Hoàn thiện kỹ thuật RT-qPCR để đánh giá mức độ biểu hiện MRNA của gen SPAG8

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sự điều hòa quá trình sinh trưởng và biệt hóa tinh trùng ở nam giới do nhiều gen quy định. Gen SPAG8 (Sperm associated antigen 8) là một trong những gen tham gia vào quá trình đó mà vai trò của nó còn chưa được minh chứng rõ ràng. Bài viết trình bày việc hoàn thiện quy trình kỹ thuật RT-qPCR (Revese transcription - quantitative polymerase chain reaction) để đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của gen SPAG8 ở nam giới vô sinh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hoàn thiện kỹ thuật RT-qPCR để đánh giá mức độ biểu hiện MRNA của gen SPAG8

JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2021 HOÀN THIỆN KỸ THUẬT RT-QPCR ĐỂ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN MRNA CỦA GEN SPAG8 Luyện Thị Thanh Nga1, Nguyễn Hoàng Việt1, Đoàn Thị Kim Phượng1,2, Đào Ngọc Bắc1, Đặng Đình Phúc Duy1, Trần Thị Huyền Trang1, Vũ Thị Hà1,2 TÓM TẮT technique in evaluating the mRNA expression level of Sự điều hòa quá trình sinh trưởng và biệt hóa tinh SPAG8 gene in blood samples from infertile males. trùng ở nam giới do nhiều gen quy định. Gen SPAG8 Material and methods: total RNA from 50 (Sperm associated antigen 8) là một trong những gen tham peripheral blood samples (25 samples of infertile males, gia vào quá trình đó mà vai trò của nó còn chưa được minh 25 samples of control group) were extracted. The mRNA chứng rõ ràng. expression level of SPAG8 gene were determined Mục tiêu: Hoàn thiện quy trình kỹ thuật RT-qPCR using RT-qPCR assay. PCR products were tested by (Revese transcription - quantitative polymerase chain electrophoresis on agarose gel 1%. reaction) để đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của gen Results: 100% mRNA samples were extracted SPAG8 ở nam giới vô sinh. successfully from the peripheral blood samples with Đối tượng và phương pháp: 50 mẫu máu ngoại vi accepted purity. cDNAs were synthesized successfully (25 mẫu của bệnh nhân vô sinh nam, 25 mẫu của nhóm (100%) from mRNA samples using reverse transcription chứng). Sử dụng kỹ thuật RT-qPCR để khảo sát biểu hiện technique. The quality of cDNA samples was examined mRNA của gen SPAG8 từ các mẫu bệnh phẩm kể trên. by agarose electrophoresis after the PCR amplification Kết quả: 100% mẫu mRNA được tách chiết thành of GADPH. công từ máu ngoại vi với độ tinh sạch đạt chuẩn. 100% Conclusions: All stages of RT-qPCR procedure cDNA được tổng hợp thành công từ mRNA bằng quá were completed, each stage had its own criteria to trình sao mã ngược. Chất lượng cDNA được kiểm chứng control which ensured that the procedure works well, the bằng hình ảnh điện di trên thạch agarose sau phản ứng results can be analyzed clearly. Consequently, the mRNA PCR khuếch đại đoạn gen GAPDH. Kết luận: Hoàn expression level of SPAG8 gene in infertile male patients thiện thành công quy trình kỹ thuật RT-qPCR với nhiều can be evaluated accurately. giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn đều có các tiêu chuẩn Key worlds: Male infertility, mRNA, RT-qPCR, để đối chứng, đảm bảo cho quy trình được thành công và SPAG8. kết quả phân tích được rõ ràng và cho phép đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của gen SPAG8 trên đối tượng nam I. ĐẶT VẤN ĐỀ giới vô sinh. Vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng trong độ tuổi Từ khóa: Vô sinh nam, mRNA, RT - qPCR, sinh đẻ, có sinh hoạt tình dục bình thường trên một năm và SPAG8. không dùng biện pháp tránh thai nào mà không thể có thai1. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, trong số các cặp vợ chồng SUMARY ở độ tuổi sinh sản gặp vấn đề về việc sinh con thì 30 - COMPLETE RT-qPCR TECHNIQUE IN 40% do nam giới, 40% do nữ giới, 10% do cả nam và nữ, EVALUATING THE mRNA EXPRESSION OF 10% không rõ nguyên nhân2. Vô sinh ở nam giới do nhiều SPAG8 GENE nguyên nhân gây nên, mỗi nguyên nhân có những cách The regulation of spermatogenesis and sperm điều trị khác nhau. Để điều trị hiệu quả và có thái độ xử lý differentiation is controlled by different types of gene. đúng đắn, tư vấn di truyền, chẩn đoán nguyên nhân gây vô SPAG8 (sperm associated antigen 8) is a gene involving sinh nam giới là hết sức cần thiết. in the regulation process but the role of this gene remains Ngày nay, di truyền y học phát triển nhanh, mạnh; có unclear. nhiều kỹ thuật xác định được các nguyên nhân di truyền Objectives: Complete the RT-qPCR (Reverse gây vô sinh mà trước đây được cho là vô sinh không rõ transcription - quantitative polymerase chain reaction) nguyên nhân, các xét nghiệm này đã và đang góp phần định 1. Trường Đại học Y Hà Nội - Hanoi Medical University 2. Bệnh viện ĐH Y Hà Nội - Hanoi Medical University Hospital Chịu trách nhiệm chính: Vũ Thị Hà 0984736919 vuthiha@hmu.edu.vn 160 Số chuyên đề 2021 Website: tapchiyhcd.vn
hướng cho can thiệp và điều trị. 2. Phương pháp nghiên cứu Gen SPAG8 (Sperm associated antigen 8) mã hóa cho Phương pháp mô tả cắt ngang. protein cùng tên, protein này được cho là có liên quan đến 2.2.1. Tách chiết mRNA: mRNA từ mẫu máu được quá trình sinh trưởng và biệt hóa tinh trùng3. Nghiên cứu tách chiết bằng bộ kit Qiagen của Rong Li và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng SPAG8 tham 2.2.2. Tổng hợp cDNA: mRNA thu được với độ gia vào quá trình tạo tơ phân bào khi tế bào phân chia, nó tinh sạch đạt chuẩn được chuyển thành cDNA bằng bộ làm chậm sự tăng sinh của tế bào bằng cách kéo dài pha kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo G2/M. Trong khi đó, SPAG8 lại khu trú ở tinh hoàn trong Fisher Scientific, USA). Sử dụng 5µl RNA ly trích và tất cả các giai đoạn của quá trình sinh tinh. Những kết quả 15µl RevertAid First Strand cDNA Synthesis mix, dùng này cho thấy SPAG8 có thể đóng một vai trò trong sự phân mồi Oligo (dT)18 với chu trình nhiệt: 42°C - 60 phút, chia tế bào trong quá trình sinh tinh4. 72°C - 5 phút. Bằng phương pháp hóa mô miễn dịch, Miao và cộng Kiểm tra chất lượng cDNA đã tổng hợp bằng cách sự (2010) đã tìm thấy biểu hiện của SPAG8 trong tinh hoàn thực hiện phản ứng PCR với gen nội chuẩn GAPDH. nhưng không có trong não, gan hoặc thận. Các bản sao của Thành phần phản ứng gồm có Master mix 2x, cặp mồi nó được phát hiện trong các tinh nguyên bào và tế bào tiền GAPDH F/R, cDNA, nước cất. Chu trình nhiệt của phản tinh trùng nhưng không có trong ống sinh tinh. Ngoài ra, ứng: 94°C - 3 phút, 35 chu kì (94°C - 30 giây, 58°C - mRNA của gen SPAG8 cũng được thấy ở vùng cực đầu và 30 giây, 72°C - 45 giây), 72°C - 5 phút. Sau đó mẫu phần giữa của đuôi tinh trùng. Nghiên cứu này cũng chỉ ra được bảo quản ở 4°C. Sản phẩm PCR được chạy trên gel rằng SPAG8 hoạt động như một chất điều hòa ACT và đóng agarose 1% để kiểm tra. một vai trò quan trọng trong quá trình phiên mã gen qua 2.2.3. Biểu hiện mNRA bằng kỹ thuật qPCR: cDNA trung gian CREM-ACT trong quá trình sinh tinh5. sau khi được tổng hợp sẽ được khuếch đại nhằm phát Vai trò cụ thể của SPAG8 trong quá trình sinh tinh hiện gen SPAG8 và gen GADPH. Sự hiện diện của 2 gen chưa được chứng minh rõ ràng, do vậy chúng tôi thực hiện này được xác định bằng kỹ thuật realtime - PCR với chất đề tài này với mục tiêu: Hoàn thiện quy trình kỹ thuật RT- màu huỳnh quang là SYBR Green. qPCR (Reverse transcription quantitative polymerase Trình tự cặp mồi đặc hiệu cho gen SPAG8 đã được chain reaction) để đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của mô tả trước đây6: gen SPAG8 ở nam giới vô sinh. F - CAAGCATGCAGGATGGCTCT R - ATGGCTTCACGCTTCCCTCG. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN Chu trình luân nhiệt gồm 3 giai đoạn: giai đoạn 1 CỨU gồm 2 bước 50°C - 2 phút, 95°C - 10 phút; giai đoạn 2 1. Đối tượng nghiên cứu: (PCR) 40 chu kì (95°C - 15 giây, 60°C - 1 phút), đọc tín Có 50 mẫu máu ngoại vi gồm: 25 mẫu được thu hiệu huỳnh quang ở bước 60°C; giai đoạn 3 (melt curve) thập từ bệnh nhân nam trong độ tuổi sinh sản (20 - 55 gồm 3 bước 95°C - 15 giây, 60°C - 1 phút, 95°C - 1 giây. tuổi), vô sinh chưa rõ nguyên nhân25 mẫu máu ngoại vi, 3. Đạo đức nghiên cứu được thu thập từ người nam bình thường trong độ và tuổi Các số liệu và thông tin nghiên cứu hoàn toàn chính sinh sản và đã có ít nhất một con. xác, trung thực, khách quan và được chấp thuận bởi cơ + Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2020 đến tháng sở nghiên cứu. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí 9/2021. mật và chỉ phục vụ công tác nghiên cứu. + Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Di truyền lâm III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU sàng và Hệ gen, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. 1. Kết quả tách chiết RNA Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch RNA của 42 mẫu máu Cao nhất Thấp nhất Trung bình Nồng độ 99,2 6,8 34,63±22,45 RNA (ng/µl) OD 260/280 2,19 1,73 2,03±0.89 (nm) Nhận xét: Kết quả tách chiết bằng bộ kit Qiagen cho nồng độ RNA >1ng/µl và độ tinh sạch >1,7 ở tất cả các mẫu. Nồng độ RNA thấp nhất là 6,8ng/µl, cao nhất là 99,2ng/µl. Số chuyên đề 2021 Website: tapchiyhcd.vn 161
JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2021 2. Kết quả sao mã ngược cDNA từ mRNA Hình 3.1. Hình ảnh điện di khuếch đại gen GADPH từ cDNA M: Thang chuẩn 100bp C1, C2: sản phẩm PCR của mẫu chứng S1, S2: sản phẩm PCR của mẫu bệnh nhân Nhận xét: Sau khi khuếch đại cDNA của gen GADPH ở 2 mẫu bệnh nhân và 2 mẫu chứng, kết quả điện di cho thấy tất cả các mẫu đều xuất hiện băng điện di kích thước khoảng 496bp. Kết quả cho thấy chất lượng mRNA của các mẫu tốt, đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng, đồng thời không có sự khác biệt về lượng mẫu đã sử dụng trong mỗi phản ứng PCR. 3. Kết quả qPCR Hình 3.2: Hình ảnh kết quả của từng mẫu 162 Số chuyên đề 2021 Website: tapchiyhcd.vn
Hình 3.3: Hình ảnh kết quả của toàn bộ 50 mẫu Nhận xét: Hình ảnh sau khi chạy bằng kỹ thuật realtime - PCR cho thấy tín hiệu huỳnh quang ở mỗi giếng đều rõ nét, không có mẫu nào bị ức chế. Hình 3.4: Hình ảnh đường cong nóng chảy của gen SPAG8 Hình 3.5: Hình ảnh đường cong nóng chảy của gen GADPH Nhận xét: Đường cong nóng chảy của gen SPAG8 mồi đặc hiệu và quy trình phản ứng PCR được thiết kế và gen GADPH ở mỗi giếng đều chỉ có 1 đỉnh, chứng tại phòng thí nghiệm có chất lượng tốt, tính đặc hiệu cao. tỏ sản phẩm PCR được tạo ra ở mỗi giếng là đặc hiệu (không có sản phẩm phụ). Kết quả này cũng chứng tỏ Số chuyên đề 2021 Website: tapchiyhcd.vn 163
JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2021 IV. BÀN LUẬN tế bào ít hơn dẫn đến nồng độ RNA thu được thấp hơn ở Trong nghiên cứu của chúng tôi, tất cả 50 mẫu mẫu mô. Tuy nhiên kết quả kiểm tra cDNA đã tổng hợp RNA tách chiết từ máu ngoại vi bằng bộ kit Qiagen cho bằng cách thực hiện phản ứng PCR với gen nội chuẩn nồng độ RNA trung bình là 34,63±22,45ng/µl, tối thiểu GAPDH ở nghiên cứu của chúng tôi và các tác giả khác là 6,8ng/µl với độ tinh sạch >1,7. Như vậy lượng RNA đều cho thấy chất lượng mRNA của các mẫu tốt, đảm tổng số được sử dụng cho mỗi phản ứng tổng hợp cDNA bảo tiêu chuẩn cho phản ứng. trong khoảng từ 34ng - 0,5 µg. Đây là nồng độ đạt tiêu Nghiên cứu của Barber RD và cộng sự đã chỉ ra chuẩn đảm bảo lượng RNA tổng số trong khoảng 0,1ng - rằng không có sự khác biệt nào về biểu hiện mRNA của 5µg để thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA theo khuyến gen GAPDH giữa các lứa tuổi. Trong cùng một loại mô, cáo của Thermo Scientific cho kit. sự khác biệt này gần như không đáng kể8. Do đó gen Trong nghiên cứu của Siliņa K và cộng sự(2011), GAPDH thường được dùng như một gen nội chuẩn để để đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của gen SPAG8 đánh giá chất lượng của sản phẩm RNA. trên một số mẫu mô, lượng RNA tổng số được dùng cho Đường cong khuếch đại và đường cong nóng chảy mỗi phản ứng tổng hợp cDNA là 2µg6. ở mỗi mẫu đều đạt yêu cầu chứng tỏ mồi đặc hiệu và quy Theo nghiên cứu của Hồ Hoàng Thị Kim Huệ và trình phản ứng PCR được thiết kế tại phòng thí nghiệm cộng sự về mức độ sao mã (biểu hiện) mRNA của gen có chất lượng tốt, tính đặc hiệu cao. EGFR trong bệnh ung thư biểu mô tuyến vú, nồng độ RNA tách chiết từ mẫu mô tuyến vú đạt giá trị trung bình V. KẾT LUẬN là 65,96 ± 43,16ng/µl ở nhóm chứng và ở nhóm bệnh là Hoàn thiện thành công quy trình đánh giá mức độ 170,03 ± 201,70 ng/µl7. biểu hiện mRNA của gen SPAG8 bằng kỹ thuật RT-qPCR Có thể thấy nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả từ tế bào máu ngoại vi. tách chiết RNA có nồng độ thấp hơn so với nghiên cứu của các tác giả khác. Đều này có thể giải thích được là do mẫu nghiên cứu chúng tôi sử dụng là mẫu máu, lượng TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. World Health Organization, eds. WHO Manual for the Standardized Investigation, Diagnosis, and Manage- ment of the Infertile Male. Published on behalf of the World Health Organization by Cambridge University Press; 2000. 2. EAU Guidelines: Male Infertility Uroweb. Accessed June 24, 2020. https://uroweb.org/guideline/male-infer- tility/ 3. SPAG8 Gene. GeneCards®: The Human Gene Database. https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp. pl?gene=SPAG8 4. Li R., Tang X.L, Miao S.Y, Zong S.D, Wang L.F. Regulation of the G2/M phase of the cell cycle by sperm as- sociated antigen 8 (SPAG8) protein. Cell Biochem Funct. 2009;27(5):264-268. doi:10.1002/cbf.1574 5. Wu H., Chen Y., Miao S. et al. Sperm associated antigen 8 (SPAG8), a novel regulator of activator of CREM in testis during spermatogenesis. FEBS Letters. 2010;584(13):2807-2815. doi:10.1016/j.febslet.2010.05.016 6. Siliņa K., Zayakin P., Kalniņa Z. et al. Sperm-associated antigens as targets for cancer immunotherapy: ex- pression pattern and humoral immune response in cancer patients. J Immunother. 2011;34(1):28-44. doi:10.1097/ CJI.0b013e3181fb64fa 7. Hồ Hoàng Thị Kim Huệ, Hà Thị Minh Thi, Phan Thị Minh Phương. Study on transcription possibility of epidermal growth factor receptor(EGFR) gene in breast carcinoma tissues by reverse transcription - PCR assay. Journal of medicine and pharmacy. 2015;27:32-38. 8. Barber R.D., Harmer D.W., Coleman R.A., Clark B.J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiol Genomics. 2005;21(3):389-395. doi:10.1152/physiol- genomics.00025.2005 164 Số chuyên đề 2021 Website: tapchiyhcd.vn