Hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne spp. của vi khuẩn Bacillus velezensis EK7 ở vùng rễ cây hồ tiêu

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu cơ chế kháng tuyến trùng của chủng EK7 được thực hiện bằng đánh giá ảnh hưởng của enzyme đến tỷ lệ tử vong tuyến trùng. Kết quả cho thấy, chitinase thu nhận từ chủng EK7 có thể tác động lên tỷ lệ tử vong của tuyến trùng tại thời điểm 24h và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng vào các thời điểm khảo sát 24h, 48h, 72h. Enzyme protease chỉ tác động tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng vào thời điểm 72h.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne spp. của vi khuẩn Bacillus velezensis EK7 ở vùng rễ cây hồ tiêu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019 HOẠT TÍNH KHÁNG TUYẾN TRÙNG Meloidogyne spp. CỦA VI KHUẨN Bacillus velezensis EK7 Ở VÙNG RỄ CÂY HỒ TIÊU TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG1,*, LÊ KHÁNH LINH 2 NGUYỄN ANH DŨNG2,**, LÊ THỊ ÁNH HỒNG3,*** 1 Khoa KHTN&CN, Trường Đại học Tây Nguyên 2 Viện CNSH&MT, Trường Đại học Tây Nguyên 3 Viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh * Email: tthtrang@ttn.edu.vn ** Email: nazdungtaynguyenuni@gmail.com *** Email: anhhongbi@yahoo.com Tóm tắt: Tuyến trùng nốt rễ Meloidogyne spp. là nhóm đối tượng gây hại phổ biến trên cây hồ tiêu (Piper nigrum). Nghiên cứu được tiến hành nhằm tuyển chọn, định danh và đánh giá hoạt tính kháng tuyến trùng của chủng vi khuẩn vùng rễ ứng dụng trong phòng trừ tuyến trùng gây bệnh trên cây hồ tiêu. Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn EK7 có khả năng kháng tuyến trùng cao trong điều kiện in vitro với tỷ lệ tử vong 99%. Chủng này được định danh bằng giải trình tự gen 16S rRNA với tên khoa học là Bacillus velezensis EK7. Nghiên cứu cơ chế kháng tuyến trùng của chủng EK7 được thực hiện bằng đánh giá ảnh hưởng của enzyme đến tỷ lệ tử vong tuyến trùng. Kết quả cho thấy, chitinase thu nhận từ chủng EK7 có thể tác động lên tỷ lệ tử vong của tuyến trùng tại thời điểm 24h và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng vào các thời điểm khảo sát 24h, 48h, 72h. Enzyme protease chỉ tác động tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng vào thời điểm 72h. Từ khóa: Tuyến trùng, vi khuẩn vùng rễ, protease, chitinase, Bacillus velezensis. 1. MỞ ĐẦU Hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp có giá trị kinh tế và xuất khẩu cao của Việt Nam. Hiện nay, diện tích hồ tiêu vẫn tiếp tục tăng, tính đến tháng 12/2018, cả nước đã trồng trên 150.000 ha (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Ở nước ta, vùng trồng tiêu lớn nhất hiện nay tập trung ở các tỉnh Đông Nam Bộ (Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu và Đồng Nai), Tây Nguyên (Đắk Nông, Đắk Lắk và Gia Lai). Tuy nhiên, do lợi nhuận kinh tế cao từ cây tiêu đem lại nên gây ra tình trạng phát triển cây hồ tiêu ồ ạt và không theo quy hoạch. Cả nước đang đối mặt với nhiều thách thức và phát triển thiếu bền vững, nhất là diện tích hồ tiêu phát triển quá nhanh, vườn cây được đầu tư thâm canh cao độ, nhiều vườn tiêu bị hủy diệt do sự phá hại của sâu bệnh… gây thiệt hại lớn cho bà con nông dân (Hoàng Thanh Tiệm và cộng sự, 2007). Trong đó, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. là một trong những nhóm đối tượng gây hại rất phổ biến trên cây hồ tiêu còn gọi là tác nhân gây bệnh vàng lá, chết chậm (Trần Thị Thu Hà và cộng sự, 2011). Theo Cục Bảo vệ Thực vật, tháng 4/2019 trên cả nước tổng diện tích hồ tiêu bị nhiễm bệnh chết chậm là 6,759 ha (tăng 87 ha so với cùng kỳ trước, tăng 1,675 ha so với cùng kỳ năm trước), nhiễm nặng 1.815 ha. Các biện pháp kiểm soát tuyến trùng chủ yếu bao gồm các biện pháp hóa học, sinh học, vật lý và sử dụng giống cây trồng kháng bệnh. Việc sử dụng thuốc hóa học tiêu diệt tuyến trùng thường gây ô nhiễm môi trường và tồn dư các độc tính. Vì vậy, biện pháp sinh học được xem là giải pháp tối ưu nhất với các tác nhân phòng trừ trong đó có vi khuẩn (Cetintas và cộng sự, 2018). Vi khuẩn vùng rễ có thể được sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học vì chúng là nhóm vi khuẩn sống ở vùng rễ dưới dạng vi sinh vật đất có vai trò quan trọng trong việc đối kháng vi sinh vật gây bệnh hại ký chủ và kích thích sinh trưởng của cây trồng (Kloepper và cộng sự, 1992). 368
HỘI THẢO KHOA HỌC QUỐC GIA CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU TRẺ | 11/2019 Trên thế giới đã ghi nhận nhiều chủng vi khuẩn vùng rễ thuộc chi Bacillus và Pseudomonas có khả năng kích thích sinh trưởng, kiểm soát bệnh do tuyến trùng gây ra như Pseudomonas putida và Pseudomonas alcaligenes tác động lên tuyến trùng Meloidogyne javanica và kích thích sinh trưởng trên cây đậu (Siddiqui và cộng sự, 2009), Bacillus cereus và Bacillus pumilus tác động lên tuyến trùng Meloidogyne incognita (Gao và cộng sự, 2016; Cetintas và cộng sự, 2018) và kích thích sinh trưởng trên cây cà chua, các chủng Bacillus amyloliquefaciens, B. mojavensis, B. safensis và B. subtilis tác động lên tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại trên cây bông (Xiang và cộng sự, 2014). Mục tiêu nghiên cứu này nhằm tuyển chọn, định danh và đánh giá hoạt tính kháng tuyến trùng của chủng vi khuẩn vùng rễ ứng dụng trong phòng trừ tuyến trùng gây bệnh trên cây hồ tiêu trên địa bàn tỉnh Đắk Lắk. 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu 1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng Meloidogyne spp. trong điều kiện in vitro. 2. Định danh các chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne spp. cao trong điều kiện in vitro bằng phương pháp sinh học phân tử. 3. Ảnh hưởng của enzyme protease và chintinase đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. theo thời gian. 2.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu Các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu được phân lập tại tỉnh Đắk Lắk lưu trữ tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh, Bộ môn Sinh học, Trường Đại học Tây Nguyên. Tuyến trùng và trứng Meloidogyne spp. gây u sung rễ cây Hồ tiêu. Hóa chất sử dụng bao gồm: Thuốc thử DNS, dung dịch huyền phù chitin 1%, dung dịch N-acetylglucosamin, đệm tris HCl 0.05M pH 8, dung dịch casein 1%, dung dịch TCA 5%, dung dịch NaOH 0,5N; HCl 0,2N, thuốc thử Folin, dung dịch Tyrosin. Một số môi trường dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu: LB, LB-chitin 1%, LB-casein 1% 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng Meloidogyne spp. trong điều kiện in vitro Thu nhận tuyến trùng từ trứng: Thu nhận rễ tiêu bị u sưng (khi thu nhận sử dụng kéo sạch và cắt sát, không để vết thương hở tiếp xúc với đất), đựng trong túi nilon sạch. Rửa sạch rễ đã thu nhận, dùng dao lam hoặc dao rọc giấy, cắt phần vỏ, lấy các bọc trứng chuyển vào đĩa petri, bổ sung nước cất vô trùng, đậy nắp đĩa petri, để tối, ủ ở nhiệt độ phòng từ 24 - 48h. Đếm xác định mật độ tuyến trùng. Xác định hoạt tính kháng tuyến trùng của vi khuẩn vùng rễ trong điều kiện in vitro được thực hiện theo hai bước: Bước 1: Sàng lọc sơ bộ hoạt tính kháng tuyến trùng của các chủng vi sinh vật vùng rễ cây hồ tiêu nhằm thu hẹp tổng số chủng vi khuẩn phải tập trung nghiên cứu, chúng tôi sử dụng phương pháp của Aravind cải tiến. Cách tiến hành: nhân nuôi vi khuẩn vùng rễ trong môi trường LB lỏng, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ thường trong 12 giờ. Hút 0,4ml huyền phù vi khuẩn pha loãng đạt OD 610nm khoảng 0,2 -0,3, ly tâm lạnh ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn. Bổ 369
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019 sung vào mỗi giếng chứa 0,1ml nước cất vô trùng chứa khoảng 30 tuyến trùng. Giếng được ủ ở nhiệt độ thường trong 24 giờ. Đối chứng là nước cất. Đếm số tuyến trùng chết trong mỗi giếng bằng kính hiển vi soi nổi. Tuyến trùng được cho là đã chết khi kiểm tra thấy cơ thể chúng nằm bất động, duỗi thẳng, nội tạng bị phá hủy. Bước 2: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có hoạt tính kháng tuyến trùng được thực hiện theo phương pháp của Aravind (2010) và Chen (2000). Các bước tiến hành: Xây dựng đường chuẩn vi khuẩn vùng rễ đã thể hiện hoạt tính kháng tuyến trùng ở bước 1. Sau đó, nhân nuôi vi khuẩn trong môi trường LB lỏng, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ thường trong 24 giờ. Hút 0,4 ml huyền phù vi khuẩn vùng rễ, mật độ 107 CFU/ml cho vào mỗi giếng, ly tâm lạnh ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch, thu cặn. Bổ sung 0,1ml nước cất vô trùng chứa khoảng 30 tuyến trùng. Giếng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 24h. Đếm số tuyến trùng chết trong mỗi giếng. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng tuyến trùng chết lô thí nghiệm so với lô đối chứng. Tỷ lệ tuyến trùng chết được tính theo công thức: Số tuyến trùng chết Tỷ lệ tử vong % = × 100% Tổng số tuyến trùng Đánh giá hoạt tính kháng tuyến trùng của vi khuẩn như sau: - Hoạt tính cao (+++): Tỷ lệ tuyến trùng bị chết trên 80%. - Hoạt trung bình (++): Tỷ lệ tuyến trùng bị chết từ 60 – 80%. - Hoạt tính yếu (+): Tỷ lệ tuyến trùng bị chết dưới 60%. - Không có hoạt tính (-): Tỷ lệ tuyến trùng chết 0% 2.3.2. Định danh sinh học phân tử các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có hoạt tính kháng tuyến trùng cao Chủng vi khuẩn có hoạt tính cao được gửi định danh tại Công ty Cổ phần Công nghệ TBR (553 Hương Lộ 2, phường Bình Trị Đông, quận Bình Tân, TP. Hồ Chí Minh) thông qua giải trình tự gen 16S rRNA với cặp mồi 27F và 1492R. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA version 6.0. 2.3.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng theo thời gian Thu nhận enzyme chitinase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung chitin 1%: Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thích hợp có bổ sung chitin 1% không có agar ở 300C, tốc độ lắc 150 vòng/phút, nuôi cấy trong 5 ngày, sau đó ly tâm dịch nuôi cấy (8.000 vòng/10 phút) ở 4oC để loại bỏ vi khuẩn, thu dịch trong. Một phần dịch được sử dụng để xác định hoạt tính enzyme chitinase bằng phương pháp định lượng đường khử dựa trên sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase là N - acetyl - glucosamine. Thu enzyme protase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung casein 1%: Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thích hợp có bổ sung casein 1% không có agar ở 300C, tốc độ lắc 150 vòng/phút, nuôi cấy trong 5 ngày, sau đó ly tâm dịch nuôi cấy (8.000 vòng/10 phút) ở 4oC để loại bỏ vi khuẩn, thu dịch trong. Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Anson cải biên dựa trên sản phẩm thủy phân casein bởi protease là tyrosin. 370
HỘI THẢO KHOA HỌC QUỐC GIA CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU TRẺ | 11/2019 Thu dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng: Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB lỏng, chuyển 1ml dịch vi khuẩn với nồng độ đạt 108cfu/ml vào môi trường LB bổ sung tuyến trùng làm cơ chất, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày ly tâm 8.000 vòng/10 phút ở 4oC, thu dịch. Một phần dịch được sử dụng để xác định hoạt tính enzyme chitinase và protease. Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, enzyme protease và chintinase đến tỷ lệ chết của tuyến trùng theo thời gian được tiến hành theo phương pháp của Gao (2016) cải tiến: Hút 200μl dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein sau khi thu nhận vào ống eppendorf 1,5ml chứa 100μl nước cất vô trùng có khoảng 30 tuyến trùng, bổ sung 100 μg/ml steptomycine, 100 μg/ml chloramphenicol, lắc đều. Ủ 20oC, theo dõi số tuyến trùng chết trong các ống eppendorf ở các thời điểm 12h , 24h, 48h. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được tiến hành tương tự với dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein đã bất hoạt bằng nhiệt độ. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đối chứng môi trường: 200μl môi trường nuôi vi khuẩn+0,1ml nước cất vô trùng chứa khoảng 30 tuyến trùng + 100 μg/ml steptomycine+ 100 μg/ml chloramphenicol, lặp lại 3 lần. Đối chứng nước: 0,1ml nước cất vô trùng chứa 30 tuyến trùng + 200μl nước cất vô trùng, lặp lại 3 lần. 2.3.4. Phương pháp xác định ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase đến tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng theo thời gian Hút 200 μl dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein sau khi thu nhận vào ống eppendorf 1.5ml chứa 100μl nước cất vô trùng có khoảng 30 trứng tuyến trùng (trứng được thu nhận bằng cách bóc trực tiếp từ rễ tiêu bị u sưng), bổ sung 100μg/ml steptomycine, 100μg/ml chloramphenicol, lắc đều. Ủ 20oC, theo dõi số tuyến trùng chết trong các ống eppendorf ở các thời điểm 12h, 24h, 48h và 72h. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được tiến hành tương tự với dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein đã bất hoạt bằng nhiệt độ. Đối chứng môi trường: 200𝜇l môi trường nuôi vi khuẩn+0,1ml nước cất vô trùng chứa khoảng 30 trứng tuyến trùng + 100𝜇g/ml steptomycine+ 100𝜇g/ml chloramphenicol, lặp lại 3 lần. Đối chứng nước: 0,1ml nước cất vô trùng chứa 30 tuyến trùng + 200𝜇l nước cất vô trùng, lặp lại 3 lần. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình SAS (Statistical Analysis Systems) phiên bản 9.1 dùng cho Windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,01 của giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau. 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng Meloidogyne spp. trong điều kiện in vitro Từ 44 chủng vi khuẩn vùng rễ phân lập tại tỉnh Đắk Lắk, sau khi sàng lọc sơ bộ các chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng tại bước 1 mục 2.3.1 thu nhận được 21 chủng. Các chủng này tiếp tục được tuyển chọn tại bước 2 mục 2.3.1 kết quả ghi nhận ở bảng 1. Khả năng đối kháng tuyến trùng của các chủng với tỷ lệ tử vong cao hơn so với đối chứng, 6 chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne spp với tỷ lệ tuyến trùng chết >95% bao gồm EK2, EK7, BH3, BH11, KN3. Trong đó, chủng EK7 có tỷ lệ tử vong tuyến trùng cao nhất 99% được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Mekete và cs (2009) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của dịch lọc từ vi khuẩn vùng rễ cây cà phê kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita. Kết quả nghi nhận trong 43 chủng vi khuẩn được thử nghiệm có 14 chủng có khả năng ức chế tuyến trùng M. incognita J2 từ 38-98% sau 3 ngày. Khả năng 371
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019 ức chế tuyến trùng M. incognita J2 cao nhất đối với B. megaterium, A. radiobacter và C. davisae đạt 98,3%, 97,3% và 94,6%. Như vậy, chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu tuyển chọn EK7 có hoạt tính kháng tuyến trùng trong nghiên cứu này tương đương với kết quả của nhóm tác giả trên. Bảng 1. Khả năng kháng tuyến trùng của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu phân lập tại Đắk Lắk STT Chủng Tỷ lệ tử vong (%)* Hoạt tính kháng ** 1 EK1 73,0gh ++ 2 EK2 98,0ab +++ 3 EK4 90,7abcde +++ 4 EK7 99,0a +++ 5 EK10 88,3abcde +++ 6 EK12 78,7defgh ++ 7 KN3 96,0abc +++ 8 KN5 74,7fgh ++ 9 KN6 87,0abcdef +++ 10 KN7 77,3abcdefg ++ 11 KN8 83,7cdefg +++ 12 KN10 78,7defgh ++ 13 KN11 85,0bcdefg +++ 14 KN12 68,3h ++ 15 BH3 96,7abc +++ 16 BH6 91,3abcd +++ 17 BH7 86,0abcdef +++ 18 BH8 78,3defgh ++ 19 BH11 95,7abc +++ 20 BH13 79,0defgh ++ 21 BH14 80,3defgh +++ 22 ĐC 13,3i - LSD0,01 15,38 - CV% 8,37 - Ghi chú: * Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g, h trong cùng một cột là khác biệt có ý nghĩa thống kê với trắc nghiệm Duncan với P
HỘI THẢO KHOA HỌC QUỐC GIA CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU TRẺ | 11/2019 Bacillus velezensis MG5213 (MN368201), B. velezensis TPS3N (MK130897) và B. velezensis TPSA (MK130896). Kết quả phân tích phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 6.0 (Hình 1) cho thấy chủng EK7 có quan hệ di truyền gần gũi nhất với B. velezensis. Hình 1. Cây phân loại thể hện mối liên quan giữa chủng EK7 với các loài gần gũi dựa trên trình tự 16S rRNA 3.3. Ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase thu nhận từ chủng EK7 đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng theo thời gian Protease là một enzyme có khả năng phá vỡ các liên kết peptide trong protein và được chia thành hai loại dựa trên vị trí của các liên kết peptide: endopeptidase và exopeptidase. Endopeptidase xúc tác sự phân hủy các liên kết peptide trong chuỗi polypeptide, trong khi exopeptidase là nguyên nhân phá vỡ liên kết peptide ở cuối chuỗi polypeptide. Enzyme protease ngoại bào được sản xuất bởi vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát một số loại mầm bệnh thực vật, trong đó có tuyến trùng (Kerry 2000; Compant và cộng sự, 2005; Khatamidoost và cộng sự, 2015). Bên cạnh protease, vi khuẩn vùng rễ còn có khả năng sản sinh chitinase để kháng lại mầm bệnh. Enzyme thủy phân liên kết β-1,4 giữa N-acetyl glucosamine (NacGlc) trên chitin là một polysacharide của thành tế bào của nấm và tuyến trùng (Quecine và cộng sự, 2008). Mặt khác, chitinase có thể ức chế tỷ lệ trứng nở của tuyến trùng Globodera rostochiensis lên đến 70% (Cronin và cộng sự, 1997). Kết quả bảng 2 cho thấy, dịch nuôi cấy chủng EK7 có bổ sung tuyến trùng có hoạt tính enzyme tương đối thấp (hoạt tính chitinase và protease đạt lần lượt 1,79UI/ml, 0,089UI/ml) so với dịch nuôi cấy có bổ sung cơ chất casein (hoạt tính protease 0,2UI/ml) và chitin (hoạt tính protease đạt 4,5UI/ml). Tại thời điểm 12h, môi trường bổ sung tuyến trùng và môi trường bổ sung chitin, tỷ lệ tử vong của tuyến trùng đều giảm khi bất hoạt dịch nuôi cấy. Tuy nhiên, tại thời điểm 24h, chỉ có môi trường bổ sung chitin tỷ lệ tử vong của tuyến trùng giảm 1,12 lần (dịch chứa enzyme chitinase đạt 81%, dịch bất hoạt đạt 78%). Như vậy, enzyme chitinase có thể tác động đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng tại thời điểm này. Tại thời điểm 48h, không có sự tác động của enzyme đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng. 373
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019 Bảng 2. Ảnh hưởng của chủng EK7 đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng trong in vitro Hoạt tính enzyme (UI/ml) 12h 24h 48h Thời gian Chitinase Protease KBH BH KBH BH KBH BH a a a a a Môi trường 1,79 0,089 83,67 78,33 88,33 93,67 95,67 100,00a bổ sung TT Môi trường - 0,2 71,00a 82,67a 82,00a 92,00a 100,00a 97,67a bổ sung casein Môi trường 4,5 - 79,333a 68,33a 81,00a 78,00b 93,67a 96,67a bổ sung chitin ĐC nước - - 4,33b 6,33b 7,67c 7,33d 8,00c 8,00c ĐC môi trường - - 12,00ab 23,00b 29,67b 22,67c 23,67b 29,33b LSD0,01 - - 21,00 21,72 11,31 8,34 7,82 13,56 CV % - - 16,90 14,70 7,20 5,19 4,45 5,55 Ghi chú: Các chữ a, b, c trong cùng một cột là khác biệt có ý nghĩa thống kê theo trắc nghiệm Duncan với P
HỘI THẢO KHOA HỌC QUỐC GIA CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU TRẺ | 11/2019 Hình 2. Tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn EK7 đến quá trình nở của trứng tuyến trùng và gây chết tuyến trùng trưởng thành (A): Trứng tuyến trùng bình thường; (B, C): Trứng tuyến trùng bị phá hủy nguyên sinh chất và nhân; (D): Trứng tuyến trùng đang nở; (E): Tuyến trùng trưởng thành; (F): Tuyến trùng chết 4. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn EK7 ở vùng rễ cây hồ tiêu có khả năng kháng tuyến trùng cao trong điều kiện in vitro với tỷ lệ tử vong 99%. Chủng này được định danh với tên khoa học Bacillus velezensis EK7 bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA. Enzyme chitinase thu nhận từ chủng EK7 có thể tác động lên tỷ lệ tử vong của tuyến trùng tại thời điểm 24h và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng vào các thời điểm khảo sát 24h, 48h, 72h. Enzyme protease chỉ tác động tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng vào thời điểm 72h. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Trần Thị Thu Hà, Nguyễn Tăng Tôn (2011). Nghiên cứu thành phần và mật số tuyến trùng gây hại trên cây hồ tiêu tại Cam Lộ, Quảng Trị. Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, Số 67(4). [2] Hoàng Thanh Tiệm, Lê Ngọc Báu, Tôn Nữ Tuấn Nam, Nguyễn Hùng, Nguyễn Thị Thoa (2007). Kỹ thuật trồng, chăm sóc và chế biến Hồ tiêu. NXB Nông nghiệp Hà Nội. [3] Aravind, R., Antony, D., Eapen, S. J., Kumar, A., & Ramana, K. V. (2009). Isolation and evaluation of endophytic bacteria against plant parasitic nematodes infesting black pepper (Piper nigrum L.). Indian Journal of Nematology, 39(2), 211-217. [4] Compant S, Duffy B, Nowak J, Clément C, Barka EA (2005). Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects. Appl Environ Microbiol. 71 (9): 4951-4959. [5] Cetintas, R., Kusek, M., & Fateh, S. A. (2018). Effect of some plant growth-promoting rhizobacteria strains on root-knot nematode, Meloidogyne incognita, on tomatoes. Egyptian Journal of Biological Pest Control, 28(1), 7. [6] Cronin, D., Moënne-Loccoz, Y., Dunne, C., & O'gara, F. (1997). Inhibition of egg hatch of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis by chitinase-producing bacteria. European Journal of Plant Pathology, 103(5), 433-440. 375
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019 [7] Gao, H., Qi, G., Yin, R., Zhang, H., Li, C., & Zhao, X. (2016). Bacillus cereus strain S2 shows high nematicidal activity against Meloidogyne incognita by producing sphingosine. Scientific reports, 6, 28756. [8] Kerry, B. R. (2000). Rhizosphere interactions and the exploitation of microbial agents for the biological control of plant-parasitic nematodes. Ann Rev Phytopathol. 38 (1): 423-441. [9] Khatamidoost, Z., Jamali, S., Moradi, M., Saberi Riseh, R. (2015). Effect of Iranian strains of Pseudomonas spp. on the control of root-knot nematodes on Pistachios. Biocontrol Sci Technol. 25 (3): 291-301. [10] Kloepper, J.W., Rodríguez-Kábana, R., McInroy, J. A., Young, R. W. (1992) Rhizosphere bacteria antagonistic to soybean cyst (Heterodera glycines) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematodes: identification of fatty acid analysis and frequency of biological control activity. Plant Soil 139(1):75–84. [11] Oka, Y., Koltai, H., Bar‐Eyal, M, Mor M, Sharon E (2000). New strategies for the control of plant‐parasitic nematodes. Pest Manag Sci (formerly Pesticide Sci) 56 (11): 983-988. [12] Quecine, M., Araujo ,W., Marcon, J., Gai, C., Azevedo, J. (2008). Chitinolytic activity of endophytic Streptomyces and potential for biocontrol. Lett Appl Microbiol. 47 (6): 486-491. [13] Siddiqui, Z. A., Akhtar, M. S. (2009). Effect of plant growth promoting rhizobacteria, nematode parasitic fungi and root-nodule bacterium on root-knot nematodes Meloidogyne javanica and growth of chickpea. Biocont Sci Technol. 19, 511-521. [14] Mekete, T., Hallmann, J., Kiewnick, S., Sikora, R. (2009). Endophytic bacteria from Ethiopian coffee plants and their potential to antagonise Meloidogyne incognita. Institute for Crop Sciences and Resource Conservation, INRES, Department of Plant Pathology, Vol. 11(1), 117-127. [15] Thongkaewyuan, A., & Chairin, T. (2018). Biocontrol of Meloidogyne incognita by Metarhizium guizhouense and its protease. Biological control, 126, 142-146. [16] Xiang, N., Lawrence, K. S., Kloepper, J. W., Mcinroy, J. A. (2014). In vitro screening of biological control agents on Meloidogyne incognita. In Proceedings of the 2014 Beltwide Cotton Conference (Vol. 1, pp. 258-260). Title: THE ANTI-NEMATODE (Meloidogyne spp.) BACTERIA Bacillus velezensis EK7 ACTIVITY IN BLACK PEPPER RHIZOSPHERE Abstract: Root-knot nematode Meloidogyne spp. is a group of common pests on black pepper (Piper nigrum). The aim of the study is to select, identify and assess the nematode resistance activity of the rhizobacteria strains used in the prevention and control of nematode pathogens in black pepper. This study result has selected rhizobacteria strain EK7 which is resistance to nematodes under in vitro with nematode killing values reaching 99%. This strain was identified as Bacillus velezensis EK7 based on 16S rRNA sequencing method. Research on nematode resistance mechanism of strain EK7 was conducted by assessing the effect of enzyme on nematode mortality. The results showed that chitinase obtained from the strain EK7may have an effect on nematode mortality at 24 h and hatching nematode eggs at 24, 48, and 72 h tested time. The protease enzyme only affects the hatching rate of nematode eggs at 72 h. Keywords: Nematode, rhizosphere, protease, chitinase, Bacillus velezensis. 376