Giáo trình Công nghệ sinh học động vật

Chia sẻ: Lê Viết Quang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

883
lượt xem 260
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Giáo trình Công nghệ sinh học động vật có kết cấu nội dung chính được trình bày làm 4 chương: Chương 1 Nuôi cấy mô-tế bào động vật, chương 2 Công nghệ hỗ trợ sinh sản, chương 3 Công nghệ tạo dòng vô tính, chương 4 Một số thành tựu điển hình của công nghệ sinh học động vật. Mời các bạn cùng tham khảo giáo trình và nắm nội dung kiến thức cụ thể trong từng chương học.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Công nghệ sinh học động vật

M U I. KHÁI NI M Công ngh Sinh h c (CNSH) (Biotechnology) òi h i s t p h p c a trí tu , k thu t d a trên n n t ng cơ b n c a khoa h c s s ng. ó là k t qu c a vi c ng d ng nh ng nguyên lý khoa h c và công ngh ch t o, s n xu t nguyên v t li u b ng nh ng tác nhân sinh h c, nh m t o ra hàng hóa và d ch v ph c v con ngư i. Công ngh Sinh h c trên ngư i và ng v t (CNSH N& V) là nh ng k thu t CNSH ti n hành ho c ng d ng trên i tư ng ngư i và ng v t. nư c ta, CNSH trên ngư i chưa th c s phát tri n thành m t lĩnh v c c l p, nên thư ng ư c g i chung là Công ngh Sinh h c ng v t (CNSH V). CNSH V có l ch s ti m tàng lâu dài, các ki n th c và s ng d ng sơ khai ã di n ra cách ây 8.000 năm khu v c Tây B c Á, khi con ngư i l n u tiên bi t săn b t các loài ng v t hoang d i v nuôi l y th t, lông, s a…và sau ó thu n hóa chúng làm phương ti n v n chuy n. Cách ây nhi u th p niên, con ngư i ã có nhi u c i ti n m nh m trong chăn nuôi ng v t, bi t ch n l c nh ng cá th kh e m nh, tiêm ch ng phòng ng a b nh, th c hi n nhi u k thu t khác tăng cư ng kh năng sinh s n c a chúng. Tuy nhiên, CNSH V hi n i (d a trên thành t u t bào h c và di truy n h c) ch th t s b t u vào nh ng năm 60 c a th k XX và bùng n trong hai th p k g n ây. II. N N T NG KHOA H C VÀ K THU T II.1. GENOMICS VÀ B GEN NGƯ I II.1.1. Genomics Genomics là lĩnh v c nghiên c u v thành ph n, t ch c, ch c năng và ti n hóa c a thông tin di truy n ch a trong b gen. Ba lĩnh v c chính c a genomics: h gen c u trúc (structure genomics), h gen ch c năng (functional genomics), h gen so sánh (comparative genomics). Genomics ư c xem là tâm i m c a sinh h c, b i m i k t qu t nghiên c u genomics ã, và ang óng góp tích c c vào các lĩnh v c ng d ng như chăm sóc s c kh e con ngư i, nông nghi p, lâm nghi p và nhi u lĩnh v c khác. S phát tri n nhanh chóng c a genomics có s tr giúp c a các ngành khoa h c k thu t khác, ch ng h n các thi t b gi i trình t … Ngoài ra, s “ ua nhau” gi i mã b gen các sinh v t t nh ng năm 1990 v i nhi u quy mô, nhi u m c khi n công vi c này tr nên sôi ng. n nay, có trên dư i 100 loài ư c gi i mã b gen. II.1.2. B gen ngư i Ý tư ng gi i trình t c b gen ngư i ư c ưa ra t các cu c h p ư c t ch c vào nh ng năm 1984-1986 b i Cơ quan Năng lư ng M (U.S. Department of Energy). Chương trình ư c khai trương khi Cơ quan Năng lư ng và Vi n s c kh e M k t h p. Vào cùng th i i m này, vi c gi i trình b gen ngư i cũng ư c b t u Pháp, Anh và Nh t b n. V i xu hư ng này, vi c thành l p T ch c B gen Ngư i (Human Genome Organisation_HUGO) vào mùa xuân năm 1988, ã kéo theo m t s qu c gia khác cùng tham gia chương trình và có óng góp vào k ho ch này, c bi t là c và Trung Qu c. 1
Tháng 6-1988, cu c h p quan tr ng v vi c gi i trình t và l p b n b gen (Genome Mapping và Sequencing Meeting) u tiên ư c t ch c t i Cold Spring Harbor ã ch ng ki n n l c c a k ho ch gi i trình t b gen ngư i c a Celera Genomics (nhóm th hai gi i trình t b gen ngư i do Craig Venter ch trì). Cu c h p ư c xem như là m t i m nh n ban u cho HGP. Nh s phát tri n, h p tác qu c t , nh ti n b c a genomics, cũng như k thu t máy tính, b n phác th o hành ng (working draft) b gen ngư i ã ư c hoàn thành vào 26/6/2000. Tháng 2/2001, các phân tích c a b n phác th o hành ng ư c công b . D án b gen ngư i hoàn thành và tuyên b k t thúc vào ngày 14/4/2003, s m hơn 2 năm H i ngh khoa h c c a NIH k ni m 50 năm chu i xo n kép DNA. Tháng 5-2006, trình t c a NST ngư i cu i cùng ư c công b trên t p chí Nature. M c dù h u h t các bài báo u cho r ng b gen ngư i ã hoàn thành, th t ra n năm 2006, nó v n còn chưa hoàn t t và s m t nhi u năm n a m i có th hoàn thành tr n v n, b i các vùng trung tâm c a m i NST (như centromere) luôn bao g m các trình t DNA l p l i cao, r t khó có th gi i trình t chúng v i k thu t hi n nay. * ng d ng và tri n v ng c a vi c nghiên c u b gen ngư i Các k thu t và công ngh m i, các ti n ư c t o ra t HGP, và nh ng nghiên c u genomics khác, ang có nhi u tác ng m nh lên kh p các ngành c a khoa h c s s ng. M ts ng d ng hi n t i và ti m năng c a vi c nghiên c u b gen: - Thu c phân t (Molecular medicine). - Các ngu n năng lư ng và các ng d ng môi trư ng. - ánh giá r i ro. - Sinh kh o c , nhân lo i h c, ti n hóa và s di cư ngư i. - DNA pháp y (DNA forensic). - Nông nghi p, sinh s n v t nuôi và ch bi n sinh h c. II.2. PROTEOMICS II.2.1. Khái ni m Proteomics là khoa h c nghiên c u proteome. Proteome là toàn b các protein ư c bi u hi n b i c genome. Vì m t s gen mã hóa cho nhi u protein khác nhau, nên kích thư c c a proteome thư ng l n hơn so v i s lư ng gen. Th nh tho ng khái ni m này còn s d ng nh m mô t toàn b protein ư c bi u hi n m t t bào, hay m t mô c bi t nào ó. II.2.2. Các công c c a proteomics Công c u tiên c a proteomics là d li u. Các d li u protein, EST và trình t b gen ư c thu th p t o ra m c l c các protein ư c bi u hi n trong sinh v t. Ch ng h n, d a vào các phân tích t t c trình t mã hóa c a Drosophila, ngư i ta th y có n 110 gen Drosophila mã hóa cho các domain gi ng EGF, và 87 gen mã hóa cho các protein v i các domain xúc tác tyrosine kinase. Theo ó, khi ti n hành proteomics loài này, c n có m t b n li t kê các protein ã bi t, n u nghiên c u g p ph i các thông tin gi i h n, hay các d li u t phương pháp kh i ph không rõ ràng, ngư i ta có th xác nh thành ph n protein t s trùng kh p v i d li u ã có s n này. 2
Công c th hai là kh i ph (Mass spectrometry_MS). Các thi t b MS có nhi u thay i trong th p niên qua, c bi t là nh y. MS có th th c hi n ba ki u phân tích r t c n thi t cho proteomics. Th nh t là, MS cung c p s o lư ng chính xác kh i lư ng phân t c a m t protein nguyên v n như 100 kDa hay hơn. Do ó, phân tích MS có th là cách t t nh t xác nh kh i lư ng phân t (hơn c phương pháp i n di protein trên gel polyacrylamide). MS cũng cung c p s o kh i lư ng chính xác các peptide t quá trình protolytic. D li u t các peptide này ư c tìm ki m tr c ti p, nh m xác nh chính xác protein m c tiêu. Cu i cùng, phân tích MS cũng cung c p các trình t c a peptide t quá trình th y gi i. Các d li u t MS s cung c p chi n lư c rõ ràng (và m nh nh t) trong vi c xác nh protein. Công c th ba là các ph n thu gom, k t h p các d li u MS v i các trình t protein c bi t có s n trong cơ s d li u. Các ph n m m này s l y các d li u MS không ư c gi i thích rõ ràng và k t h p nó v i nh ng trình t cơ s d li u protein, hay EST và trình t b gen v i các thu t toán c bi t. Khía c nh m nh nh t c a nh ng công c này, là chúng cho phép t ng hóa ư c m t lư ng l n các d li u MS, cho các k t h p trình t protein khác nhau. Công c c n thi t th tư là k thu t phân tách protein. S phân tách các protein có hai m c ích trong proteomics. Th nh t, chúng làm ơn gi n các h n h p protein thành các protein ơn l hay các nhóm nh . Th hai, b i chúng cho phép phát hi n các khác bi t trong các m c protein so sánh gi a hai m u, nên k thu t phân tách, nh m phân tích protein s cho phép ngư i ti n hành xác nh ư c các protein c bi t. Thông thư ng, phương pháp i n di protein hai chi u (2D-SDS- PAGE) ư c s d ng trong proteomics. M t s k thu t khác cũng ư c s d ng là 1D-SDS- PAGE, hay s c ký l ng hi u năng cao (high-performance liquid chromatograph_HPLC), các k thu t ch y i n di mao qu n (Capillary electrophoresis_CE), s c ký ái l c… II.2.3. Các ng d ng c a proteomics K thu t proteomics th t s có tác ng l n v i b n ng d ng chính. Khai thác (Mining): xác nh các protein có trong m t m u t cơ s d li u gen. Ghi nh n s bi u hi n c bi t (Protein-expression profiling): xác nh các protein trong m t m u c bi t, cũng như ch c năng c a m t tr ng thái c bi t c a t bào hay cơ th (tr ng thái bi t hóa, tr ng thái phát tri n, tr ng thái b nh…), hay ch c năng c a s ti p xúc v i thu c, các kích thích hóa lý. L p các sơ m ng lư i protein (Protein-network mapping): xác nh phương th c các protein tương tác v i nhau trong các h th ng s ng. L pb n các bi n i protein (Mapping of protein modification): xác nh phương th c và v trí các protein b bi n i. II.3. CYTOMICS Cytomics là nghiên c u các quá trình sinh hóa, nh m k t h p các cơ ch m c th p hơn vào các quá trình m c t bào và cu i cùng là cơ th . Cytomics giúp hi u và tái thi t l p các quá trình chuy n hóa (genome, proteome, metabolome), mô ph ng t bào và các cơ th nh . Phân tích các quá trình chuy n hóa n i bào, metabolome, giúp hi u ư c m ng lư i protein, và s hi n di n các gen im l ng (silent gene). 3
II.4. CÔNG NGH NANO VÀ MICRO Công ngh nano liên quan n kh năng s p x p các phân t và các nguyên t thành các c u trúc phân t . Nó có tác ng chính lên máy tính, các v t li u và s s n xu t các công c , thi t b , kh năng can thi p vào các c p i u tr b nh. Các k thu t thi t k máy micro ang phát tri n nhanh chóng và có nhi u ng d ng trong các vi dòng (microfluidic), các trong sensor, s i quang h c... Các microrobot và nanorobot ho t ng như các robot di ng nh trong d ch cơ th là công c tuy t v i cho các thao tác t bào. S ra i c a biochip là m t ti n b vư t b c c a công ngh sinh h c nano, chúng ch a ng m t ph m vi r ng các v n nghiên c u như genomics, proteomics, sinh h c máy tính và dư c h c, cũng như m t s ho t ng khác. Nh ng ti n b trong lĩnh v c này t o ra nh ng phương pháp m i, g r i cho nh ng quá trình sinh hóa x y ra trong t bào, v i m c ích là tìm hi u và ch a tr các căn b nh cho ngư i. Các biochip ư c xem là các phòng thí nghi m thu nh , b i l trên nó có th ti n hành hàng trăm n hàng ngàn ph n ng sinh hóa. Biochip giúp các nhà nghiên c u có th sàng l c nhanh m t lư ng l n các ch t sinh h c v i nhi u m c ích khác nhau, t ch n oán b nh n phát hi n các tác nhân nguy h i sinh h c. II.5. K THU T T BÀO NG V T IN VITRO Vi c các t bào ng v t có th nuôi c y, duy trì và tăng sinh trong các chai, l ngày càng d dàng hơn trong phòng thí nghi m, ã m ra hư ng m i quan tr ng trong nghiên c u CNSH N& V- ó là công ngh t bào ng v t. Các dòng t bào cũng ư c thi t l p, ây là mô hình in vitro lý tư ng cho các nghiên c u nói chung. Nuôi c y các t bào ng v t lư ng l n là n n t ng c a s n xu t vaccine virus và nhi u s n ph m công ngh sinh h c khác. Các ch t sinh h c ư c s n xu t b ng k thu t DNA tái t h p trong nuôi c y t bào ng v t như enzyme, hormone, các kháng th ơn dòng, interleukin…hay các nhân t kháng ung thư. M c dù nhi u protein ơn gi n hơn có th ư c s n xu t vi khu n, nhưng nhi u dư c ch t c n s glycosyl hóa, i u này h u như ph i ư c ti n hành trong t bào ng v t. Thu nh n, nuôi c y và bi t hóa t bào là m t thành công m i trong lĩnh v c nuôi c y t bào ng v t. Tuy m i phát tri n, nhưng các t bào g c (stem cell) ã h a h n nhi u ng d ng to l n trong y sinh h c. 4
CHƯƠNG 1 NUÔI C Y MÔ – T BÀO NG V T I. GI I THI U I.1. LƯ C S PHÁT TRI N K thu t nuôi c y mô – t bào ng v t là k thu t nuôi c y in vitro các t bào, mô và cơ quan c a ng v t nh m duy trì và/hay tăng sinh các t bào, mô, cơ quan ó m t cách c l p, tách kh i nh ng bi n i c a h th ng in vivo i u ki n bình thư ng ho c stress. K thu t này u tiên ư c th c hi n v i các m u mô, và t c tăng sinh c a chúng r t ch m. Vi c nuôi c y mô và t bào ng v t ã ư c ti n hành hơn 100 năm nay, thông qua nh ng nghiên c u u tiên nh m tìm hi u m t s v n trong lĩnh v c sinh h c phát tri n. Ch ng h n Ross Harrison (1907) ã thành công trong vi c nuôi t bào th n kinh b ng d ch huy t ch trư ng thành. Alexis Carrel cũng ã nuôi phôi gà trong môi trư ng b sung các ch t dinh dư ng và gi ư c tim phôi gà ho t ng n tháng th ba (1912). Năm 1955, Harry Eagle’s kh ng nh d ch chi t mô ph c t p, d ch huy t và nh ng ch t ang dùng nuôi t bào có th ư c thay b i “m t h n h p các amino acid, vitamin, các co-factor, carbohydrate và mu i, b sung v i m t lư ng nh protein huy t thanh…”, i u này ã m ra m t th i kỳ m i trong nuôi c y t bào ng v t in vitro. Sau ó, hàng lo t các k thu t nh m khai thác, bi n i và ng d ng các t bào ng v t nuôi c y in vitro ư c ti n hành như t o các t bào bi n i di truy n, nghiên c u s chuy n hóa và sinh lý t bào, thu nh n và t o dòng in vitro các dòng t bào bình thư ng (t bào sinh dư ng, sinh d c), và b t thư ng (t bào ung thư) c a ngư i, cũng như c a nhi u ng v t khác. T m t th c t là nh ng kh i u c a ngư i có th t o nên dòng t bào liên t c (như dòng t bào Hela ư c Gey và cs thi t l p năm 1952), nuôi c y mô c a ngư i ã ư c u tư nghiên c u. Sau ó, vào năm 1961 Hayflick và Moorhead kh o c u v các t bào bình thư ng có i s ng xác nh. Các dòng t bào u tiên ã ư c thi t l p thành công, chúng duy trì ít nh t m t ph n c i m, ch c năng ban u như các t bào tuy n thư ng th n, t bào tuy n yên, t bào th n kinh, t bào cơ... S phát tri n c a k thu t nuôi c y mô ngày càng tinh vi, hi n i do nhu c u b c thi t c a hai hư ng nghiên c u chính: t o vaccine kháng virus và nghiên c u v ung thư. Hi n nay, các nhà nghiên c u ang ti n t i s d ng d ng t bào lai (hybridoma) gi a t bào ng v t và t bào ung thư, như là m t h th ng s n xu t các protein tái t h p, ví d kháng th ơn dòng, vaccine, interferon… G n ây, nuôi c y t bào g c (stem cell) tr thành mũi nh n m i trong công ngh t bào, v i nhi u hy v ng ng d ng y sinh. I.2. SƠ LƯ C V T BÀO NG V T Các t bào ng v t có vú là t bào eukaryote, chúng ư c liên k t v i nhau b i các nguyên li u gian bào t o thành mô. Mô ng v t thư ng ư c phân chia theo b n nhóm: bi u mô (epithelium), mô liên k t (connective tissue), mô cơ (muscle) và mô th n kinh (nerve). Trong nuôi c y t bào ng v t, ngư i ta phân bi t hai nhóm: các t bào d ch huy n phù và các t bào dính bám. 5
- Các t bào d ch huy n phù: là nh ng t bào không bám dính khi sinh trư ng trong môi trư ng nuôi c y in vitro, ví d các t bào máu và t bào lympho; nh ng t bào này không òi h i b m t sinh trư ng. - Các t bào dính bám: H u h t các t bào ng v t bình thư ng là các t bào dính bám, vì th chúng c n có b m t g n vào và sinh trư ng (th y tinh, plastic), ư c s d ng ph bi n trong các ng d ng là các t bào bi u mô và nguyên bào s i (fibroblast). Ngư i ta thư ng s d ng ĩa petri ho c các chai tr c lăn nuôi c y các t bào dính bám. Các giá th là polymer b t bi n (spongy), th g m (ceramic), các s i r ng, microcapsule ho c các th mang có kích thư c hi n vi (microcarrier) cũng ư c s d ng r ng rãi tăng t l di n tích/th tích trong nuôi c y. Có m t m i quan h quan tr ng gi a hình d ng t bào và tính ch t bám dính c a chúng. N u t bào bám dính vào b m t nuôi c y, chúng s có hình dài, tr i r ng trên m t áy h p nuôi, ngư c l i, n u không bám dính, t bào s có hình kh i c u u. * c i m c a các t bào ng v t - T bào ng v t không có vách, nhưng kích thư c khá l n (kho ng 10 µm), nên tính b n cơ h c y u. Do ó, t bào ng v t trong nuôi c y in vitro r t d v b i các l c tác ng khi khu y tr n tách t bào, thao tác… Vì v y, khi thao tác v i t bào ng v t, c n c g ng thao tác nh nhàng và trong th i gian ng n nh t. - T bào ng v t có tăng trư ng và phân chia ch m, nên hi u su t s n sinh các ch t có ho t tính sinh h c r t th p, ch m. Do ó, s n xu t các ch t có ho t tính t t bào ng v t, c n ph i có th i gian dài và kh i lư ng t bào l n. - t bào ng v t, có cơ ch kìm hãm ngư c (negative feed-back), có nghĩa là s gia tăng n ng c a m t ch t nào ó trong môi trư ng s d n n c ch t bào t ng h p và ti t ch t ó ra môi trư ng. i u này có th gây t n thương t bào, th m chí còn có th làm ch t hàng lo t. Vì v y, khi nuôi c y mô – t bào ng v t, sau m i kho ng th i gian nuôi c y nh t nh, c n thi t ph i thay m i môi trư ng nuôi. - Tr t bào máu và m t s giai o n c a t bào sinh d c, h u h t các mô và t bào ng v t c n bám vào giá có th s ng và phân chia. Thông thư ng t bào tăng trư ng t t khi g n vào b m t r n. T bào s ng ng phân chia khi ã hình thành l p ơn liên t c trên b m t c a d ng c nuôi. Tuy v y, m t s dòng t bào như t bào ung thư, ho c dòng t bào liên t c t mô bình thư ng, sau khi ư c thu n hóa, có th sinh trư ng và phân chia trong tr ng thái lơ l ng mà không c n bám vào n n. - Các t bào ng v t có th thay i ki u gen và ki u hình, thông qua quá trình dung h p hai t bào có nhân khác nhau t o thành t bào lai (hybridoma) ho c quá trình bi n n p. VD: ch ng t bào bình thư ng có th c m ng thành t bào có các tính ch t c a t bào ung thư, thông qua quá trình bi n n p ư c th c hi n b i m t virus c m ng ung thư ho c b ng hóa ch t. - Các dòng t bào ng v t có th ư c b o qu n l nh sâu trong nitơ l ng (-197oC) su t nhi u năm. Khi ư c gi i ông và ho t hóa, t bào ph c h i kh năng tăng trư ng và phân chia như ban u. Ngoài các c tính trên, t bào ng v t còn có các c i m khác như kém thích nghi v i môi trư ng, nh y c m v i ion kim lo i, và a s t bào ng v t c n huy t thanh, hormone… tăng trư ng và phân chia. T t c nh ng c i m trên c n ư c lưu ý trong quá trình nuôi c y in vitro. 6
I.3. ƯU I M VÀ H N CH C A NUÔI C Y MÔ – T BÀO NG V T * Ưu i m - H th ng t bào ng v t là các “nhà máy t bào” thích h p cho vi c s n xu t các phân t ph c t p và các kháng th dùng làm thu c phòng b nh, i u tr ho c ch n oán: như các enzyme, hormone, vaccine, kháng th ơn dòng, thu c tr sâu sinh h c, interferon và interleukin, các t bào nguyên v n th nghi m ch t c hóa h c… - Các t bào ng v t có quá trình bi n i h u d ch mã chính xác (post translational modifications) i v i các s n ph m protein sinh-dư c (biopharmaceutical protein) như phân gi i protein, liên k t ti u ơn v (subunit), ho c nhi u ph n ng k t h p khác như glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các c u n i disulfide ho c phoshorylation các g c amino acid. Nh ng s a i này r t quan tr ng nh hư ng n ho t tính sinh h c c a s n ph m. Ví d quá trình glycosylation có th giúp b o v protein ch ng l i s phân gi i chúng, duy trì kh năng n nh c u trúc và bi n i kháng nguyên. - S n xu t các viral vector dùng trong li u pháp gen nh m ch a tr nhi u b nh như ung thư, HIV, viêm kh p, các b nh tim m ch và xơ hóa u nang. - S n xu t các t bào ng v t dùng như m t cơ ch t in vitro trong nghiên c u c ch t h c và dư c h c. - Phát tri n công ngh mô ho c phát sinh cơ quan s n xu t các cơ quan thay th nhân t o- sinh h c hay các d ng c tr giúp, như: da nhân t o ch a b ng, mô gan ch a viêm gan, o Langerhans ch a ti u ư ng… * H n ch M c dù ti m năng ng d ng c a nuôi c y t bào ng v t là r t l n, nhưng vi c nuôi c y m t s lư ng l n t bào ng v t thư ng g p các khó khăn sau: - T bào ng v t có kích thư c l n hơn và c u trúc ph c t p hơn t bào vi sinh v t. -T c sinh trư ng c a t bào ng v t r t ch m so v i t bào vi sinh v t. Vì th , s n lư ng c a chúng khá th p và vi c duy trì i u ki n nuôi c y vô trùng trong m t th i gian dài thư ng g p nhi u khó khăn hơn. - Các t bào ng v t ư c bao b c b i màng huy t tương, m ng hơn nhi u so v i thành t bào dày ch c thư ng th y vi sinh v t ho c t bào th c v t, và k t qu là chúng r t d b v . - Nhu c u dinh dư ng c a t bào ng v t chưa ư c xác nh m t cách y , và môi trư ng nuôi c y thư ng òi h i b sung huy t thanh máu r t t ti n. - T bào ng v t là m t ph n c a mô ã ư c t ch c (phân hóa) hơn là m t cơ th ơn vào riêng bi t như vi sinh v t. - H u h t các t bào ng v t ch sinh trư ng khi ư c g n trên m t b m t. I.4. M T S KHÁI NI M DÒNG T BÀO - Dòng t bào (cell line): là thu t ng dùng ch m t qu n th t bào gi ng h t nhau b t ngu n t m t t bào ban u. - Dòng t bào liên t c (continued cell line; established cell line): là dòng t bào nuôi c y trong i u ki n in vitro qua nhi u th h , và có th duy trì kh năng phân bào trong m t th i gian r t dài, có khi là vĩnh vi n mà không thay i c tính. Ví d : CHO (chinese hamster ovary: t bào 7
bu ng tr ng chu t Trung qu c), Schneider-2 (t bào phôi ru i gi m), COS1 (t bào th n kh xanh Châu Phi), Hela (t bào ung thư c t cung ngư i), Vero (t bào th n kh xanh Châu Phi)... - Dòng t bào t m th i (temporary cell line): là dòng t bào ch s ng trong i u ki n nuôi c y m t th i gian gi i h n. ây thư ng là các dòng t bào thư ng (không ph i ung thư). - T bào sơ c p (primary cell): là các t bào ư c nuôi c y trong i u ki n in vitro l n u tiên (nuôi c y sơ c p) sau khi ư c tách ra t kh i mô. - T bào th c p (secondary cell): là các t bào ã qua vài l n c y truy n (nuôi c y th c p) sau khi ư c tách t kh i mô. I.5. CÁC C P NUÔI C Y MÔ VÀ T BÀO NG V T Nhìn chung, trong phòng thí nghi m thư ng có ba c p chính: nuôi c y cơ quan, nuôi c y mô phát tri n sơ c p và nuôi c y t bào. I.5.1. Nuôi c y t bào T bào trong i u ki n in vitro có nh ng i m khác bi t so v i in vivo. Th nh t là t bào nuôi c y in vitro không có c tính tương tác t bào chuyên bi t (tương tác a chi u) như mô c a t bào in vivo. Th hai là môi trư ng in vitro thi u vài thành ph n liên quan n s i u hòa in vivo, do ó chuy n hóa c a t bào in vitro n nh và d ki m soát hơn trong in vivo, nhưng có th không th c s i di n cho mô. Tuy nhiên, dù th nào i n a thì nuôi c y mô – t bào ng v t cũng ã th hi n nhi u kh năng c bi t trong nghiên c u và ng d ng, nó ã và ang là công c r t h u ích. Có nhi u hình th c nuôi c y khác nhau tùy c tính t bào, hay tùy thu c vào phương pháp: nuôi c y sơ c p (Primary culture), nuôi c y th c p (Secondary culture), nuôi c y huy n phù (Suspension culture) và nuôi c y l p ơn (Monolayer culture). Nuôi c y sơ c p: là nuôi c y các t bào sau khi ư c tách ra t cách m nh mô và trư c l n c y chuy n u tiên. Nuôi c y sơ c p thư ng ư c s d ng khai thác các t bào ban u trong nh ng m nh mô, nh m t o ra các dòng t bào m i. Trong nuôi c y sơ c p, các t bào ban u thư ng là m t h n h p các dòng khác nhau, ho c ch a m t ki u t bào tr i nh t, trong ó có nh ng t bào quan tâm và nh ng t bào khác (t bào nhi m). Có th lo i b các t bào nhi m b ng cơ h c, hay enzyme khi tách mô, hay b ng cách duy trì các i u ki n ch n l c dương tính cho s s ng sót c a m t ki u t bào quan tâm c n thu nh n. Quy trình nuôi c y sơ c p: thu nh n các m nh sinh ph m, các m nh mô s ng x lý sơ b , lo i b vi khu n, n m và các thành ph n không mong mu n khác tách t o huy n phù t bào ơn ưa vào môi trư ng nuôi c y. Nuôi c y th c p ư c ti n hành sau khi t bào ư c t o dòng t nuôi sơ c p. Nhi u dòng t bào ã ư c thi t l p và thương m i hóa. Ph n l n các dòng này ư c thu nh n t kh i u (ví d t bào Hela, RD…) hay t các t bào b bi n i in vitro. Tuy nhiên, các dòng t bào này ư c nuôi c y trong các phòng thí nghi m khác nhau nên có th d n n s phát sinh các c tính m i khác nhau và khác v i các t bào sơ khai ban u. Các t bào nuôi c y th c p là i tư ng chính cho nghiên c u và ng d ng c a công ngh t bào ng v t. Quy trình nuôi c y th c p: gi i ông ( i v i các t bào ư c b o qu n l nh) ưa vào môi trư ng thích nuôi c y thích h p 8
Nuôi c y huy n phù thư ng ư c ti n hành v i các t bào thu nh n t máu (b ch c u…). Có th coi ây là phương pháp nuôi c y trong không gian ba chi u v i k thu t nhân sinh kh i b ng fermenter, thông qua h th ng bioreactor, nh m thu nh n lư ng l n các t bào mong mu n. Nuôi c y l p ơn ư c ng d ng v i nh ng dòng t bào khác thu nh n t các mô r n (ph i, th n, cơ, xương, m …) c n nuôi phát tri n thành l p ơn. Các dòng t bào bám dính có th ư c phân lo i như t bào n i mô: BAE-1; t bào bi u mô: Hela; mô th n kinh: SH-SY5y hay fibroblast: MRC-5. Thông thư ng, hình d ng in vitro c a các t bào s ng nói trên luôn ph n ánh ngu n g c c a mô. Ngoài ra, m t s dòng t bào khi nuôi s bi u hi n tr ng thái bán bám dính (semi-adheret) như B95-8. Khi ó, trong d ng c nuôi s xu t hi n h n h p hai qu n th t bào: các t bào bám và các t bào huy n phù. * Nh ng thu n l i c a nuôi c y t bào - Có th phát tri n m t dòng t bào qua nhi u th h . - Có th nuôi c y quy mô l n. * Nh ng b t l i c a nuôi c y t bào - T bào b m t i m t s c tính ã bi t hóa trong mô. I.5.2. Nuôi c y mô Nuôi c y mô phát tri n sơ c p ư c ti n hành b ng cách t các m nh mô lên trên b m t r n b ng nh a, hay th y tinh bao ph b i các ch t dinh dư ng d ng l ng. Trong i u ki n thích h p, các m nh mô s bám vào b m t r n, các t bào ph n rìa c a m nh mô s tăng sinh làm n i r ng m nh mô. K thu t này cung c p mô hình th nghi m thu n l i hơn so v i các th nghi m in vivo, c bi t khi ti n hành các nghiên c u v c t . Nuôi c y mô phát tri n sơ c p còn dùng thu nh n các qu n th t bào. * Nh ng thu n l i c a nuôi c y mô - Các y u t lý hóa c a môi trư ng (pH, nhi t , áp su t th m th u, O2, CO2) ư c ki m soát t t. Các y u t b sung có thành ph n không xác nh cũng ang d n ư c hi u rõ và ư c thay th b i nh ng thành ph n xác nh. - M u mô không ng nh t nhưng sau vài th h nuôi c y in vitro, nh ng dòng t bào này tr nên ng nh t hơn hay ít nh t là cùng d ng. - Nh ng t bào nuôi c y có th ti p xúc tr c ti p v i m t ch t n ng th p và xác nh, và ch t này có th xâm nh p tr c ti p vào t bào. - So v i nuôi c y cơ quan thì trong nuôi c y mô, m t s ch c năng bình thư ng c a mô v n ư c duy trì và có th nuôi c y trên quy mô l n (nhưng khó ti n hành). * Nh ng khó khăn c a nuôi c y mô - T ch c ban u c a mô b m t. - K thu t nuôi c y c n ư c th c hi n i u ki n vô trùng tuy t i. T bào ng v t òi h i ư c cung c p m t môi trư ng ph c h p, gi ng huy t tương máu hay d ch l ng k các t bào. Do ó, òi h i ngư i th c hi n ph i có k năng thành th o và hi u bi t t t v lĩnh v c này. - Tiêu hao nhi u công s c và ti n b c nhưng ch thu ư c m t lư ng nh . Giá thành vi c nuôi c y cao, do ó ch nên s d ng khi c n thi t. 9
- Sau m t th i gian phân chia liên t c, có th t o thành các t bào v i b NST a b i không hoàn ch nh. Ngay c v i nuôi c y trong th i gian ng n, m c dù các t bào có th n nh v m t di truy n, nhưng s không ng nh t v t c tăng trư ng c a t ng t bào có th t o ra s thay i t th h này sang th h khác. I.5.3. Nuôi c y cơ quan K thu t nuôi c y cơ quan ư c phát tri n t các phương pháp nuôi c y mô nh m ph c v nghiên c u, ây có th là mô hình ch c năng trong nhi u th nghi m. ó là k thu t nuôi c y in vitro nh ng m nh c a m t cơ quan hay c cơ quan, duy trì c u trúc c a mô và hư ng nó phát tri n bình thư ng. Môi trư ng nuôi c y cơ quan có th d ng môi trư ng r n hay môi trư ng l ng. Vi c nuôi c y cơ quan thu nh n t phôi thai d dàng hơn các cơ quan t cơ th trư ng thành, b i nhu c u O2 c a nh ng mô trư ng thành l n hơn nhi u. Vì v y, nuôi ư c các cơ quan t cơ th trư ng thành ph i s d ng môi trư ng v i các thi t b c bi t. Nh ng thu n l i c a nuôi c y cơ quan: - Ch c năng sinh lý bình thư ng c a cơ quan ư c duy trì. - T bào gi tr ng thái bi t hóa hoàn toàn. Nh ng b t l i c a nuôi c y cơ quan: - Không th nuôi c y quy mô l n. - Cơ quan nuôi c y phát tri n ch m. - Thư ng xuyên ph i c y chuy n sang môi trư ng m i cho m i thí nghi m. II. I U KI N LÝ – HÓA TRONG K THU T NUÔI C Y MÔ – T BÀO NG V T II.1. Nhi t T bào c a các loài ng v t khác nhau có nhi t nuôi c y thích h p khác nhau. VD: t bào c a ng v t có vú và c a ngư i phát tri n t t 37 ± 10C, nhi t t bào c a các loài chim phát tri n t t 38,50C, còn t bào c a các loài côn trùng phát tri n t t nhi t 25 ± 20C. M t s dòng t bào phát tri n nhi t th p hơn thân nhi t bình thư ng c a cơ th , VD: t bào bi u mô, t bào tinh trùng... Trong nuôi c y in vitro, t bào ng v t không ch u ư c nhi t cao hơn 20C so v i nhi t phát tri n thích h p c a chúng, nhưng t bào l i có kh năng ch u ng ư c nhi t th p hơn nhi t phát tri n t i ưu c a chúng mà r t ít nh hư ng n s phát tri n c a chúng sau này. duy trì nhi t nuôi c y, thư ng ph i s d ng t m (incubator). Nhìn chung, các t m duy trì nhi t b ng cách làm m và tu n hoàn khí nóng áp ng v i nh ng thay i nhi t và s tr l i nhi t nhanh chóng sau khi m hay óng c a t . i v i các t m có b sung nư c khay bên dư i s duy trì m cao. II.2. pH pH không ch quan tr ng trong vi c duy trì s cân b ng ion thích h p mà còn duy trì ch c năng t i ưu c a các enzyme n i bào, cũng như s g n k t c a các hormone và nhân t tăng trư ng lên các receptor b m t. S bi n i pH có th làm thay i chuy n hóa t bào, d n t i s c m ng 10
s n xu t protein shock nhi t, m t quá trình d n n s ch t t bào (apoptosis). Do v y, ki m soát pH là c n thi t t i ưu hóa i u ki n nuôi c y. pH t i ưu cho s phát tri n c a t bào nuôi c y khác nhau tùy theo loài và tùy theo dòng t bào. H u h t các t bào s ng trong môi trư ng có ngư ng pH 6,5 – 7,8 nên môi trư ng nuôi c y thư ng ư c i u ch nh pH 7,0 – 7,4 (trung bình là 7,2). M t s dòng t bào thích h p v i pH cao hơn (VD: t bào fibroblast ngư i thích h p v i pH 7,4 – 7,7) hay th p hơn (VD: t bào côn trùng phát tri n t t pH 6,2±0,1). Môi trư ng có pH n nh ít thay i có th giúp t bào s ng t t hơn. H u h t các môi trư ng thương m i ch a phenol red như là m t ch t ch th pH. Môi trư ng chuy n màu vàng cho bi t pH gi m (acid) và màu h ng n u pH tăng (ki m). II.3. Áp su t th m th u Áp su t th m th u c a môi trư ng ư c xác nh b i chính công th c môi trư ng. Mu i và glucose là hai tác nhân chính hình thành nên áp su t th m th u, m c dù các amino acid cũng quan tr ng. Thay i áp su t th m th u c a t bào h u như luôn tác ng lên s tăng trư ng và ch c năng t bào. N u t bào n m trong môi trư ng có áp su t không thích h p, chúng s bi n d ng: t bào co l i trong môi trư ng có áp su t th m th u quá cao, còn trong môi trư ng có áp su t quá th p, chúng s căng ph ng lên. ki m tra áp su t th m th u c a môi trư ng, thư ng s d ng Osmom k (Osmometer). Các môi trư ng thương m i ư c thi t k áp su t th m th u là 300 mOsm (t bào phát tri n trong kho ng 290 - 310 mOsm). Có th i u ch nh áp su t th m th u b ng cách thêm NaCl, c 0,0292 g/lít NaCl s làm tăng 1 mOsm (s d ng 5M NaCl v i 1ml/lít s làm tăng áp su t th m th u lên 10 mM). Chú ý là trong môi trư ng còn có các thành ph n ư ng, ion, các amino acid…chúng cũng óng góp vào s t o áp su t th m th u. II.4. Các lo i khí Ba lo i khí c n quan tâm: CO2, O2 và N2. T l c a chúng ư c ph i tr n thích h p theo các chương trình thi t k s n c a t nuôi, nh ó các phân áp khí ư c t o ra thích ng v i c i m sinh lý c a t bào và mô s ng. O2 có vai trò quan tr ng trong sinh trư ng, tăng sinh và bi t hóa t bào. Tuy nhiên, nhu c u v O2 c a t bào nuôi c y th p hơn nhu c u O2 c a mô s ng. Áp su t O2 trong t nuôi c y t bào thư ng th p hơn áp su t O2 trong không khí. Trong quá trình nuôi c y tĩnh, các phân t oxy trong không khí luôn có xu hư ng khu ch tán vào môi trư ng nuôi, qua l p môi trư ng dày ch ng vài milimet. Do v y, n u s d ng quá nhi u môi trư ng trong m t th tích h p s kìm hãm s khu ch tán oxy. N ng O2 ph bi n dùng trong t nuôi t bào thư ng t 16 – 20%. Tác ng c a CO2 lên nuôi c y t bào khó ư c xác nh m t cách chính xác, b i nó liên quan n hàm lư ng CO2 hòa tan, pH, n ng HCO3-. Áp su t CO2 trong không khí có th i u hòa tr c ti p n ng CO2 hòa tan, v i s tham gia c a y u t nhi t . Chính s bi n i thu n ngh ch CO2 thành HCO3- có th s làm thay i pH c a môi trư ng nuôi, do v y, n ng CO2 trong t nuôi có tính quy t nh n pH c a môi trư ng nuôi c y. i u này ư c hi u là, có th dùng n ng CO2 n nh pH c a môi trư ng nuôi. Tùy vào m i lo i t bào ch n n ng CO2 tương ng. 11
III. MÔI TRƯ NG NUÔI C Y T BÀO NG V T Thành ph n môi trư ng nuôi c y t bào ng v t ph c t p hơn r t nhi u so v i môi trư ng nuôi c y vi sinh hay t bào th c v t, thư ng ch a các thành ph n không xác nh. Do thành ph n ph c t p, khó n nh nên ngư i ta quan tâm d n n nghiên c u, t o các môi trư ng t ng h p có th ch ng b o qu n, s d ng, i u ch nh và n nh thành ph n trong nh ng l n nuôi c y khác nhau. Môi trư ng nuôi c y ch a ph n l n là nư c. N u ngu n nư c không n nh có th t o nên s khác bi t quan tr ng trong ch t lư ng s d ng. i u này c bi t quan tr ng i v i các môi trư ng không có huy t thanh, vì các h p ch t h u cơ và kim lo i hi n di n trong nư c c t vô trùng kh ion có th gây c nghiêm tr ng i v i m t s ki u t bào. III.1. Vai trò c a môi trư ng Môi trư ng nuôi c y cung c p các ch t dinh dư ng c n thi t cho s phát tri n c a t bào in vitro. Các ch t dinh dư ng thi t y u giúp t bào phân chia như amiono acid, acid béo, ư ng, các ion, các vitamine, cofactor và các phân t c n thi t duy trì môi trư ng hóa h c cho t bào. M t s thành ph n có th gi nhi u vai trò hơn, VD: sodium bicarbonat duy trì pH thích h p và t o áp su t th m th u cho môi trư ng. III.2. Thành ph n c a môi trư ng a. Mu i vô cơ Các mu i vô cơ trong môi trư ng gi vai trò quan tr ng i v i s phát tri n t bào in vitro, như: cân b ng áp su t th m th u, duy trì cơ ch v n chuy n ch t qua màng, giúp i u hòa i n th màng, bám g n t bào, ho t ng như các cofactor... b. H m H m có vai trò i u hòa pH c a môi trư ng nuôi c y. H u h t các môi trư ng s d ng h m bicarbonate v i CO2 là thành ph n chính. Ngoài ra, còn có h th ng m phosphat và các m h u cơ ph c t p khác. Cũng có th s d ng h m h u cơ hay huy t thanh trong môi trư ng cơ b n. Khi s d ng bicarbonate làm h th ng m chính trong môi trư ng thì s tương tác c a CO2 thu nh n t các t bào (hay t không khí) v i nư c, s d n n s i u ch nh pH môi trư ng theo cân b ng c a phương trình: H2O + CO2 = H2CO3 = H+ + HCO-3 S d ng h m bicarbonate/CO2 c n duy trì không khí v i 5–10% CO2 trong t . Bicarbonate, CO2 r , không c i v i t bào nên ư c dùng ph bi n. H m h u cơ ư c s d ng nhi u nh t là HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2- ethane sulfonic acid). Các h m h u cơ không nh y c m v i CO2, chúng cung c p m t h th ng t t các t bào chuy n hóa m nh (s n xu t nhi u CO2) có th n nh pH. M t s dung d ch m như Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] thư ng s d ng trong sinh hóa có th gây c i v i t bào in vitro. c. Carbohydrate ư ng trong môi trư ng là ngu n cung c p C và năng lư ng cho s phát tri n t bào in vitro. Các ư ng chính ư c s d ng là glucose và galactose, m t s môi trư ng còn s d ng 12
maltose hay fructose. N ng ư ng khác nhau gi a các môi trư ng cơ b n t 1g/l– 4,5g/l. Môi trư ng ch a n ng ư ng cao s giúp phát tri n nhi u ki u t bào. d. Vitamine Vitamine là cơ ch t cho nhi u cofactor, chúng có nhi u trong thành ph n huy t thanh. Tuy nhiên, nhi u lo i môi trư ng c n ư c b sung vitamine thích h p b i chúng r t quan tr ng trong nuôi c y t bào. c bi t vitamine nhóm B c n thi t cho s phát tri n t bào, và i v i m t s t bào, vitamine B12 là thi t y u. M t s môi trư ng có nhi u vitamine A và E. Thông thư ng vitamine ư c s d ng trong môi trư ng là riboflavin, thiamine và biotin. e. Các protein và peptide Các thành ph n này gi vai trò quan tr ng trong nuôi c y h u h t các t bào, c bi t khi nuôi c y v i môi trư ng không huy t thanh. M t s protein, peptide r t c n thi t như albumin, transferring, fibronectin và fetuin thư ng có s n trong huy t thanh. f. Acid béo và lipid Gi ng v i protein và peptide, các ch t này r t c n thi t trong môi trư ng nuôi không huy t thanh và cho m t s t bào c bi t. Chúng hi n di n trong huy t thanh v i các d ng như cholesterol và steroid. g. Y u t vi lư ng Bao g m k m, ng, selenium… và các tricarboxylic acid trung gian, trong ó selenium là ch t giúp tách các g c oxy t do. Ngoài ra, tùy vào m c ích nghiên c u có th ưa vào môi trư ng m t s vi lư ng c n thi t khác. h. Huy t thanh Trong h u h t các lo i môi trư ng nuôi c y t bào ng v t u có m t huy t thanh b i nó có nh ng vai trò quan tr ng như sau: - Cung c p ch t dinh dư ng quan tr ng cho t bào như các amino acid thi t y u, ti n ch t c a nucleic acid, các nguyên t vi lư ng… - Cung c p các nhân t tăng trư ng, kích thích cho t bào tăng trư ng và phân chia. - Kích thích s ph c h i các t n thương c a t bào khi c y chuy n, và các protein trong huy t thanh làm b t ho t trypsin, tránh các enzym gây t n thương t bào. - C i thi n tính tan c a các ch t dinh dư ng. - Ch ng oxy hóa: huy t thanh kháng oxy hóa m nh, và c ch c tính c a oxy. - C i thi n tính dính c a t bào lên b m t bình nuôi nh các y u t làm tăng dính c a t bào lên giá . Huy t thanh r t c n cho vi c nuôi c y t bào ng v t. Tuy nhiên, bên c nh nh ng tác ng t t nêu trên, huy t thanh cũng có nh ng tác ng không t t: - Nuôi c y t bào v i môi trư ng b sung huy t thanh chi phí cao, nh t là huy t thanh bò (FBS) làm tăng giá thành lên áng k (huy t thanh chi m 90% giá thành c a môi trư ng nuôi c y). - Huy t thanh d b nhi m virus, mycoplasm và khó n nh ch t lư ng c a nh ng lô môi trư ng khác nhau. 13
- Huy t thanh còn ch a nh ng thành ph n gây c ch s phân bào và c m ng s phân hóa (VD: TGF - có tác d ng c ch s phân chia c a t bào thư ng bì khí qu n, làm t bào bi n thành hình có góc c nh; TGF- còn có tác d ng kìm hãm s phân chia c a dòng t bào bi u bì ngư i và chu t), (do ó khi nuôi c y, c n ch n lo i huy t thanh phù h p không ch a y u t c ch iv i dòng t bào nuôi c y). - M t s t bào nuôi c y không (ho c kém) phát tri n trong huy t thanh, chúng thích ng v i các môi trư ng c c b chuyên bi t, có tính ch t khác bi t rõ r t v i huy t thanh. - Nhi u ch t trong huy t thanh (vitamin C, các lipoprotein...) thư ng không n nh khi ông l nh hay b o qu n lâu. Môi trư ng b sung huy t thanh s có n ng hormone hay các nhân t tăng trư ng không thích h p v i s phát tri n c a m t s t bào. - Huy t thanh không pha loãng s c v i nhi u lo i t bào (cũng có m t s lo i t bào có kh năng ch u ng ư c n ng huy t thanh cao hơn các t bào khác, VD: các t bào n i mô thành m ch vì chúng phát tri n trong môi trư ng tương t huy t thanh nhưng không hoàn toàn gi ng huy t thanh) - Khi m t n ng hormone thích h p, huy t thanh cũng có th ch a cơ ch t c ch s phát tri n, bi t hóa hay ch c năng. Huy t thanh cũng kích thích s bi t hóa c a các t bào vào tr ng thái không nguyên phân, làm chúng không th duy trì dòng t bào b t t . Vì v y, nhi u nhà nghiên c u hư ng n xây d ng các môi trư ng t ng h p không dùng huy t thanh (như M-199) hay dùng v i lư ng th p (CMRL 1066, NTCT 109). phát tri n t bào trong môi trư ng không huy t thanh, c1o nhi u cách ti p c n, t t c các chi n lư c này u nh m k t h p s thay i liên t c v i vi c làm giàu các thành ph n dinh dư ng trong môi trư ng nuôi: - T o s thích nghi c a các t bào v i môi trư ng không huy t thanh và không b sung hormone nào. - S d ng huy t thanh ã ư c làm gi m (hay lo i b hoàn toàn) các l p hormone không c n thi t. - B sung thư ng xuyên vào môi trư ng không huy t thanh các nhân t tăng trư ng, bám dính và các nhân t phù h p khác. III.3. Ch n l c môi trư ng thích h p N u m t dòng t bào m i ư c mang vào phòng thí nghi m, c n xác nh môi trư ng thích h p phát tri n. Các thông tin này có th ư c ưa ra b i nhà cung c p. Cũng có th t tìm ư c thông tin thông qua vi c sàng l c, th nghi m v i nhi u loài môi trư ng khác nhau trong cùng i u ki n nuôi xác nh môi trư ng thích h p cho nuôi c y nh ng t bào phát tri n sơ c p u tiên, nh ng dòng t bào còn thi u thông tin ho c mu n tìm môi trư ng m i thay th cho m t dòng t bào nào ó. Hi n nay, tr nh ng dòng t bào ã thi t l p ư c thu n hóa v i môi trư ng t ng h p hoàn toàn, a s các dòng t bào còn l i ư c nuôi c y trong môi trư ng t ng h p có b sung 5–10% huy t thanh (có dòng t bào c n b sung 20% huy t thanh). ư c s d ng ph bi n là huy t thanh bê, cũng có m t s lo i t bào òi h i b sung huy t thanh bào thai bò trong môi trư ng nuôi c y. Ngoài huy t thanh, m t s nh ng d ch chi t sinh h c ph c t p (s a, d ch chi t phôi, huy t tương...), các nhân t tăng trư ng, hormone... cũng thư ng ư c b sung vào môi trư ng. 14
III.4. K thu t pha môi trư ng - Thành ph n môi trư ng: khác nhau tùy vào lo i s d ng. Khi pha môi trư ng c n ph i m b o cung c p y các thành ph n theo úng công th c. - i u ki n nuôi c y: thông thư ng các t bào ng v t phát tri n t t nh t nhi t m o kho ng 36-39 C. c bi t khi nuôi c y t bào ng v t, i u ki n v m và n ng CO2 trong không khí r t quan tr ng. Trong các t nuôi c y t bào ng v t thư ng t m t khay nư c t o m cao trong không khí, tránh b c hơi nư c t môi trư ng nuôi, d n n thay i áp su t th m th u c a môi trư ng. N ng CO2 trong t nuôi thư ng 5%, c bi t có khi n 95%. - S vô trùng: ây là y u t c c kỳ quan tr ng và ư c lưu ý c bi t trong nuôi c y t bào ng v t. Virus và các vi sinh v t ngo i nhi m là nh ng nguy cơ l n, có th làm ch t t bào nuôi c y. Tùy theo tính ch t hóa h c c a các thành ph n môi trư ng ch n cách kh trùng thích h p, có th là h p ư t ho c l c vô trùng b ng milipore. IV. K THU T NUÔI C Y T BÀO IV.1. NUÔI C Y SƠ C P Quy trình nuôi sơ c p g m: THU NH N M U MÔ C t nh (Ch n l c m u mô quan tâm, c t b ph n mô ch t) C t nh Tách t bào b ng Tách t bào b ng (M nh nh nuôi) cơ h c (nghi n, ép) enzyme ( …) Nuôi m u Trypsin l nh Trypsin m Collagenase mô sơ c p Ly tâm NUÔI SƠ C P Tái huy n phù Thu nh n t bào m i C y chuy n Nuôi m nh DÒNG T BÀO mô th c p Hình 1.1. Sơ nuôi c y sơ c p 15
+ Bư c 1: thu nh n mô (tươi hay ông l nh) có ch a t bào s ng. + Bư c 2: ph u tích và/ hay tách r i t bào, xác nh n ng . + Bư c 3: nuôi c y. IV.1.1. Thu nh n m u và x lý sơ b M u thu nh n có th bao g m b t kỳ mô nào c a cơ th . T i nơi thu nh n, m u c n ư c làm s ch (r a và sát trùng b ng c n) r i ưa vào b o qu n trong dung d ch DPBS r i chuy n nhanh v phòng thí nghi m. Tùy lo i m u mô cũng như th i gian c n thi t ưa v phòng thí nghi m, có k ho ch v n chuy n chúng trong i u ki n nhi t m (370C), nhi t l nh hay ông l nh t m th i. X lý sơ b m u mô: r a nhi u l n b ng dung d ch DPBS có b sung kháng sinh, kháng n m c t b các ph n mô ch t, ph n th a c t m nh nh ra thành t ng m nh 2-3 mm2 nuôi m u mô sơ c p ho c tách r i các t bào. VI.1.2. Tách r i các t bào Mô là t p h p các t bào ư c t ch c tinh vi và c trưng, chúng liên k t thành m t kh i th ng nh t, thông qua các c u n i gian bào. Tách các t bào ra kh i mô c n phá b nh ng c u n i liên bào này, nhưng không gây t n thương áng k cho t bào. Có hai bi n pháp chính tách r i các t bào: a. Tách b ng cơ h c - C t nhuy n mô: Dùng kéo c t nhuy n m nh mô, huy n phù trong dung d ch PBS (-), l ng và thu d ch trong (huy n phù thu nh n các t bào ơn). Phương pháp này cho kh năng s ng c a t bào cao nhưng s lư ng t bào ơn thu nh n ít nên thư ng ư c áp d ng cho nh ng m u mô có kích thư c l n và không khan hi m. Trên th c t , vi c c t nhuy n mô thư ng dùng làm tăng kh năng ti p xúc c a mô v i enzyme trong k thu t tách b ng enzyme ư c ti n hành sau ó. - Ép nhuy n mô s d ng hai phi n lame: thư ng ư c s d ng tách t bào nh ng mô có liên k t y u (như mô lách). Ngoài ra còn có th s d ng các pittong c a syringe ép mô trong ĩa petri nh m tách r i các t bào. - Ép b ng màng l c t bào (Cell strainer): t m u mô lên trên màng l c (có ư ng kính l 70 – 100µm), s d ng pittong c a syringe chà sát m nh m nh mô, khi ó, nh ng t bào s va ch m vào lư i l c và tách r i. Nh ng t bào ơn (có ư ng kính nh hơn l l c) s l t qua l l c. b. Tách b ng enzyme C u n i gian bào có b n ch t là protein (các t bào liên k t v i nhau và v i ECM), do v y các protease s d ng tách t bào là nh ng enzyme thu phân protein như: trypsin, collagenase, elastase, pronase, dispase hay nh ng t h p khác. Vi c s d ng enzyme có th riêng l , hay k t h p tùy thu c vào m c ích. Trypsin c t liên k t gi a nhóm carboxyl (-COOH) c a lysin ho c arginin và g c amin (- NH2) c a axid amin b t kì ng li n k v i nó trong polypeptid, ngo i tr liên k t gi a lysin và arginin. X lý trypsin d n n s cu n tròn t bào. Khi các t bào co l i, các liên k t tr nên l ng l o và t bào d dàng ư c tách ra b i tác ng cơ h c. Trypsin ho t ng trong môi trư ng pH 6 – 9, t i ưu pH 8 – 9, r t b n v ng trong môi trư ng acid y u. 16
Canxi ư c xem như ch t b o v cho trypsin, ho t tính xúc tác c a trypsin b gi m 50% khi v ng m t Ca2+ vì trypsin tr nên trơ. M t s kim lo i như coban, mangan… có kh năng ho t hóa trypsin. Ho t tính c a trypsin s b kìm hãm b i huy t thanh bò có thai ho c DFP (di-isopropyl fluoro phosphate). N ng trypsin thư ng dùng tách t bào là 0,01–0,5% (thư ng là 0,25%), ôi khi là 1%. Có th s d ng quy trình trypsin m (370C) hay trypsin l nh (40C). Trypsin không tác ng c hi u cho lo i protein, vì v y có th phân c t các protein màng và gây v t bào khi dùng n ng cao, ho c cho tác ng trong th i gian dài. C n trung hòa trypsin b ng huy t thanh ngay sau khi thu u c t bào ơn. Collagenase là enzyme th y phân các liên k t peptid d ng poly-L prolin c trưng cho vùng xo n c a collagen. Collagenase thu nh n t ng v t h u nhũ thì c t chu i collagen t i nh ng i m riêng bi t, còn thu nh n t vi khu n thì c t t i nhi u v trí d c trên chu i collagen. a s các collagenase ho t ng pH trung tính ho c hơi ki m (pH 7- 8), nhi t thích h p dư i 400C, và gi m ho t tính nhi t trên 450C. Có 4 lo i collagenase: - Collagenase lo i I: ch a m t lư ng trung bình nh ng ho t ch t (collagenase, caseinase, clostripain, trypsin ho t ng). Chúng thư ng ư c dùng cho vi c tách t bào da, gan, ph i, m và nh ng t bào mô thư ng th n. - Collagenase lo i II: ch a h p ch t clostripain nhi u hơn, ư c s d ng tách t bào t tim, xương, cơ và s n. - Collagenase lo i III: có ho t tính phân gi i protein th p. - Collagenase lo i IV: có ho t tính trypsin th p, thư ng dùng phân tách t bào t y. Collagenase và dispase phân c t không hoàn toàn các c u n i nên ít làm hư h i t bào. Ngư i ta còn s d ng hyaluronidase k t h p v i collagenase phân h y các ch t d ch n i bào, DNase ư c s d ng phân h y các DNA thoát ra t các t bào b ly gi i. Chymotrypsin có tính c hi u kém hơn trypsin, nó phân gi i các liên k t peptide t o thành b i nhóm carboxyl c a acid amin thơm (như tyrosin, phenylalanin, tryptophan, methionin và leucin) v i m t nhóm amin c a m t acid amin khác. Chymotrypsin có pH thích h p t 8 – 9, và b c ch b i DFB (di-isopropyl fluoro phosphate) Papain th y phân protein thành các polypeptid và các acid amin. Papain ch u ư c nhi t tương i cao (d ng khô không b bi n tính 1000C trong 3 gi ), ho t ng pH t 4,5 – 8,5 (tùy vào cơ ch t l a ch n pH thích h p nh t cho m i ph n ng). Papain b kìm hãm b i các ch t oxy hóa như oxy, ozone, hydroperoxyte, iod acetamid, th y ngân chlobenzoate, cystin và các h p ch t disulfur khác. Elastase th y phân m t s lư ng l n protein n n. Elastase là enzyme duy nh t có kh năng th y phân elastin, m t ch t n n không b tác ng b i trypsin, chymotrypsin hay pepsin. Elastase thư ng ư c s d ng có k t h p v i các enzyme khác như collagenase, trypsin và chymotrypsin. Elastase là enzyme ư c ch n tách t bào t phôi. c. Tách t bào b ng các phương pháp khác + Phương pháp ly tâm theo gradient t tr ng: ư c s d ng phân tách tinh trùng hay các t bào ơn nhân trong máu. Môi trư ng ly tâm thư ng s d ng là Percoll, Ficoll… 17
VD: Quy trình Ficoll dùng phân tách t bào máu ơn nhân: - Pha loãng máu (có ch t ch ng ông) 2 l n v i dung d ch m PBS - t 35 ml máu pha loãng lên 15ml Ficoll, ly tâm t c 400g trong 20 phút 240C - Thu d ch n i, huy n phù trong cùng m t lư ng dung d ch m - Ly tâm l n n a t c 500g trong 20 phút 240C - Thu c n, huy n phù trong cùng m t lư ng dung d ch m - B o qu n d ch huy n phù t bào 2 – 80 C + Phương pháp tách t bào d a vào marker b m t (là nh ng receptor b m t c a t bào): ư c s d ng ánh d u và phân l p t bào g c. Nh ng t bào g c hi m hoi ư c ch n t hàng tri u t bào khác. D ch t bào ư c ính m t phân t huỳnh quang vào receptor, dư i tác d ng c a l c y, d ch (có t bào) s i qua m t u kim r t nh , sao cho m i l n ch có m t t bào. u ra c a kim là m t ngu n ánh sáng, thư ng là tia laser và sau ó là m t i n trư ng. Nh ng t bào phát huỳnh quang s mang i n tích âm, còn nh ng t bào không phát huỳnh quang mang i n tích dương. S tích i n khác nhau như v y cho phép thu nh n t bào c n. M c dù m i lo i mô có nh ng yêu c u v i u ki n tách khác nhau, nhưng cho dù là mô nào, khi tách t bào nuôi c y u c n lưu ý m t s i m sau: - Các mô m , mô ch t, mô t p ph i ư c lo i b ra trong quá trình tách. - Mô nên ư c c t nhuy n b ng d ng c nh n, bén tránh hư h i t bào. - Enzyme s d ng trong quá trình tách t bào, trư c ó ph i ư c tách ra kh i dung d ch (b ng ly tâm), hay ph i b b t ho t (b ng huy t thanh). - N ng t bào thu nh n cho nuôi c y sơ c p ph i m b o, ng th i luôn cao hơn n ng t bào nuôi c y sau ó. - H i ph c t bào b ng cách nuôi trong môi trư ng dinh dư ng cao hay b sung huy t thanh v i n ng cao. - Phân tách t bào t mô non hay phôi nhanh hơn, hi u qu cao hơn, t bào thu ư c nhi u hơn, s ng và tăng sinh m nh hơn so v i các mô ã trư ng thành. IV.1.3 Nuôi c y thu nh n t bào a. Nuôi t bào sơ c p Ly tâm d ch tách t bào lo i b d ch n i, thu c n huy n phù t bào ưa d ch huy n 0 phù t bào vào bình nuôi c y (bình Roux), b sung môi trư ng 37,5 C trong t nuôi, sau 24 gi thay môi trư ng m i và ti p t c . Sau l n nuôi c y sơ s c p thu ư c các t bào sơ c p. Thành ph n t bào sơ c p r t ph c t p, bao g m nhi u lo i t bào khác nhau cùng hi n di n trong bình nuôi. có dòng t bào thu n nh t, c n th c hi n bư c ti p là ch n dòng. b. Nuôi c y phát tri n m nh mô sơ c p i v i trư ng h p lư ng m u mô quá ít, c n nuôi c y nguyên m nh mô thu nh n t bào, tránh m t m u khi tách mô: t các m nh mô trong ĩa nuôi, s d ng cùng môi trư ng v i môi trư ng nuôi t bào t mô ó. 18
Các m nh mô thư ng n i, hay lơ l ng trong môi trư ng nuôi c y, thư ng b ch t nhanh n u không bám vào b m t nuôi. Có th b sung ít môi trư ng tăng s bám dính c a m nh mô vào b m t d ng c nuôi ho c c nh m u mô b ng huy t tương/ huy t thanh. Khi các t bào ã phát tri n và lan r ng ra t các rìa c a m nh mô, ti n hành tách b m u mô và thu ư c t bào. c. C y chuy n C y chuy n r t c n cung c p ch t dinh dư ng và không gian cho các dòng t bào phát tri n liên t c. T n s và t l pha loãng, hay n ng t bào trong c y chuy n ph thu c vào các c tính c a m i dòng. N u dòng ư c c y chuy n quá thư ng xuyên hay n ng t bào quá th p, chúng có th b m t. C y chuy n bao g m các thao tác sau: - Tách b môi trư ng nuôi c y cũ. - R a b m t giá th nuôi (có t bào bám). - Tách các t bào bám kh i b m t d ng c nuôi. - Pha loãng các t bào b ng môi trư ng m i. C y chuy n các t bào bám dính: - Tách b môi trư ng kh i h p nuôi. N u các t bào bám ch t, có th b môi trư ng. N u nhi u t bào n i hay bám y u, nên l c nh và r a, sau ó làm l ng s bám dính các t bào b ng dung d ch trypsin. - R a d ng c nuôi v i PBS. - B sung dung d ch trypsin. - trong t m 370C ch ng 2 – 3 phút (tùy ki u t bào và ki u nuôi) xem dư i kính hi n vi: n u các t bào có hình tròn có nghĩa là chúng ã tách ra kh i b m t giá th nuôi. - Huy n phù v i môi trư ng có b sung huy t thanh, và r a t bào b ng cách ly tâm 800 vòng/phút trong 5 – 10 phút tái huy n phù b ng môi trư ng nuôi (bư c này có th b n u t l pha loãng cao trong môi trư ng có ch a huy t thanh) C y chuy n các t bào huy n phù: Nuôi c y các t bào trong các flask hay các spinner có th ư c duy trì b ng vi c pha loãng m t lư ng tương ương c a huy n phù t bào b ng môi trư ng tươi: - Gi flask ng th ng, dùng pipette huy n phù vài l n tách r i các c m t bào. - Tách l y m t lư ng huy n phù m ho c pha loãng vào bình nuôi m i ly tâm thu c n, lo i b d ch n i tái huy n phù c n vón vào môi trư ng tươi l y m t th tích tương ương lư ng t bào mong mu n vào các bình nuôi và ti n hành nuôi. IV.2. T O DÒNG T BÀO Vi c t o dòng m b o t t c các t bào con cháu u xu t phát t m t t bào ơn và có cùng m t c tính di truy n. Ý nghĩa c a vi c t o dòng là ngăn c n nh ng thay i nhanh, và không oán trư c trong ki u hình nuôi c y. Hơn n a vi c t o dòng cho phép sàng l c s lư ng l n các dòng cũng như ch n l c các dòng t bào v i c tính mong mu n. Nói chung vi c t o dòng cho phép ch n l c m t ch ng t bào v i các c tính t i ưu cho nghiên c u. 19
Tái t o dòng (recloning) là công vi c thi t l p l i các c tính v n có c a dòng, m t khi chúng b bi n i (b i các dòng t bào ã thi t l p có th t o ra m t s bi n i nào ó v i các c tính phù h p hơn, trong môi trư ng nuôi nào ó). N u mu n thay i các c tính t bào thông qua t bi n hay chuy n nhi m, thì vi c t o dòng không c n thi t. Do ó, có th t o các bi n i quan tr ng trong các ki u hình c bi t, sau m t vài th h c y chuy n. Trong môi trư ng nuôi c y, m t t bào riêng r s nguyên phân t o nhi u t bào con. Các t bào này qu n t t i v trí c a t bào m ban u, hình thành nên m t t p oàn (colony). Như v y, các t bào c a m t t p oàn s có cùng c tính ki u gen và ki u hình, hay nói cách khác, chúng cùng m t dòng. IV.2.1. K thu t ch n dòng t bào Phương pháp ti n hành: - Dùng dung d ch trypsin tách r i các t bào t ĩa nuôi c y, t o huy n phù t bào. - C y t bào vào ĩa nuôi có môi trư ng m i v i m t th p ( các t bào cách xa nhau trong ĩa nuôi). Nuôi t bào cho n khi chúng phát tri n các colony riêng r . - Ch n m t colony t bào c n t o dòng, cô l p b ng m t m t ng kim lo i n ng có kích thư c phù h p. Hút b môi trư ng trong ng và tách các t bào t colony này b ng trypsin, c y sang ĩa môi trư ng m i. N u c n thi t có th th c hi n bư c ch n dòng này vài l n n a cho n khi m b o thu ư c dòng t bào t m t t bào u tiên. C y chuy n t bào - b môi trư ng cũ. - Cho PBS vào bình Roux (-), l c nh r a s ch t bào ch t và huy t thanh, b PBS (-), l p l i 2 l n. - Cho trypsin-EDTA cho vào bình Roux. - L c nh bình Roux. - b trypsin, v nh bình Roux t bào tách kh i vách bình Roux. - Cho 2ml E’MEM vào bình Roux, tráng u lên b m t bình Roux có t bào. - Hút vào m i bình Roux m i 5ml môi trư ng E’MEM. - Dùng pipette hút s c môi trư ng và phun u vào b m t bình Roux có t bào t o huy n phù. - Hút d ch huy n phù cho vào bình Roux m i, l c nh , 37,50C trong t nuôi. - Sau 24 gi , b môi trư ng cũ, cho môi trư ng m i vào lo i b trypsin và các t bào ch t. M t bình Roux ch a y t bào có th c y chuy n sang 3 ho c 4 bình Roux m i. 20