Kaempferol ức chế sự biểu hiện và chức năng của estrogen receptor alpha

Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 8 * Phuï baûn cuûa Soá 1 * 2004<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> <br /> 13 KAEMPFEROL ÖÙC CHEÁ SÖÏ BIEÅU HIEÄN VAØ CHÖÙC NAÊNG<br /> CUÛA ESTROGEN RECEPTOR ALPHA<br /> Huyønh Thanh Hoøa*, Huyønh Huøng*<br /> <br /> TOÙM TAÉT<br /> Estrogens laø nhöõng chaát gaây phaân baøo treân loaïi teá baøo ung thö vuù coù Estrogen receptor (ER)-positive.<br /> Phöông phaùp ñieàu trò hieän thôøi ñoái vôùi ung thö vuù coù ER-positive laø tröïc tieáp ngaên caûn hoaït ñoäng cuûa estrogen.<br /> Chuùng toâi baùo caùo raèng: ñieàu trò nhöõng loaïi teá baøo ung thö vuù coù ER-positive vôùi Kaempferol daån tôùi söï giaûm soá<br /> löôïng teá baøo tæ leä vôùi noàng ñoä vaø thôøi gian. Noàng ñoä caàn thieát ñeå öùc cheá 50% taêng tröôûng teá baøo ôû 48 giôø laø<br /> khoaûng 35 μM vaø 70 μM cho teá baøo ung thö vuù loaïi ER-positive vaø loaïi ER-negative. Ñoái vôùi doøng teá baøo MCF7, mRNA cuûa ER-α giaûm 50;12 vaø 10% so vôùi nhoùm ñoái chöùng ñöôïc ghi nhaän ôû 24 giôø sau khi ñieàu trò töông<br /> öùng vôùi vôùi noàng ñoä 17,5; 35 vaø 70 μM kaempferol. Ñoàng thôøi, nhöõng ñieàu trò naøy cuõng daån tôùi 58; 80 vaø 85%<br /> möùc ñoä giaûm cuûa söï bieåu hieän protein ER-α. Taùc ñoäng öùc cheá cuûa Kaempferol treân ER-α cuõng coù theå thaáy<br /> ñöôïc raát sôùm, 6 giôø sau khi ñieàu trò. Ñieàu trò baèng Kaempferol cuõng daån tôùi giaûm möùc ñoä bieåu hieän cuûa<br /> progesterone receptor (PgR), Cyclin D1, vaø isulin receptor subtrate (IRS-1). Nghieân cöùu hoùa mieãn dòch teá baøo<br /> cho thaáy raèng protein ER-α trong teá baøo MCF-7 ñöôïc ñieàu trò vôùi kaempferol bò keát tuï laïi trong nhaân teá baøo.<br /> Kaempferol cuõng laøm gia taêng söï thoaùi hoùa cuûa ER-α bôûi cô cheá khaùc, khaùc vôùi cô cheá maø chaát khaùng estrogen<br /> ICI 182,780 vaø estrogen. Söï taêng sinh cuûa doøng teá baøo MCF-7 hoaït hoùa bôûi estradiol cuõng bò öùc cheá khi ñöôïc<br /> ñieàu trò vôùi kaempferol. Nhöõng khaùm phaù môùi naøy gôïi yù raèng söï ñieàu chænh möùc ñoä bieåu hieän vaø hoaït tính cuûa<br /> ER-α bôûi kaempferol coù theå goùp phaàn giaûi thích cho khaû naêng öùc cheá söï taêng sinh teá baøo cuûa ñöôïc quan saùt<br /> treân vitro.<br /> <br /> SUMMARY<br /> INHIBITION OF ESTROGEN RECEPTOR ALPHA EXPRESSION AND FUNCTION IN<br /> MCF-7 CELLS BY KAEMPFEROL.<br /> Huynh Thanh Hoa, Huynh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 8 * Supplement of No 1 * 2004: 97 – 104<br /> <br /> Estrogens are mitogenic for estrogen receptor (ER)-positive breast cancer cells. Current treatment of ERpositive breast tumours is directed towards interruption of estrogen activity. We report that treatment of ERpositive breast cancer cells with kaempferol resulted in a time- and dose-dependent decrease in cell number.<br /> The concentration required to produce 50% growth inhibition at 48 h was approximately 35 and 70 μM for ERpositive and ER-negative breast cancer cell lines. For MCF-7 cells, a reduction in the ER-alpha mRNA<br /> equivalent to 50%, 12%, 10% of controls was observed 24 h after treatment with 17.5, 35.0 and 70.0 μM of<br /> kaempferol, respectively. Concomitantly, these treatments led to a 58%, 80% and 85% decrease in ER-alpha<br /> protein. The inhibitory effect of kaempferol on ER-alpha levels was seen as early as 6 h post-treatment.<br /> Kaempferol treatment also led in a dose-dependent decrease in the expression of progesterone receptor (PgR),<br /> cyclin D1 and insulin receptor substrate 1 (IRS-1). Immunocytochemical study revealed that ER-alpha protein<br /> in kaempferol-treated MCF-7 cells formed an aggregation in the nuclei. Kaempferol also induced degradation<br /> of ER-alpha by a different pathway than that observed for the antiestrogen ICI 182,780 and estradiol.<br /> * Laboratry of Molecular Endocrinology, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancerr<br /> Centre of Singapore, Singapore<br /> <br /> Chuyeân ñeà Hoäi nghò Khoa hoïc Kyõ thuaät BV. Bình Daân 2004<br /> <br /> 97<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> <br /> Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 8 * Phuï baûn cuûa Soá 1 * 2004<br /> <br /> Estradiol-induced MCF-7 cell proliferation was abolished in cells co-treated with kaempferol. These findings<br /> suggest that modulation of ER-alpha expression and function by kaempferol may be, in part, responsible for its<br /> anti-proliferative effects seen in in vitro.<br /> nhieàu rau quaû coù theå laøm giaûm tæ leä cuûa nhieàu loaïi ung<br /> ÑAËT VAÁN ÑEÀ<br /> thö18,19. Flavonoid laø nhöõng hôïp chaát ña phaân töû coù<br /> Estrogen receptor (ER)-α ñoùng moät vai troø thieát<br /> nhieàu trong caùc loaïi rau quaû20-22. Caùc flavonoid thöôøng<br /> yeáu trong söï tieán trieån cuûa ung thö vuù vaø hormone<br /> gaëp nhaát trong rau quaû laø quercetin, kaempferol, rutin<br /> lieäu phaùp. Estrogen ñöôïc chöùng minh laø chaát gaây<br /> vaø robinin23; trong ñoù, quercetin ñöôïc nghieân cöùu<br /> phaân baøo treân teá baøo ung thö vuù coù ER-positive1-4.<br /> moät caùch roäng raõi nhaát24-26. Caùc flavonoid (quercetin,<br /> Ung thö vuù nguyeân phaùt treân nöû phaàn lôùn coù ER- vaø<br /> kaempferol) coù hoïat tính coù theå qua cô cheá töông taùc<br /> ñoøi hoûi coù estrogen cho hoïat ñoäng phaân baøo laøm khoái<br /> vôùi ER27,28, type II estrogen binding site vaø aryl<br /> u taêng tröôûng. Hoïat tính sinh hoïc cuûa estrogen baèng<br /> hydrocarbon receptor29,30. Kaempferol coù theå hoïat<br /> söï töông taùc ñaëc hieäu cuûa noù caùc loïai thuï theå chuyeân<br /> ñoäng nhö laø chaát ñoàng vaän ñoái vôùi estrogen hoaëc laø<br /> bieät: ERs, ER-α vaø ER- β baèng caùch gaây phieân maõ2,5,6.<br /> chaát öùc cheá taêng tröôûng tuøy vaøo noàng ñoä ñöôïc söû<br /> Ngoaøi estrogen, coøn nhöõng yeáu toá taêng tröôûng nhö laø<br /> duïng. Vôùi noàng ñoä thaáp (1-10 μM), kaempferol ñoàng<br /> insulin-like growth factor I (IGF-1), epidermal growth<br /> vaän vôùi estrogen laøm taêng söï taêng tröôûng cuûa doøng teá<br /> factor (EGF), transforming growth factor α cuõng coù<br /> baøo ung thö vuù MCF-7, taêng toång hôïp DNA vaø kích<br /> theå hoaït hoùa ER3,4,7,8. Estrogen coøn hoaït hoùa Akt qua<br /> hoaït estrogen-response gene. Vôùi noàng ñoä cao (20-90<br /> trung gian cô cheá ErbB3,4, ñieàu hoøa söï hoaït hoùa<br /> μM), kaempferol öùc cheá toång hôïp DNA vaø söï taêng<br /> nhöõng gene lieân quan taêng tröôûng vaø bieät hoùa teá baøo<br /> tröôûng cuûa teá baøo MCF-728. Kaempferol coøn laøm thoaùi<br /> 4,8-14<br /> .<br /> nhö laø EGF, IGF-I vaø nhöõng receptor cuûa chuùng<br /> hoùa DNA, ñoàng thôøi gaây ra lipid peroxidation31. In<br /> Hôn theá nöûa, estrogen laøm gia taêng möùc ñoä taêng<br /> vivo, kaempferol coù ñaëc tính estrogenic vaø<br /> tröôûng baèng caùch ñöa teá baøo vaøo chu trình teá baøo, laøm<br /> uterotrophic treân töû cung chuoät 32.<br /> ngaén ñi thôøi gian cuûa chu trình vaø laøm giaûm ñoä daøi<br /> Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi baùo caùo raèng<br /> cuûa pha G115.<br /> ñieàu trò treân nhöõng loïai teá baøo ung thö vuù vôùi noàng ñoä<br /> Lieäu phaùp hormone hieän haønh cho loaïi u vuù coù<br /> 17,5; 35 vaø 70 μM cuûa kaempferol cho hieäu quaû öùc<br /> ER-positive laø tröïc tieáp laøm giaùn ñoïan estrogen baèng<br /> cheá taêng tröôûng tæ leä thuaän vôùi noàng ñoä. Kaempferol<br /> caùch caét buoàng tröùng hoaëc laø söû duïng chaát ñoái khaùng<br /> öùc cheá bieåu hieän ER-α, laøm thoaùi hoùa ER-α vaø gaây keát<br /> estrogen2. Thuoác ñoái khaùng estrogen tamoxifen laøm<br /> tuï ER-α. Ñoàng thôøi kaempferol coøn laøm maát hoïat<br /> laøm keùo daøi tieân löôïng soáng treân beänh nhaân ung thö<br /> tính cuûa estrogen treân doøng teá baøo MCF-7. Bieåu hieän<br /> vuù vaø coù khaû naêng phoøng ngöøa ung tö vuù cuõng nhö<br /> cuûa nhöõng gene phuï thuoäc estrogen nhö laø IRS-1,<br /> ñieàu trò u vuù coù ER-positive di caên2,6. Chaát ñoái khaùng<br /> cyclin D1 vaø PgR cuõng bò öùc cheá bôûi kaempferol. Vì<br /> estrogen ICI coù theå öùc cheá chöùc naêng ER baèng caùch<br /> caùc protein ER-α, IRS-1 vaø cyclin D1 ñoùng moät vai troø<br /> laøm thoaùi hoùa protein ER- α16. Nhöõng chaát ñoái khaùng<br /> quan troïng trong söï hình thaønh vaø taêng sinh teá baøo<br /> estrogen ñaõ ñöôïc chöùng minh coù khaû naêng öùc cheá söï<br /> ung thö vuù, nhöõng tính chaát ñöôïc khaùm phaù treân coù<br /> taêng tröôûng cuûa teá baøo ung thö vuù baèng caùch caïnh<br /> theå ghoùp phaàn giaûi thích cho khaû naêng choáng taêng<br /> tranh vôùi estrogen taïi receptor cuûa noù 2,6. Ung thö vuù<br /> sinh teá baøo cuûa kaempferol.<br /> khaùng tamoxifen coù theå ñaùp öùng toát vôùi ICI 182,78017.<br /> VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN<br /> Nhieàu chaát ñoái khaùng estrogen môùi ñang ñöôïc thöû<br /> CÖÙU:<br /> nghieäm laâm saøng2.<br /> Nghieàu nghieân cöùu dòch teå hoïc ñaõ cho thaáy moái<br /> lieân heä giöõa cheá ñoä aên uoáng vaø vaø ung thö, ñaëc bieät aên<br /> <br /> 98<br /> <br /> Thymidine incorporation assays<br /> Nhöõng doøng teá baøo ung thö vuù cuûa ngöôøi coù ER-<br /> <br /> Chuyeân ñeà Hoäi nghò Khoa hoïc Kyõ thuaät BV. Bình Daân 2004<br /> <br /> Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 8 * Phuï baûn cuûa Soá 1 * 2004<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> <br /> positive (MCF-7, T47D vaø ZR-75) vaø ER-negative<br /> (MDA 231) ñöôïc nuoâi ñôn lôùp baèng 10% FBS trong αMEM vôùi maät ñoä 2 x 104 trong ñóa 24 well. Sau 48 giôø<br /> nhöõng loaïi nhöõng ñóa naøy ñöôïc röûa hai laàn vôùi serumfree α-MEM vaø ñöôïc uû tieáp 24 giôø vôùi 2,5% charcoal<br /> dextrane treated FBS (assay medium) trong α-MEM.<br /> <br /> saùt döôùi Laser confocal microscope coù trong bò kính<br /> epifluorescence.<br /> <br /> Phaùt hieän ER-α ubiquination trong<br /> vitro<br /> <br /> KEÁT QUAÛ<br /> <br /> Doøng teá baøo MCF-7 ñöôïc duy trì trong 2,5%<br /> charcoal dextran-treated FBS medium trong 24 giôø.<br /> Teá baøo ñöôïc ñieàu trò vôùi chaát öùc cheá lysosyme<br /> (chloroquin 100 μM) hoaëc chaát öùc cheá proteasome<br /> (lactacystin 20 μM), 3 giôø sau teá baøo tieáp tuïc ñöôïc<br /> ñieàu trò vôùi ICI 182,780; estradiol hoaëc kaempferol<br /> trong 6 giôø.<br /> Khaûo saùt baèng Northern blot<br /> Teá baøo ñöôïc ly giaûi baèng dung dòch TRIzol vaø tieán<br /> trình phaân taùch RNA ñöôïc tieán haønh theo chæ daån cuûa<br /> nhaø saûn xuaát. Moãi maãu coù cuøng haøm löôïng RNA ñöôïc<br /> phaân taùch treân gel 1% agarose vaø sau ñoù ñöôïc blot leân<br /> maøng nylon12. cDNA cuûa ER-α ngöôøi ñöôïc ñaùnh daáu<br /> vôùi [α32P]dCTP.<br /> Khaûo saùt baèng Western blot<br /> Teá baøo sau khi ñöôïc nuoâi caáy vaø ñieàu trò ñöôïc ly<br /> giaûi vôùi dung dòch ly giaûi. Moãi maãu coù cuøng haøm<br /> löôïng protein ñöôïc thöïc hieän phaân tích western<br /> blot33. Sau ñoù caùc maøng ñöôïc uû vôùi caùc khaùng theå<br /> thích hôïp ôû nhieät ñoä 4oC trong 12 giôø. Sau ñoù caùc<br /> maøng ñöôïc röûa vaø ñöôïc tieáp tuc uû vôùi horseradish<br /> peroxidase-conjugated donkey anti-mouse hoaëc antirabbit secondary antibody trong 1 giôø. Sau khi ñöôïc<br /> röûa, caùc maøng ñöôïc xöû lyù hoùa quyønh quang.<br /> Ñònh vò mieãn dòch ER-α<br /> Teá baøo sau khi ñöôïc nuoâi caáy vaø ñieàu trò treân 8champer slide ñöôïc coá ñònh vôùi 4% formalin trong<br /> PBS trong 1 giôø. Slide nhuoäm vôùi mouse antihuman-ER-α (pha loaõng 1:100) ôû nhieät ñoä 4oC trong<br /> 14 giôø. Keá tieáp nhöõng slide treân ñöôïc uû vôùi rabbit<br /> anti-mouse FITC conjugated secondary antibody<br /> trong moät giôø ôû nhieät ñoä phoøng. Keát quaû ñöôïc quan<br /> <br /> Phaân tích thoáng keâ<br /> Söï khaùc bieät veà soá löôïng teá baøo vaø möùc ñoä cuûa<br /> protein ñöôïc phaân tích baèng haøm ANOVA.<br /> <br /> Hình 1 cho thaáy soá löôïng teá baøo vaø möùc ñoä toång<br /> hôïp DNA cuûa caùc loaïi teá baøo MCF-7, T47D, ZR-75 vaø<br /> MDA 231. Teá baøo soáng nhuoäm vôùi trypane blue ñöôïc<br /> ñeám baèng hemocytometry ñöôïc thöïc hieän ôû 24 vaø 48<br /> giôø sau khi ñieàu trò vôùi kaempferol (P