy ra?. Baát kyø 1vò trí caét naøo ñöôïc söû duïng thì hieän töôïng töï noái vaãn laøm cho gene lacZ’ hoaït ñoäng taïo veát tan maøu xanh. Söï choïn loïc naøy laø rõ ràng bôûi chỉ coù phage M13mp7 taùi toå hôïp taïo ra veát tan khoâng maøu. Thuaän lôïi lôùn cuûa M13mp7 vôùi vò trí cloning ñoái xöùng laø ñoaïn DNA ñöôïc gaén vaøo caû BamHI, SalI,pst coù theå caét töø phaân töû taùi toå hôïp baèng caùch söû duïng EcoRI (H.6.10). 1 vaøi vector cho pheùp ñoaïn DNA ñöôïc phuïc hoài 1 caùch deã daøng. 12
Chương 6 H6.10 DNA được tạo từ phân tử M13mp7 bởi vị trí cắt bên ngòai polylinker 6.2.3 Nhöõng vector M13 phöùc taïp hôn: Nhöõng vector M13 sau naøy thì coù ñoaïn polylinker phöùc taïp hôn gaén vaøo gen lac Z’. Vd: M13mp8 (H.6.11a) noù laø baûn sao cuûa plasmid pUC8 (Tr112) vì laø 1 vector plasmid neân thuaän lôïi cuûa M13mp8 laø noù coù theå gaén ñoaïn nhieàu DNA vôùi 2 ñaàu sticky end khaùc nhau. Ñaëc ñieåm thöù hai ñöôïc cho bieát bôûi M13mp9 (H.6.11b) laø coù polylinker gioáng nhau nhöng coù söï ñaûo ngöôïc veà ñònh höôùng. 1 ñoaïn DNA ñöôïc clone bôûi M13mp8 nếu noù bò caét ở 2 choã vaø khi noù gaén vaøo M13mp9 seõ coù söï ñaûo ngöôïc söï ñònh höôùng (H.6.11c). Ñieàu naøy thì quan troïng trong giaûi trình töï DNA, khi maø trình töï nucleotide ñöôïc ñoïc töø ñieåm cuoái cuûa polylinker trong ñoaïn DNA ñöôïc gaén vaøo (H.6.11d) Chæ khoaûng 400 nucleotide ñöôïc ñoïc trong 1 quaù trình giaûi trình töï , neáu DNA ñöôïc gaén vaøo daøi hôn ñieåm cuoái cuûa ñoaïn ñoù seõ khoâng ñöôïc giaûi trình töï , vaø keát quaû laø khi caét vaø noái vaøo trong vector theá heä cuøng loaøi thì ñoaïn DNA bò thay ñoåi hoaøn toaøn. 1 thí nghiệm giaûi trình töï DNA vôùi vieäc clone môùi seõ cho pheùp xaùc ñònh ñöôïc trình töï nucleotide ôû ñaàu coøn laïi cuûa ñoaïn DNA. Caëp vector M13 khaùc cuûng coù khaû naêng naøy M13mp10/11 vaø M13mp18/19 cuõng gioáng nhö M13mp8/9, chỉ khác về polylinker vaø ñieàu ñoù daãn ñeán vò trí caét cuõng khaùc. 6.2.4) Vector lai plasmid-M13: 1) Maëc duø M13 thì raát höõu duïng cho vieäc tao ra caùc phieân baûn ñoaïn DNA cuûa gen ñöôïc clone, nhöng coù 1 giôùi haïn veà kích thöôùc cuûa ñoaïn DNA này. Thoâng thöôøng thì noù chæ chöùa toái ña 1500bp, maëc duø thænh thoaûng 13
Chương 6 cuõng clone những đọan coù kích côõ laø khoaûng 3kb. Ñeå giaûi quyeát vaán ñeà naøy 1 lượng vector-phagemid ñaõ ñöôïc phaùt trieån töø söï keát hôïp cuûa boä gen M13 vôùi DNA plasmid. Vd: pEMB18 (H.6.12a) ñöôïc taïo baèng vieäc chuyeån vaøo trong pUC8 1 ñoaïn 1300bp cuûa boä gen M13, ñoaïn DNA cuûa M13 chöùa 1 trình töï nhaän bieát enzyme. Ñieàu ñoù laøm bieán ñoåi phaân töû M13 maïch ñoâi bình thöôøng thaønh DNA maïch ñôn vaø cuoái cuøng taïo ra phaân töû phage môùi, daáu hieäu naøy vaãn coù chöùc naêng thaäm chí ñöôïc taùch ra töø phaàn khoâng hoaït ñoäng cuûa genone M13 vì theá maø phaân töû pEMB18 cuõng bieán ñoåi thaønh DNA maïch ñôn ñöa ra ngoaøi döôùi daïng phaân töû phage chöa hoaøn thieän (H.6.12b). H6.12 pEMBL8 là một vector plasmid lai có thể bị biến đổi thành DNA sợi đơn 2) 2. Taát caû ñieàu ñoù laø caàn thieát ñeå söû duïng E.Coli laøm teá baøo chuû trong thí nghieäm cloning pEMB18, vôùi söï xaâm nhieãm cuûa M13 bình thöôøng hoaït ñoäng nhö 1 helper phage(phage bò boû)(1 loaïi phage ñöôïc ñöa vaøo trong teá baøo baèng caùch tieáp hôïp vôùi 1cloning coù lieân quan ñeå cung caáp caùc enzyme.)cung caáp caùc enzyme sao cheùp caàn thieát vaø voû protein phage pEMB18 ñöôïc laáy töø pUC8 coù nhöõng vò trí cloning polylinker trong gen lac Z’ vì theá caùc veát tan taùi toå hôïp coù theå ñöôïc nhaän bieát baèng phöông phaùp chuaån treân moâ tröôøng agar chöùa X-gar. Vôùi pEMB18 thì phieân baûn maïch ñôn cuûa DNA clone coù theå chieàu daøi leân ñeán 10kb. Ñoù laø söï môû roäng veà vieäc söû duïng heä thoáng cloning vector M13. 14
Chương 6 6.3) Nhöõng cloning vector döïa vaøo bacteriophage : Coù 2vaán ñeà caàn phaûi giaûi quyeát tröôùc khi cloning vector döïa treân coù theå ñöôïc phaùt trieån: 1) Phaân töû DNA ñöôïc gia taêng kích thöôùc chæ khoaûng 5% ,ñieån hình laø vieäc theâm vaøo ñoaïn DNA môùi khoaûng 3kb. Neáu toång kích thöôùc cuûa phaân töû nhieàu hôn 52kb thì noù seõ khoâng baùo gói vaøo trong caáu truùc ñaàu cuûa vaø seõ khoâng coù söï xaâm chieám cuûa phaân töû phage. Moät vaøi giôùi haïn veà kích côõ cuûa ñoaïn DNA naøy gaén vaøo 1 vector khoâng bò bieán ñoåi (H.6.13a). H6.13 hai vấn đề cần giải quyết trước khi hòan thành vector cloning lamda (a) giới hạn kích thước của bộ gene lamda có thể đóng gói được (b) DNA lamda có nhiều vị trí nhận biết cho hầu hết tất cả enzyme endonuclase 2) 3) Boä gen quaù lôùn ñeán noãi noù coù nhieàu trình töï nhaän bieát cho haàu nhö moïi enzyme caét endonuclease. Caùc enzyme naøy không ñöôïc söû duïng ñeå taùch 1phaân töû bình thöôøng, cho pheùp gaén vaøo 1 ñoaïn DNA môùi. Vì 1 phaân töû ñöôïc caét thaønh nhöõng ñoaïn nhoû ít coù khaû naêng caûi thieän boä gen sau khi ñöôïc noái laïi. Nhìn nhaän ra nhöõng khoù khaên, ngaïc nhieân laø söï ña dang phong phuù cuûa cloning vector ñaõ ñöôïc phaùt trieån. Nhöõng vector ñöôïc taïo ra vôùi muïc ñích söû duïng ban ñaàu, clone nhöõng ñoaïn DNA lôùn kích 15
Chương 6 thöôùc 5-25kb vaø kích thöôùc naøy thì quaù lôùn ñoái vôùi vector plasmid hay M13. 6.3.1) Nhöõng ñoaïn DNA cuûa boä gen coù theå ñöôïc loaïi boû maø khoâng laøm giaûm khaû naêng soáng cuûa noù: Phöông thöùc höôùng ñeán vieäc phaùt trieån nhöõng cloning vector baèng vieäc khaùm phaù ra nhöõng ñoaïn lôùn vuøng trung taâm cuûa phaân töû DNA coù theå bò di chuyeån maø khoâng aûnh höôûng ñeán khaû naêng xaâm nhieãm cuûa phage vaøo teá baøo E.Coli. Vieäc di chuyeån taát caû hay 1 phaàn cuûa vuøng khoâng caàn thieát ôû giöõa 2 vò trí 20 vaø 35 treân baûn ñoà gen ñöôïc minh hoaï (H2.9). Keát quaû laø daãn ñeán vieäc laøm giaûm kích thöôùc phaân töû xuoáng coøn 15kb. Ñieàu naøy coù nghóa laø nhöõng ñoaïn DNA môùi côõ 18kb coù theå ñöôïc theâm vaøo tröôùc vò trí caét ñeå hoaøn thaønh vieäc ñoùng goùi thì ñaõ ñöôïc tìm hieåu (H.6.14) H.6.14 sơ đồ di truyền của lamda từ các vùng không cần thiết có thể bị bỏ đi mà không ảnh hưởng chu kì sinh tan của phage Vuøng “khoâng caàn thieát” treân thöïc teá thì chöùa nhieàu gen cho söï xaâm nhaäp cuûa prophage vaøo chromosome E.Coli vaø thoaùt ra ngoaøi. 1 boä gen bò loaïi boû thì khoâng coù chu kì tieàm tan vaø coù theå coù chu kì xaâm nhieãm sinh tan. Ñieàu naøy laø 1 phöông tieän khoâng caàn thieát trong chính baûn thaân cloning vector tröôùc khi caùc veát tan ñöôïc hình thaønh. 6.3.2) Söï choïn loïc töï nhieân coù theå ñöôïc söû duïng ñeå phaân laäp bieán ñoåi vaø boû vò trí caét khoâng mong muoán: Maëc duø boä gen bò loaïi boû vuøng khoâng caàn thieát vaø coù nhieàu vò trí nhaän daïng cho haàu heát enzyme caét Endonuclease. Ñaây laø 1 vaán ñeà thöôøng gaëp khi 1vector môùi ñöôïc phaùt trieån neáu chæ 1 hoaëc 2 vò trí caàn cho vieäc loaïi boû thì kyõ thuaät phaùt sinh ñoät bieán in vitro coù theå ñöôïc söû duïng (Tr221). Vd: Vò trí 16
Chương 6 EcoRI, GAATC coù theå ñöôïc chuyeån thaønh GGATTC vaø khoâng ñöôïc nhaän bieát bôûi enzyme naøy. Tuy nhieân söï phaùt sinh ñoät bieán in vitro thì quaù môùi, nhieàu vector ñaàu tieân coøn chöa ñöôïc hoaøn thieän, thaäm chí ngaøy nay cuõng chöa tìm ra phöông tieän hieäu quaû cho vieäc loaïi boû nhieàu hôn vaøi vò trí trong phaân töû DNA ñôn. Thay vaøo ñoù, söï choïn loïc töï nhieân ñöôïc söû duïng ñeå cung caáp söï phaân laäp khi maø noù thieáu vò trí caét khoâng mong muoán. Söï choïn loïc töï nhieân coù theå ñöôïc duøng trong caùc cuoäc thí nghieäm söû duïng E.Coli ñeå taïo ra EcoRI. Haàu heát nhöõng phaân töû DNA xaâm nhieãmvào teá baøo seõ bò phaù huyû baèng enzyme caét endonuclease, tuy nhieân 1 vaøi teá baøo seõ soáng soùt vaø taïo ra nhưng veát tan. Ñaây laø nhöõng phage ñoät bieán laøm maát ñi 1 caùch töï nhieân caùc vò trí EcoRI (H.6.15). Qua vaøi chu trình xaâm nhieãm seõ taïo ra keát quaû laø trong nhieàu phaân töû seõ thieáu taát caû haàu heát caùc vò trí EcoRI. H6.15 sử dụng chọn lọc tự nhiên để phân lập phage lamda thiếu vị trí cắt EcoRI 6.3.3) Nhöõng vector ñöôïc cheøn vaøo thay theá: Vaán ñeà ñöa ra laø söï haïn cheá ñoùng goùi vaø vò trí caét ña daïng ñaõ ñöôïc giaûi quyeát, môû ra 1 höôùng cho vieäc phaùt trieån nhöõng loaïi khaùc nhau cuûa cloning vector döïa treân 2 theá heä ñaàu tieân cuûa vector ñöôïc taïo ra ñoù laø -insertion (caàn thieát cho söï sao cheùp, laø vector coù caáu truùc ñöôïc xaây döïng baèng cloning vector, caùch loaïi boû nhöõng ñoaïn DNA khoâng caàn thieát.) vaø -replacement vector (bacteriophage maø ôû ñoù caùc ñieåm taùch doøng saép ceáp thaønh caùc caëp, do vaäy phaän heä gen naèm ôû giöõa caùc ñieåm.) a) Insertion vector: 17
Chương 6 Vôùi 1 Insertion vector (H.6.16a) 1 ñoaïn lôùn cuûa nhieàu vuøng khoâng caàn thieát seõ ñöôïc loaïi boû vaø 2 ñoaïn caàn duøng seõ noái laïi vôùi nhau. Moät insertion vector sôû höõu ít nhaát 1 vò trí caét ñeå cho DNA môùi coù theå gaén vaøo, kích thöôùc cuûa ñoaïn DNA maø vector coù theå mang noù dó nhieân laø phuï thuoäc vaøo giôùi haïn cuûa vuøng khoâng caàn thieát ñaõ bò loaïi bo.û 2 vector insertion phoå bieán laø: gt10 (H.6.16b) noù coù theå mang 1 ñoaïn DNA môùi leân ñeán 8kb cheøn vaøo vò EcoRI duy nhaát naèm beân trong gen cI (gen öùc cheá ), söï baát hoaït do xen ñoaïn cuûa gen naøy laø cô sôû ñeå nhaän ra söï taùi toå hôïp roõ raøng hôn laø caùc veát tan ñuïc môø. zapII (H.6.16c) coù theå cheøn theâm 1 ñoaïn DNA môùi kích thöôùc khoaûng 10kb vaøo 1trong 6 vò trí caét thuoäc vuøng polylinker baát hoaït cuûa gen lac Z’ ñöôïc mang bôûi vector, söï taùi toå hôïp thì roõ hôn nhöõng veát tan maøu xanh treân moâi tröôøng agar X-agal. H6.16 vector xen đọan lamda chèn một đọan polylinker vài gene LacZ’ ở lamda ZAPII chứa vị trí căt duy nhất. b) Replacement vector: Moät vector thay theá coù 2 vò trí nhaän bieát cho enzyme caét Endonuclease ñöôïc söû duïng trong cloning, nhöõng vò trí khung cuûa vector coù theå thay theá bôûi DNA ñöôïc clone (H.6.17a) thöôøng thì nhieàu ñoaïn coù theå thay theá (hay laø ñoaïn moài trong thuaät ngữ cloning). Mang theâm nhieàu vò trí caét ñeå coù theå caét thaønh nhieàu ñoaïn nhoû vì theá maø noù raát deã daøng töï gaén vaøo trong suoát thöû nghieäm cloning. Những vector thay theá thoâng thöôøng ñöôïc thieát keá ñeå mang nhöõng ñoaïn DNA lôùn hôn laø 18
Chương 6 những vector xen ñoaïn. Söï choïn loïc taùi toå hôïp thì thöôøng döïa vaøo kích thöôùc, vôùi nhöõng vector khoâng taùi toå hôïp thì quaù nhoû ñeå bao goùi ñaàu cuûa phage, 2 vector thay theá phoå bieán laø: WES B’ (H.6.17b) trong noù coù 2 vò trí EcoRI treân ñoaïn ñöôïc thay theá vaø söï choïn loïc taùi toå hôïp döïa treân kích thöôùc. EMBL4 (H.6.17c) noù coù theå mang ñoaïn DNA ñöôïc cheøn vaøo coù kích thöôùc leân ñeán 20kb (theo lyù thuyeát gaàn baèng möùc toái ña) baèng vieäc thay theá khung DNA cuûa bôûi enzyme EcoRI, BamHI, SalI ( caû hai enzyme caét endonuclease ñöôïc söû duïng ñeå loaïi boû caùc ñoaïn nhoài vì theá maø ñoaïn DNA vôùi nhieàu ñaàu sticky end ña daïng ñöôïc clone). Söï choïn loïc taùi toå hôïp vôùi EMBL4 döïa treân nhöõng kích thöôùc hoaëc cuõng coù theå taän duïng kieåu hình spi (Tr102). 6.3.4) Thí nghieäm cloning vôùi vector thay theá : 1 cuoäc thí nghieäm cloning vôùi vector coù theå ñöôïc tieáp tuïc phaùt trieån gioáng nhö ñaõ thöïc hieän vôùi vector plasmid. Phaân töû ñöôïc caét, DNA môùi gaén vaøo noái laïi vaø phaân töû taïo thaønh ñöôïc chuyeån vaøo teá baøo E.Coli khaû bieán ( H.6.18a) thí nghieäm naøy yeâu caàu vector voøng chöùa vò trí cos noái vôùi nhau baèng lieân keát hydro. 19
Chương 6 Maëc du,ø ñaùp öùng ñöôïc nhieàu muïc ñích nhưng quy trình döïa vaøo xaâm nhieãm thì khoâng coù hieäu quaû ñaëc bieät. Moät soá löôïng lôùn phaân töû taùi toå hôïp seõ thu ñöôïc, neáu 1 hay 2 böôùc tinh saïch được öùng duïng. Ñaàu tieân laø tinh saïch 2 nhaùnh cuûa vector khi vector bò phaân caét vôùi enzyme caét giôùi haïn endonuclease, seõ có 1 nhaùnh traùi vaø 1 nhaùnh phaûi. Haàu heát taát caû vector coù nhaùnh traùi daøi hôn nhaùnh phaûi vaø 2 nhaùnh naøy coù theå taùch rôøi vaø ñöôïc tinh saïch baèng maùy li taâm theo gradien theo noàng ñoä ñöôøng.1 phaân töû taùi toå hôïp sẽ được tạo ra, sau khi troän nhieàu ñoaïn DNA ñöôïc clone vôùi nhöõng maãu cuûa nhaùnh traùi vaø nhaùnh phaûi ñaõ ñöôïc chuaån bò. Keát quaû cuûa vieäc noái taïo ra nhieàu ñoaïn truøng laäp gồm: Nhaùnh traùi +DNA+ nhaùnh phaûi (H.6.18b). Neáu DNA xen ñoaïn coù kích thöôùc phuø hôïp thì sau vị trí cos seõ taùch những cấu truùc naøy ñoùng goùi in vitro (Tr99) phage taùi toå hôïp ñöôïc taïo ra trong oáng nghieäm vaø coù theå duøng ñeå xaâm nhaäp E.Coli nuôi cấy. Thoâng thöôøng vieäc ñoùng goùi in vitro cho keát quaû laø taïo ra 1 löôïng lôùn caùc veát tan taùi toå hôïp. 6.3.5) 1 ñoaïn DNA lôùn , caù theå ñöôïc clone söû duïng cod mid: Daïng tinh vi nhaát vaø sau cuøng cuûa vector döïa treân laø codmid .Nó laø daïng lai giöõa 1 phaân töû DNA phage vaø plasmid vi khuaån , vaø noù ñöôïc thieát keá xung quanh laø caùc enzyme ñaõ bieát ñeå ñoùng goùi phaân töû DNA phage vaø trong lôùp voû 20