Kết quả bước đầu phát hiện vi khuẩn lao bằng LAMP

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017<br /> <br /> KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU PHÁT HIỆN<br /> VI KHUẨN LAO BẰNG LAMP<br /> Triệu Tiến Sang*; Trần Văn Khoa*; Nguyễn Duy Bắc*<br /> TÓM TẮT<br /> Sự phát triển của kỹ thuật làm tăng độ nhạy phát hiện vi khuẩn lao, là một trong những ưu<br /> tiên hàng đầu của nghiên cứu phát hiện mầm bệnh lao trong nhiều năm qua vì bệnh lao vẫn là<br /> một mối đe dọa lớn tới sức khỏe. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt đoạn vòng lặp kiểu k p<br /> tóc (LAMP - loop-mediated isothermal amplification) là phương pháp mới phát hiện axít nucleic,<br /> có thể sử dụng được ở những nơi không có trang thiết bị đắt tiền. Mục tiêu: hoàn thiện kỹ thuật<br /> LAMP-PCR phát hiện gen đích của Mycobacterium tuberculosis. Phương pháp: 15 mẫu bệnh<br /> phẩm đờm của bệnh nhân (BN) lao được xác định, thiết kế mồi trên cơ sở trình tự chèn lặp lại<br /> IS6110 như một gen đích cho phản ứng LAMP. Kiểm tra kết quả bằng realtime-PCR, điện di<br /> trên gel agarose. Kết quả: đã hoàn thiện được quy trình LAMP-PCR để phát hiện vi khuẩn lao.<br /> * Từ khoá: Vi khuẩn lao; Kỹ thuật LAMP.<br /> <br /> Initial Results of using Lamp in Mycobacterium Tuberculosis<br /> Detection<br /> Summary<br /> Developing techniques to improve sensitivity in Mycobacterium tuberculosis detection is one<br /> of the international research priorities recently, because TB remains globally a major health<br /> threat. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a new nucleic acid detection method<br /> that can be used in laboratories without expensive equipments. Objectives: To develop the<br /> LAMP-PCR technique for detecting target genes of Mycobacterium tuberculosis. Subjects and<br /> methods: 15 specimens of sputum specimens of TB patients were identified, primer design<br /> based on repeat sequence IS6110 as target gene for LAMP-PCR. Examine the results using<br /> realtime-PCR and electrophoresis on agarose gel. Results: We have completed the LAMP-PCR<br /> process for Mycobacterium tuberculosis detection.<br /> * Keywords: Mycobacterium tuberculosis; LAMP technique.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hiện nay, bệnh lao vẫn là nguyên nhân<br /> thứ hai gây tử vong do một tác nhân<br /> nhiễm trùng đơn lẻ. Chẩn đoán nhanh và<br /> hiệu quả bệnh lao là một trong những vấn<br /> <br /> đề quan trọng trong việc phòng chống bệnh<br /> này trên toàn cầu [4 . Do tính đơn giản và<br /> chi phí thấp nên phương pháp soi dịch đờm<br /> vẫn là kỹ thuật chẩn đoán thường quy<br /> cho bệnh lao ở các nước đang phát triển.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Duy Bắc (bac_hvqy@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 04/09/2017<br /> <br /> 330<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Tuy nhiên, kỹ thuật này có độ nhạy thấp.<br /> Xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn cho độ<br /> nhạy cao hơn là tiêu chuẩn vàng, song<br /> nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp tốn<br /> thời gian, đòi hỏi kỹ thuật chuyên môn và<br /> chỉ thực hiện được tại các cơ sở chuyên<br /> ngành. Mặt khác, hình ảnh chụp X quang<br /> trong nhiều trường hợp không rõ ràng [5 .<br /> Các kỹ thuật dựa trên PCR là một trong<br /> những phương pháp mới hứa h n và hấp<br /> dẫn nhất so với các phương pháp thông<br /> thường. Tuy nhiên, không phải nơi nào<br /> cũng có điều kiện thực hiện do hạn chế<br /> về trang thiết bị, kỹ thuật.<br /> Gần đây, một kỹ thuật khuếch đại axít<br /> nucleic mới được mô tả, có tên là LAMP<br /> (Loop-Mediated Isothermal Amplification)<br /> [6 . LAMP có nhiều ưu điểm hơn so với<br /> phương pháp PCR thông thường. Thứ<br /> nhất, phản ứng LAMP thực hiện ở nhiệt<br /> độ cố định (60 - 650C), điều này giúp tiết<br /> kiệm thời gian và thuận tiện hơn vì không<br /> cần phải mua thiết bị đắt tiền. Thứ hai,<br /> LAMP là một phản ứng đặc hiệu, vì nó sử<br /> dụng 4 hoặc 6 mồi khác nhau nhận biết<br /> nhiều vùng khác biệt trên trình tự đích.<br /> Thứ ba, kỹ thuật LAMP cho kết quả với<br /> hiệu suất cao trong tổng hợp sản phẩm<br /> khuếch đại, ít nhất là 50 lần so với phản<br /> ứng PCR thông thường ở cùng một thể<br /> tích. Cùng với phản ứng khuyếch đại, một<br /> <br /> ’<br /> <br /> ’<br /> <br /> lượng lớn muối kết tủa của magiê<br /> pyrophosphat được tạo ra như một sản<br /> phẩm phụ làm tăng độ đục của hỗn hợp<br /> phản ứng, cho phép phát hiện bằng mắt<br /> thường hoặc đo độ đục. Do đó, không<br /> cần thiết bị đòi hỏi tốn nhiều thời gian cho<br /> bước phát hiện sau khuếch đại.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợngnghiên cứu.<br /> 15 mẫu đờm lâm sàng được lấy từ BN<br /> đã xác nhận mắc lao (TB), do Trung tâm<br /> Phòng chống Lao Hà Nội cung cấp. Tách<br /> ADN từ mẫu bằng kít Qiagen, 10 ul ADN<br /> tách chiết được sử dụng cho mỗi phản<br /> ứng LAMP dưới điều kiện tối ưu. Để kiểm<br /> soát nhiễm chéo, sử dụng 1 đối chứng<br /> âm cho mỗi 3 phản ứng lâm sàng của mẫu.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * LAMP primer:<br /> Để phát triển một kỹ thuật LAMP thành<br /> công, thiết kế mồi là bước quan trọng<br /> nhất. Chúng tôi đã tham khảo và sử dụng<br /> 6 trình tự mồi khác nhau để nhân một gen<br /> đích làm tăng độ đặc hiệu.<br /> Đặc điểm của các primers ADN<br /> oligonucleotide sử dụng cho IS6110-LAMP<br /> phát hiện Mycobacterium tuberculosis<br /> như dưới đây:<br /> <br /> Primer<br /> <br /> Tr nh tự (5 -3 )<br /> <br /> Chiều dài<br /> <br /> Vị trí đích<br /> <br /> IS-FOP<br /> <br /> AGACCTCACCTATGTGTCGA<br /> <br /> 20-mer<br /> <br /> 812-831<br /> <br /> IS-BOP<br /> <br /> TCGCTGAACCGGATCGA<br /> <br /> 17-mer<br /> <br /> 1029-1045<br /> <br /> IS-FIP<br /> (F1c+F2)<br /> <br /> ATGGAGGTGGCCATCGTGGAAG<br /> <br /> 41-mer<br /> <br /> 904-925, 847-865<br /> <br /> CCTACGTGGCCTTTGTCAC<br /> <br /> Sản phẩm<br /> (bp)<br /> <br /> 169<br /> <br /> 331<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017<br /> IS-BIP<br /> (B1c+B2)<br /> <br /> AAGCCATCTGGACCCGCCAA<br /> CCCCTATCCGTATGGTGGAT<br /> <br /> 40-mer<br /> <br /> 946-965, 996-1015<br /> <br /> IS-FLP<br /> <br /> AGGATCCTGCGAGCGTAG<br /> <br /> 18-mer<br /> <br /> 872-889<br /> <br /> IS-BLP<br /> <br /> AAGAAGGCGTACTCGACCTG<br /> <br /> 20-mer<br /> <br /> 967-986<br /> <br /> Hình 1: Sơ đồ và vị trí gắn mồi trên đoạn gen IS6110 của M. Tuberculosis.<br /> ((A) Sơ đồ trình tự của IS6110 đầy đủ như trên mũi tên đen đậm được đánh dấu vị<br /> trí: phần trên cùng (A) cho thấy vùng khuếch đại đích bởi PCR và các mồi nested PCR;<br /> phần dưới (A) cho thấy 8 vùng khác nhau được nhận diện bởi primer của LAMP Mồi<br /> xuôi bên ngoài (FOP) và mồi ngược bên ngoài (BOP) lần lượt tương ứng với các trình<br /> tự của các vùng F3 và B3 của đích Mồi xuôi bên trong (FIP) chứa trình tự có nghĩa của<br /> vùng F2 ở đầu 3’ được kết nối trực tiếp với trình tự F1c (trình tự bổ sung tới trình tự F1)<br /> ở đầu 5’, và mồi ngược bên trong (BIP) chứa trình tự có nghĩa của vùng B2 tại đầu 3’<br /> trực tiếp liên kết với B1c (bổ sung trình tự đến vùng B1) ở đầu 5’ Mồi xuôi vòng (FLP)<br /> và mồi ngược vòng (BLP), lần lượt chứa trình tự bổ sung cho một phần của trình tự<br /> giữa F1 và F2 và giữa các vùng B1 và B2 (B) Vị trí gắn mồi và vị trí khuếch đại của<br /> mồi LAMP trên đích 234bp được chọn của IS6110 Dấu (*) cho biết các biến thể dựa<br /> trên chuỗi IS6110 của các chủng lao khác nhau)<br /> 332<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> * Phản ứng LAMP-PCR:<br /> Kỹ thuật LAMP được tối ưu hóa ở thể<br /> tích tổng cộng 25 ul, sử dụng 15 ul<br /> Isothermal Master mix cho LAMP<br /> (OptiGene, Anh), 0,1% uM mỗi IS-FIP và<br /> IS-BIP, 0,2 uM mỗi IS-FOP và IS-BOP,<br /> 0,8 uM mỗi IS-FLP và IS-BLP, 2 mM<br /> dNTPs, 6 mM MgSO4, 8U Bst ADN<br /> polymerase và 5 ul ADN khuôn từ mẫu<br /> tách chiết. Phản ứng thực hiện ở nhiệt độ<br /> tối ưu là 650C trong 90 phút, kết thúc<br /> bằng bất hoạt enzym ở 900C trong 2 phút.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> Để kiểm tra, đánh giá kết quả phản<br /> ứng LAMP, thông thường chỉ cần một<br /> trong các cách thức là:<br /> <br /> - Quan sát bằng mắt thường thông<br /> qua biến đổi độ đục của dung dịch phản<br /> ứng: mẫu dương tính sẽ cho màu trắng<br /> đục, mẫu âm tính có màu trong suốt.<br /> - Quan sát sau khi nhuộm bằng thuốc<br /> nhuộm huỳnh quang (thường dùng là<br /> SYBR green I) bổ sung trực tiếp vào ống<br /> PCR: mẫu dương tính sẽ cho màu xanh,<br /> mẫu âm tính có màu vàng cam.<br /> - Điện di agarose thường: mẫu dương<br /> tính cho kết quả băng điện di có dạng<br /> nhiều băng vạch giống như thang chuẩn,<br /> mẫu âm tính có dạng dải smear của ADN<br /> khuôn và các dimer.<br /> Trong nghiên cứu này, do chúng tôi sử<br /> dụng master mix đã có sẵn SYBR green I,<br /> có thể kiểm tra trên máy realtime-PCR và<br /> diện di trên gel agarose (khi áp dụng trong<br /> thực tế, không cần thiết bị realtime-PCR).<br /> <br /> 1. Kết quả đánh giá qua điện di trên agarose.<br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP-PCR trên 15 mẫu nghiên cứu.<br /> (M: thang ADN, 100 bp; (-) và (+): mẫu chứng âm và mẫu chứng dương;<br /> 1-15: 15 mẫu dương tính)<br /> 2. Kết quả đánh giá qua tín hiệu huỳnh quang trên hệ thống realtime.<br /> Độ nhạy cao của kỹ thuật IS6110-LAMP phụ thuộc vào thời gian của phản ứng<br /> khuếch đại. Để khảo sát thời gian theo thời gian thực, chúng tôi khảo sát trên máy<br /> 333<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017<br /> realtime-PCR. LAMP có đặc điểm diễn ra liên tục trong điều kiện đẳng nhiệt. Vì vậy,<br /> chúng tôi xác định thời gian theo chu kỳ giả định, mỗi chu kỳ phản ứng tương đương<br /> với 1 phút.<br /> <br /> Hình 3: Hình ảnh LAMP-PCR trên hệ thống realtime.<br /> (Ký hiệu trên trái (-) và dưới cùng bên phải (+): mẫu chứng dương và mẫu chứng âm;<br /> còn lại: các mẫu bệnh phẩm lâm sàng)<br /> Hình ảnh cho thấy, hầu hết các mẫu có tăng tín hiệu chỉ sau 20 phút, 1 mẫu số 12<br /> tăng tín hiệu sau 50 phút. Trong khi đó, mẫu chứng âm sau 85 phút không thấy tăng<br /> tín hiệu huỳnh quang.<br /> BÀN LUẬN<br /> Các kỹ thuật dựa trên LAMP với đích<br /> gyrB và rrs gần đây đã được mô tả nhằm<br /> phát hiện ra vi khuẩn lao [1, 3 . Trong<br /> nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ<br /> thuật LAMP để phát hiện vi khuẩn lao<br /> dựa trên khuếch đại trình tự chèn 6110<br /> (IS6110). IS6110, đặc trưng cho chủng M.<br /> tuberculosis. Hơn nữa, hầu hết các thành<br /> viên của vi khuẩn lao chứa nhiều bản sao<br /> của IS6110, do đó sử dụng gen mục tiêu<br /> này sẽ làm tăng độ nhạy [7 .<br /> Qua kết quả nhân gen và kiểm tra<br /> bằng điện di trên gel agarose (hình 2) cho<br /> thấy các mẫu có dạng nhiều băng vạch,<br /> cấu trúc hình thang ADN đặc trưng của<br /> 334<br /> <br /> sản phẩm được khuếch đại LAMP do kết<br /> quả nhân lên kiểu vòng lặp. Kích thước<br /> sản phẩm các đoạn lặp trong phản ứng<br /> LAMP vào khoảng 169 bp (băng vị trí<br /> thấp nhất trên bản gel) trên gel agarose,<br /> cho thấy khuếch đại đặc hiệu của trình tự<br /> đích như thiết kế.<br /> Kết quả thể hiện qua phản ứng LAMP<br /> trên thiết bị realtime cũng cho thấy sự<br /> trùng lặp (hình 3).<br /> Bên cạnh việc tăng độ nhạy, một lợi<br /> thế lớn khác của kỹ thuật LAMP so với<br /> PCR và nested-PCR là thời gian tiến<br /> hành kỹ thuật, chỉ cần khoảng 1,5 giờ để<br /> thực hiện kỹ thuật LAMP-PCR so với 2,5<br /> giờ đối với kỹ thuật PCR thường và<br /> <br />