HPV-PCRELISA-Fulltext-Page

Chia sẻ: Giang Duong Y Khoa | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

131
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA lai 9 dò genotype 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11 Lê Thúy Quyên*(1), Phạm Hùng Vân(2), Võ Đức Xuyên An(3), Lê Thị Phi Yến(3), Hòang Hiếu Ngọc(4) Tóm tắt Đặt

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: HPV-PCRELISA-Fulltext-Page

Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA lai 9 dò genotype 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11 Lê Thúy Quyên*(1), Phạm Hùng Vân(2), Võ Đức Xuyên An(3), Lê Thị Phi Yến(3), Hòang Hiếu Ngọc(4) Tóm tắt Đặt vấn đề: HPV với các kiểu gen nguy cơ cao như 16, 18 là các tác nhân có tiềm năng sinh ung thư. Tại Việt Nam, do thiếu phương tiên chẩn đóan nên có rất ít các công trình nghiên c ứu về tần suất các kiểu gen HPV phát hiện được trong các quệt cổ tử cung. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng và phát triển kỹ thuật PCR-ELISA lai với 9 dò đặc hiệu kiểu gen là 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11 để phát hiện và xác định kiểu gen HPV từ các quệt cổ tử cung. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Bệnh phẩm nghiênc ứu là các quệt cổ tử cung. Để phát hiện và xác định genotype của human papilloma virus, chúng tôi đã xây dựng kỹ thuật PCR – ELISA với nguyên t ắc như sau: đầu tiên khuếch đại 1 đoạn gen đặc hiệu dài 450 bp nằm trên vùng L1 c ủa HPV đ ể t ạo ra nh ững s ản ph ẩm khuếch đại. Những sản phẩm khuếch đại này đều được đánh dấu DIG trong quá trình thực hiện phản ứng PCR. Sau đó thực hiện biến tính và lai sản phẩm với các đoạn dò đ ặc hiệu cho từng genotype đã đ ược g ắn trên các giếng ELISA. Sản phẩm lai gắn trên giếng sẽ được phát hiện bằng cộng hợp là anti – DIG gắn HRPO. Phức hợp này sẽ được phát hiện bằng chất hiện màu TMB. Kết quả: Tiến hành thử nghiệm PCR-ELISA trên 84 mẫu bệnh phẩm lấy từ cổ tử cung bằng que Ayre hòa trong dung dịch nước muối sinh lý được bệnh viện Từ Dũ và một số phòng khám phụ khoa khác gửi đến, chúng tôi ghi nhận có 45 mẫu có DNA – HPV dương tính chiếm tỉ lệ 55%. Đây là một tỉ lệ khá cao so với các nghiên cứu trước đây của bệnh viện Hùng Vương thực hiện trên các mẫu xét nghiệm bất kỳ. Sản phẩm PCR-ELISA c ủa 45 mẫu này sau đó được tiếp tục định genotype bằng kỹ thuật ELISA lai với dò đặc hiệu c ủa 9 genotype đ ược ph ủ s ẵn trên giếng là 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11; kết quả ghi nhận đ ược như sau: type 16 chi ếm 25 tr ường h ợp (56%), các type khác chiếm tỷ lệ lần lượt là 18 (4%), 31 (2%), 33 (7%), 35 (2%), 39/45 (2%), 6/11 (16%). Có 7 trường hợp không phát hiện được genotype, chiếm 16%. Với các kết quả này, các tác giả nhận thấy rằng có một tỉ lệ nhiễm những genotype HPV khác ngoài 9 type thông thường mà các tác giả đã thiết l ập trong th ử nghi ệm ELISA và tỉ lệ này cũng không phải là ít. Kết luận: Từ các kết quả nghiên cứu trên, các tác giả cho là kỹ thuật PCR-ELISA là kỹ thuật thích hợp nhất đ ể có thể triển khai được tại các phòng thí nghiệm lâm sàng có phương tiện PCR để phát hiện và xác đ ịnh genotype HPV trong các bệnh phẩm quệt cổ tử cung Abstract Genotyping of HPV by PCR – ELISA hybridized 9 genotype specific probes 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 and 6/11 Background: HPV with high risk genotypes as like as 16, and 18 are the potential carcinenous pathogens for cervical cancer. In Viet Nam, because of the lack of diagnostic tool detecting and genotyping of HPV, there were still very few studies on the prevalence of HPV genotype detected from cervical swabs. Aims of the study: Develop the PCR-ELISA hybridized with 9 genotype specific probes 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 and 6/11 to detect and genotype HPV from the cervial swabs. Methods: To detect and identify genotype of HPV, we set PCR – ELISA technique with main principle: First, a 450 bp – DNA HPV in L1 region is amplified by PCR. These PCR product were labelled with DIG in the PCR reaction, then it will be denatured and hybrided with specific probes which are attached passively to streptavidine in ELISA wells. Hybrided products will be detected by anti DIG – HRPO conjugate and then detected by TMB. Results: With 84 samples received from Tu Du hospital and other gynecology clinics, after running PCR reaction, there are 45 samples positive to DNA – HPV. These 45 PCR products, then, will be genotyped by ELISA method in which these PCR product will be hybridized with 9 genotypic probes including 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, and 6/11. The collected result revealed that 25 are belong to type 16 (56%), other types 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11 have 4%, 2%, 7%, 2%, 2%, 11%, respectively. There are 7 samples positive to DNA-HPV but cannot identify genotype, have 16%. Authors realize that there is an unexpected incidence of other HPV types besides 9 HPV types that set up in ELISA. Conclusions: In Vietnam, PCR-ELISA is the most suitable technique that can be set up in the clinical laboratories with PCR facilities to detect and genotyping of HPV in the cervical swabs Đặt vấn đề 100.000 dân. Tại Việt, Nam, ung thư cổ tử cung chiếm tỉ lệ 38,55%, đa số gặp ở phụ nữ độ tuổi Ung thư cổ tử cung là loại ung thư chiếm tỉ lệ 40 – 49(1). Kết quả điều trị tùy thuộc hoàn toàn cao nhất hoặc nhì trong các loại ung thư ở cơ vào giai đọan phát triển của ung thư được phát quan sinh dục nữ, chiếm 12% các bệnh ác tính hiện. Nếu phát hiện và điều trị khi còn là giai của phụ nữ. Xuất độ ở châu Âu và Bắc Mỹ là từ đọan 0, tiên lượng lành bệnh thường là 100% (2). 30 đến 35 ca bệnh mới hàng năm, tính trên * Tác giả chính, (1)Thạc Sĩ, BM Sinh Học, Khoa Khoa Học Cơ Bản, Đại Học Y Dược TP. HCM; (2)TS., Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh; (3)Cử Nhân Sinh Học, Công ty Nam Khoa Biotek; (4)BS., Bộ Môn Sinh Hóa, Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 1
Trước đây, người ta thấy rằng có nhiều yếu tố K/detergent do công ty Nam Khoa sản xuất với thuận lợi dẫn đến ung thư cổ tử cung trong đó mục đích dùng dung dịch này để tiêu hóa các có human papilloma virus nhưng cho đến nay, protein bám trên DNA của virus cũng như trong người ta đã phát hiện được rằng HPV là tác nhân bệnh phẩm. Sau đó, chúng tôi sử dụng phương gây ung thư cổ tử cung(3-5). Cho đến nay, hơn 100 pháp ly trích DNA bằng phương pháp genotype HPV đã được phát hiện trong đó có phenol/choloform với bộ thuốc thử DNAPREP khoảng 29 genotype được phân làm 3 nhóm nguy PHCHL do công ty Nam Khoa sản xuất để trích cơ lien quan đến ung thư cỏ tử cung, đó là: nhóm biệt DNA từ mẫu. nguy cơ cao với 15 genotype (16, 18, 31, 33, 39, Phát hiện HPV- DNA: Dùng 10µl dịch ly trích 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 và 82) 3 genotype cho vào tube chứa sẵn HPV – ELISA mix. PCR thuộc nhóm nguy cơ cao tiềm tàng (26, 53, 66) và mix này dùng để phát hiện và định genotype của 11 type thuộc nguy cơ thấp (6, 11, 40, 42, 43, 44, HPV do công ty Nam Khoa sản xuất với các 54, 61, 70, 72, và 81)(3). Phưong pháp tế bào học thành phần chủ yếu là PCR buffer (Biorad), (PAP’s smear) được xem là khá hữu hiệu để tầm dNTP (Roche), Taq polymerase (Biorad), m ồi soát ung thư cổ tử cung vì xem xét được quá MY09 và MY11 (Invitrogen) và dUTP có gắn trình biến đổi của tế bào niêm mạc cổ tử cung DIG (Roche) được pha với các nồng độ thích từ bình thường sang ác tính. Tuy nhiên, phương hợp để khuếch đại môt đoạn DNA dài 450 bp pháp tế bào học không phải là phương pháp duy trên vùng gen L1 của HPV đồng thời sẽ tạo ra nhất để tầm soát bệnh. Cùng với sự phát triển những sản phẩm PCR có đánh dấu DIG. Sau đó của sinh học phân tử, người ta đã phát triển chạy chương trình luân nhiệt dành cho HPV như những kỹ thuật mới có khả năng phát hiện sau: 40oC trong 10 phút; 95oC trong 5 phút; 95oC những type HPV có nguy cơ cao vơi độ nhạy và trong 30giây và 70oC trong 30 giây được lặp lại độ chính xác cao. Từ vai trò hỗ trợ cho xét 20 chu kỳ; sau đó là 95oC trong 1 phút, 55oC trong nghiệm tế bào, những phương pháp này dần trở 1 phút và 72oC trong 1 phút được lặp lại trong 35 thành chủ yếu để sàng lọc sớm ung thư cổ tử chu kỳ kế tiếp; cuối cùng là 72 oC trong 10 phút. cung(6-11). Trước khi có kỹ thuật khuếch đại, Sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel người ta dùng kỹ thuật lai tại chỗ với đoạn dò agarose 2% pha trong TBE 0.5X (dùng bộ AGE đặc hiệu để phát hiện và định genotype HPV do công ty Nam Khoa sản xuất) cùng với m ột trong mẫu thử, tuy nhiên, phương pháp này lại giếng chứa thang DNA chuẩn từ 100 – 1000 bp có độ nhạy thấp và phức tạp(12-14). Ngày nay, đã (Biorad) với mỗi băng DNA chuẩn cách nhau có nhiều phương pháp phát hiện và định 100 base. Kết quả được cho là dương tính khi genotype HPV như kỹ thuật micro array sử dụng vạch khuếch đại rõ nét ở vị trí 450 bp. DNA chip, lai trong pha lỏng (hybrid capture 2) , phương pháp lai trên vạch (InoLiPA) (17,18). (15,16) Xác định genotype của HPV: Những mẫu Tuy nhiên, những phương pháp này lại khá đắt HPV – DNA (+) được tiến hành xác định tiền, chưa phù hợp với điều kiện Việt Nam. Vì genotype như sau: Chúng tôi sử dụng các giếng thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm xây ELISA đã được phủ streptavidin và đã gắn kết dựng phương pháp PCR – ELISA phát hiện DNA thụ động lần lượt với các đoạn dò đặc hiệu cho – HPV đồng thời định genotype của HPV để góp các genotype của HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, phần vào việc tầm soát và chẩn đoán sớm ung 6/11 trên từng giếng tương ứng của 1 thanh thư cổ tử cung ở nước ta. ELISA.Thực hiện biến tính sản phẩm PCR ở 95oC trong 10 phút, sản phẩm sau khi biến tính Vật liệu và phương pháp nghiên cứu phải được giữ ngay trong đá để duy trì tình trạng biến tính. Sau đó chúng tôi tiến hành lai những Mẫu bệnh phẩm: 84 mẫu bệnh phẩm là các sản phẩm PCR đã được biến tính vào các giếng mẫu phết cổ tử cung bằng que Ayre hòa trong ELISA, với mỗi thanh ELISA tương ứng với 1 dung dịch nước muối sinh lý hoặc bằng gòn mẫu. Khi đó, đoạn dò sẽ tóm bắt đặc hiệu với được bệnh nhân trực tiếp mang đến hoặc do mỗi mạch đơn (đã được đánh dấu DIG) tương một số phòng khám hay bệnh viện Từ Dũ ở ứng với từng genotype. Sau đó, sản phẩm lai gắn TP.Hồ Chí Minh gửi đến phòng thí nghiệm R&D trên giếng sẽ được phát hiện bằng cộng hợp là của công ty Nam Khoa trong ngày hoặc được lưu anti – DIG gắn HRPO. Phức hợp này sẽ được ở -20oC vào ngày cuối tuần và được gửi đến phát hiện bằng chất hiện màu TMB. Kết quả sẽ công ty Nam Khoa vào ngày thứ hai tiếp theo. được đọc ở bước sóng 450nm. Khi OD của Trích biệt HPV – DNA từ các mẫu bệnh giếng có giá trị > 1.7 OD của giếng chứng âm và phẩm: Đầu tiên, chúng tôi xử lý mẩu bằng dung có trị số cao nhất so với OD của các giếng khác dịch PROKPREP tức là dung dịch proteinase trong cùng một mẫu thì đó là kiểu gen của mẫu. 2
Nếu tất cả các giếng có OD < OD của giếng có những mẫu hiện lên vạch sáng tương ứng chứng âm thì kết luận là mẫu dương tính với vạch 450bp, rõ chứng tỏ mẫu dương tính với HPV nhưng với kiểu gen khác với kiểu gen 16, DNA – HPV. Trong tổng số 84 mẫu bau đầu, sau khi chạy PCR, có 45 mẫu dương tính chiếm tỉ lệ 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11. 55% và 39 mẫu âm tính chiếm tỉ lệ 45%. Kết quả Kết quả phát hiện genotype HPV: Với 45 mẫu dương tính, chúng tôi tiến hành định genotype Kết quả phát hiện HPV dựa trên PCR bằng phương pháp ELISA và đã thu được k ết khuếch đại đoạn DNA dài 450bp trên gene L1 : quả nhu sau: type 16 có 25 trường hợp, chiếm đa Trong thời gian từ 15/03/2005 – 15/07/2005, số (tỉ lệ 56%), các genotype khác lần lượt chiếm chúng tôi đã thử nghiệm được 84 mẫu bệnh tỉ lệ là 18 (4%), 31 (2%), 33(7%), 35(2%), phẩm. Hình 1 trình bày kết quả PCR của 84 39/45(2%), 6/11(11%). Có 7 trường hợp (16%) mẫu DNA đã được trích biệt. Kết quả cho thấy không xác định được genotype. Biểu đồ 1 dưới là có những mẫu không hiện lên vạch sáng nào, đây trình bày tỷ lệ các genotype HPV phát hiện điều này chứng tỏ mẫu âm tính với DNA-HPV, được. Genotype 16 16% Genotype 18 Không xác định Genotype 31 Genotype 33 Genotype 35 Genotype 39/45 Genotype 6/11 11% Genotype 6/11 Không xác đ?nh 2% 56% Genotype 39/45 Genotype 16 2% Genotype 35 7% Genotype 33 2% Genotype 31 4% Genotype 18 Biểu đồ 1: Số trường hợp phát hiện genotype của HPV. Kết quả PCR phát hiện HPV của 84 mẫu DNA trích biệt từ quệt cổ tử cung bệnh nhận. Các số Hình 1: thứ tự được đánh dấu bên bước là mã số của mẫu thử nghiệm. MK là thang DNA chuẩn từ 100 đến 1000bp với các vạch cách nhau 100bp. Bàn luận Trong kết quả thu nhận được, chúng tôi nhận thấy có đến 16% các trường hợp dù PCR dương 3
tính rất rõ với HPV nhưng vẫn không thể định Kết luận. được genotype. Điều này chứng tỏ có một số Phát hiện và định genotype của HPV trong các genotype mà chúng tôi chưa phủ dò đặc hiệu lên mẫu quệt cổ tử cung là xét nghiệm rất cần thiết trên giếng ELISA. Do vậy chúng tôi đã thực hiện để chẩn đoán và tầm soát sớm ung thư cổ tử lai thêm sản phẩm PCR với dò của genotype 58. cung và nếu xét về mặt địch tễ học thì xét Kết quả trong 7 mẫu không xác định được nghiệm này cũng nên được đưa vào sử dụng đại genotype này có 3 mẫu dương tính với genotype trà để xác định được các genotype lưu hành trong 58. Còn 4 mẫu còn lại chúng tôi đã thực hiện kỹ các vùng dịch tễ khác nhau đồng thời từ đó giúp thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR và tiên đoán và đánh giá được sự hữu dụng của các kết quả cho thất có 1 là genotype 52, 1 là phươgn pháp phòng chống lây nhiễm cững như genotype 54, một là genotype 62 và 1 là genotype sự hữu hiệu của vaccine phòng ngừa sẽ được 83 (kết quả này được trình bày trong một bài báo đưa vào áp dụng cho dân số trong tưong lai. Mặc tiếp theo sắp đăng). Như vậy để có thể hòan dù phương pháp PCR – ELISA được xem là khá thiện được kỹ thuật PCR-ELISA, chúng tôi cho hữu hiệu để phát hiện và định genotype HPV rằng vấn đề kỹ thuật cần phải giải quyết đó là nhưng phương pháp này bị giới hạn số genotype nên có thêm các giếng phủ thêm các dò đặc hiệu HPV cần xác định vì phụ thuộc vào đọan dò đặc genotype, lí tưởng nhất là đủ 29 genotype (3) của hiệu cho từng genotype cũng như bị hạn chế về đủ 3 nhóm nguy cơ cao, tiềm tàng hay nguy cơ số giếng cần để thử nghiệm. Trong tương lai, thấp. Tuy nhiên nấu làm như vậy thì vấn đề chúng tôi sẽ hoàn thiện thêm kỹ thuật ELISA phải giải quyết tiếp theo là giá thành vì như vậy bằng cách gia tăng số genotype cần được phát một mẫu bệnh phẩm là phải thực hiện trên ½ hiện chứ không dừng lại ở 9 genotype như trên. bảng nhựa ELISA và 6 HPV-PCR ELISA mix, do Bên cạnh đó, chúng tôi cũng sẽ tích cực nghiên vậy giá thành sẽ đắt hơn 6 lần giá củ. Chính vi cứu để đưa vào một kỹ thuật mới cũng nhằm để vậy con đường đi thích hợp nhất là có thêm các phục vụ cho việc xác định genotype của HPV mẫu thử để thăm dò các genotype thường lưu được chính xác và đa dạng hơn đồng thời giúp hành để xây dựng bộ thuốc thử PCR-ELISA phát hoàn thiện them bộ kit PCR – ELISA hiện có. hiện HPV, và đây chính là đích nhắm mà chúng tôi đang tiếp tục thực hiện. Tài liệu tham khảo. Về mặt nguyên tắc, có nhiều cách để xây dựng kỹ thuật PCR-ELISA phát hiện và định Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí 1. genotype của HPV(19). Chúng tôi chọn cách dùng Minh. Bộ môn Ung bướu. Ung thư học lâm DIG dUTP để đánh dấu sản phâm PCR vì theo sàng.Ung thư cổ tử cung: p191 - 210 kinh nghiệm chúng tôi thấy rằng đây là phương Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí 2. pháp khá nhạy, ngòai ra chúng ta có thể chế sẵn Minh. Bộ môn Sản Phụ Khoa. Ung thư cổ tử các bản nhựa ELISA phủ sẵn probe thông qua cung: p918 – 929 (2000) cầu nối Streptavitin trên bản nhựa và Biotin trên 3. Munoz., N., F.X. Bosch, S. de Sanjose, R. Herrero, đầu 5’ của dò đặc hiệu. Tất cả các kỹ thuật để X. Castellsague, K.V. Shah, P.J. Snijders, and C.J. chế tạo bản nhựa phủ streptavidine và sau đó Meijer Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical phủ dò đặc hiệu chúng tôi đã có sẵn và thành cancer. (2003) Feb 6;348(6):518-27 thục. Đây cũng chính là yếu tố giúp làm giảm giá 4. Castellsaque X, Diaz M et al, Worldwide human thành của sản phẩm khi chế tạo kit. papillomavirus etiology of cervical Dù với số mẫu còn giới hạn, nhưng kết quả adenocarcinoma and its cofactors: implications cũng cho thấy tỷ lệ cao (55%) nhiễm HPV của for screening and prevention. J Natl Cancer Inst. các mẫu thử lấy từ cổ tử cung của phụ nữ gửi 2006 Mar 1;98(5):303-15 đến xét nghiệm tại phòng nghiên cứu và phát 5. Chen CA, Liu CY, Chou HH, Cho CM, Twu NF et al. The distribution and differential risks of human triển của công ty Nam Khoa. Sự phân bố các papillomavirus genotypes in cervical preinvasive genotype cũng cho thấy đa số là có mang các lesions: A Taiwan Cooperative Oncologic Group genotype nguy cơ cao mà chủ yếu là genotype Study. Int J Gynecol Cancer (2006) Sep- 16. Tuy nhiên đây chỉ là những số liệu nhỏ chưa Oct;16(5):1801-8. thể nói lên được sự phân bố dịch tễ học của các 6. Bosch, F. X., A. Lorincz, N. Munoz, C. J. Meijer, genotype HPV lưu hành. Việc xây dựng thành and K. V. Shah. 2002. The causal relation between công bộ kit PCR-ELISA thích hợp tại Việt Nam human papillomavirus and cervical cancer. J. Clin. sẽ có giá trị đóng góp lớn sau này trong các điều Pathol. 55:244–265. tra dịch tễ học như vậy. 7. Bosch, F. X., and S. de Sanjose. 2003. Chapter 1: Human papillomavirus and cervical cancer- 4
burden and assessment of causality. J. Natl. Cancer Noordaa, and J. ter Schegget. 1988. Sensitivity of Inst. Monogr. 31:3–13. in situ detection with biotinylated probes of human papilloma virus type 16 DNA in frozen tissue 8. Dannecker, C., U. Siebert, C. J. Thaler, D. sections of squamous cell carcinomas of the cervix. Kiermeir, H. Hepp, and P. Hillemanns. 2004. Am. J. Pathol. 131:587-594 Primary cervical cancer screening by self- sampling of human papillomavirus DNA in 15 Cox, J. T., A. T. Lorincz, M. H. Schiffman, M. E. internal medicine outpatient clinics. Ann. Oncol. Sherman, A. Cullen, and R. J. Kurman. 1995. 15:863–869. Human papillomavirus testing by hybrid capture appears to be useful in triaging women with a 9. Jin, X. W., K. Zanotti, and B. Yen-Lieberman. cytologic diagnosis of atypical squamous cells of 2005. New cervical cancer screening strategy: undetermined significance. Am. J. Obstet. combined Pap and HPV testing. Cleveland Clin. J. Gynecol. 172:946-954. Med. 72:141–148. 16. The Atypical Squamous Cells of Undetermined 10. Munoz, N., S. Franceschi, C. Bosetti, V. Moreno, Significance/Low-Grade Squamous Intraepithelial R. Herrero, J. S. Smith, K. V. Shah, C. J. Meijer, Lesions Triage Study (ALTS) Group. 2000. and F. X. Bosch. 2002. Role of parity and human Human papillomavirus testing for triage of women papillomavirus in cervical cancer: the IARC with cytologic evidence of low-grade squamous multicentric case-control study. Lancet 359:1093– intraepithelial lesions: baseline data from a 1101. randomized trial. J. Natl. Cancer Inst. 92:397-402 11. Nieminen, P., S. Vuorma, M. Viikki, M. Hakama, 17. Kleter, B., L. J. Van Doorn, L. Schrauwen, A. and A. Anttila. 2004. Comparison of HPV test Molijn, S. Sastrowijoto, J. ter Schegget, J. versus conventional and automation-assisted Pap Lindeman, B. ter Harmsel, M. Burger, and W. screening as potential screening tools for Quint. 1999. Development and clinical evaluation preventing cervical cancer. BJOG 111:842–848. of a highly sensitive PCR-reverse hybridization 12. Melchers, W. J., P. Herbrink, W. G. Quint, J. M. line probe assay for detection and identification of Walboomers, C. J. Meijer, and J. Lindeman. 1988. anogenital human papillomavirus. J. Clin. Prevalence of genital HPV infections in a Microbiol. 37:2508-2517 regularly screened population in The Netherlands 18. Melchers, W. J., J. M. Bakkers, J. Wang, P. C. de in relation to cervical cytology. J. Med. Virol. Wilde, H. Boonstra, W. G. Quint, and A. G. 25:11-16. Hanselaar. 1999. Short fragment polymerase chain 13. Melchers, W. J., P. Herbrink, J. M. Walboomers, reaction reverse hybridization line probe assay to C. J. Meijer, H. V. D. Drift, J. Lindeman, and W. detect and genotype a broad spectrum of human G. Quint. 1989. Optimization of human papillomavirus types. Clinical evaluation and papillomavirus genotype detection in cervical follow-up. Am. J. Pathol. 155:1473-1478. scrapes by a modified filter in situ hybridization 19 Phạm Hùng Vân. 2005. PCR-ELISA and real-time test. J. Clin. Microbiol. 27:106-110. PCR – Principle and applications. Short course 14. Walboomers, J. M., W. J. Melchers, H. Mullink, C. focusing on the advanced PCR that can be appied J. Meijer, A. Struyk, W. G. Quint, J. van der in developing countries 5