Khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp hPDGF-BB tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 255­260<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP <br /> hPDGF­BB (HUMAN PLATELET­DERIVED GROWTH FACTOR BB) <br /> TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Pichia pastoris<br /> <br /> Dương Long Duy, Phạm Minh Vũ, Nguyễn Trí Nhân, <br /> Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo*<br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn<br /> <br /> TÓM TẮT:  hPDGF­BB (human platelet­derived growth factor BB) là nhân tố  tăng trưởng có  <br /> nguồn gốc từ tiều cầu đóng vai trò quan trọng trong quá trình lành hóa vết thương đã được Cục  <br /> quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ  (Food and Drug Administration ­ FDA) chỉ  định  <br /> điều trị biến chứng lở loét chi ở  bệnh nhân đái tháo đường. Với mục tiêu sản xuất lượng lớn  <br /> rhPDGF­BB nhằm mục đích điều trị bệnh và nghiên cứu, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện  <br /> lên men mẻ  bổ  sung (fed­batch) trong bồn lên men 1 lít để  sản xuất hPDGF­BB tái tổ  hợp <br /> (rhPDGF­BB) từ chủng Pichia pastoris X33::pdgf­b tái tổ hợp mang đa bản sao gen mã hóa cho <br /> hPDGF­BB. Quá trình lên men mẻ  bổ  sung được tiến hành qua ba giai đoạn: mẻ  glycerol, bổ <br /> sung glycerol và bổ  sung methanol (cảm  ứng biểu hiện protein mục tiêu). Giai đoạn mẻ và bổ <br /> sung glycerol tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 30oC và pH 5,0. Giai đoạn bổ sung methanol nhằm <br /> cảm  ứng biểu hiện protein được khảo sát  ở  hai giá trị  nhiệt độ  25oC và 30oC, và ba giá trị pH <br /> 3,5; 5,0 và 6,5. Kết quả cho thấy, cảm ứng biểu hiện ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau  <br /> không  ảnh hưởng nhiều đến sức sống của chủng tái tổ  hợp. Cảm  ứng biểu hiện rhPDGF­BB  <br /> đạt sản lượng cao nhất, 686,69 mg/l, ở điều kiện nhiệt độ 30 oC và pH 6,5 ­ cao gấp 7,63 lần so  <br /> với nuôi cấy lắc.<br /> Từ khóa: Pichia pastoris, bồn lên men 1 lít, lên men mẻ bổ sung, rhPDGF­BB <br /> <br /> MỞ ĐẦU X33::pdgf­b  mang 16 bản sao gen mã hóa cho <br /> PDGF­B có khả năng tiết nhân tố PDGF­BB ra <br /> Nhân   tố   tăng   trưởng   từ   tiểu   cầu  <br /> môi   trường   nuôi   cấy  dưới   sự   cảm  ứng   của <br /> (Platelet­derived growth factor ­ PDGF) là một <br /> methanol. Tuy nhiên, việc khảo sát điều kiện <br /> yếu tố  phân bào được sản xuất chủ  yếu từ <br /> lên men sinh tổng hợp hPDGF­BB bằng các hệ <br /> tiểu cầu và giữ  nhiều chức năng trong cơ  thể <br /> thống   fermentor   nhằm   hướng   đến   sản   xuất <br /> như  tham gia điều hòa quá trình phát sinh và <br /> protein   ở   quy   mô   pilot   vẫn   chưa   được   tiến <br /> phát triển của cơ quan, hệ thần kinh, đặc biệt <br /> hành. Theo James (2007) [7], quá trình lên men <br /> là   thúc   đẩy   làm   lành   vết   thương  [2].   Năm <br /> P. pastoris biểu hiện protein tái tổ  hợp  ở  quy <br /> 1997, PDGF­BB được tổ chức FDA (Food and  <br /> mô pilot có thể  được tiến hành theo phương <br /> Drug Administration) cấp phép sử  dụng điều <br /> pháp   mẻ   bổ   sung   (fed­batch)   và   cần   được <br /> trị  chứng loét chân do đái tháo đường [9]. Tại <br /> khảo   sát   thực   nghiệm   riêng   cho   từng   loại  <br /> Việt Nam, việc điều trị  chứng bệnh này rất <br /> protein. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến <br /> tốn  kém  do nguồn thuốc  điều trị  phải  nhập  <br /> hành khảo sát điều kiện nhiệt độ  và pH cho <br /> khẩu với giá thành cao. Đồng thời, việc sản <br /> quá trình lên men sinh tổng hợp rhPDGF­BB  <br /> xuất và ứng dụng PDGF để điều trị chứng loét <br /> của   chủng  P.   pastoris  X33::pdgf­b  bằng   hệ <br /> chân do đái tháo đường  cũng như  phát triển  <br /> thống bồn lên men 1 lít. <br /> thành các dược phẩm và mỹ phẩm chưa được <br /> nghiên   cứu   rộng  rãi   trong   nước.   Vương   Cát <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Khánh và nnk. (2014) [4] đã công bố  thu nhận <br /> thành   công   dòng   nấm   men  Pichia   pastoris   Chủng nấm men tái tổ  hợp: chủng nấm <br /> <br /> <br /> 255<br /> men tái tổ  hợp  P. pastoris  X33::pdgf­b  được  Anh).<br /> tạo  dòng  từ   chủng   hoang  dại   với   kiểu  hình  Định lượng protein hPDGF­BB:  nồng độ <br /> Mut+  được cung cấp bởi Bộ  môn Công nghệ  protein tổng có trong dịch lên men được xác <br /> Sinh  học  Phân  tử   &  Môi  trường,   Khoa  Sinh  định bằng phương pháp Bradford [6]. Phân tích <br /> học,   Trường   Đại   học   Khoa   học   tự   nhiên,  kết   quả   điện   di   trên   gel   SDS­PAGE   bằng <br /> ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh [4]. phần mềm ImageJ để xác định lượng hPDGF­<br /> Lên men mẻ  bổ  sung (fed­batch): chủng  BB. So sánh lượng hPDGF­BB thu được giữa <br /> P.  pastoris  X33::pdgf­blưu  trữ   ở  ­80oC  được  các mẻ và chọn ra điều kiện lên men tốt nhất.<br /> hoạt hóa trong 50 ml môi trường BMGY (cao  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> nấm   men   1%,   peptone   2%,   100   mM   đệm <br /> phosphate pH 6,0)  ở  25oC trong 24 giờ, OD 600  Khả   năng   tăng   trưởng   của   chủng  P.  <br /> đạt   khoảng  2,0­6,0.   Cấy  chuyền  50   ml   dịch   pastoris  X33::pdgf­b  khi lên men  ở  các điều <br /> hoạt   hóa  vào  bồn   lên  men  1  lít  (LiFlus   GX,   kiện nhiệt độ và pH khác nhau<br /> Biotron,   Hàn   Quốc)   có   chứa   450   ml   môi  Nhiệt độ và pH của môi trường là hai yếu <br /> trường   BSM   (1   lít   môi   trường   gồm:   26,7ml  tố   quan trọng  ảnh hưởng   lên năng  suất  tiết <br /> H3PO4  85%, 0,93g CaSO4, 18,2g K2SO4, 14,9g  protein  của  P.   pastoris.   Việc   giảm   nhiệt   độ <br /> MgSO4.7H2O, 4,13g KOH và 40g glycerol) đã  xuống   dưới   30oC   đã   được   nhiều   báo   cáo <br /> bổ   sung   khoáng   vi   lượng   PTM1   (1   lít   gồm:  chứng minh có  ảnh hưởng tích cực đến việc <br /> 6,0g CuSO4.5H2O, 0,08g NaI, 3,0g MnSO4.H2O,  sản   xuất   protein   ở  P.   pastoris,   trong  đó   dãy <br /> 0,2g Na2MoO4.2H2O, 0,02g H3BO3, 0,5g CoCl2,  nhiệt độ  khảo sát thường từ  20oC đến 30oC <br /> 20,0 g ZnCl2, 65,0 g FeSO4.7H2O, 0,2g biotin và  [1]. P. pastoris có khả  năng tăng trưởng  ở dãy <br /> 5,0 mL H2SO4). Tiến hành lên men mẻ  ở điều  pH rộng từ  3,0 đến 7,0 và việc thay đổi pH <br /> kiện nhiệt  độ  30oC,  pH  5,0,  DO  ≥ 10%,  pH  không   ảnh   hưởng   nhiều   đến   tốc   độ   tăng <br /> được điều chỉnh bằng NH4OH 25% và H3PO4  trưởng của chúng, tuy nhiên nhiều nghiên cứu <br /> 85%. Khi chủng tiêu thụ hết glycerol, glycerol  cho   thấy   việc   thay   đổi   pH   môi   trường   ảnh <br /> 50%   được   bổ   sung   thêm   với   tốc   độ   18,15  hưởng  lớn  đến mức   độ  sản xuất  protein và <br /> ml/l/giờ trong 4 giờ. Sau đó, methanol được bổ  giảm thiểu tác động của các enzyme protease <br /> sung với tốc độ  3,6 ml/l/giờ  trong 5 giờ  đầu  [8]. Trong nghiên cứu này, quá trình cảm  ứng <br /> đến   7,2   ml/l/giờ   trong   3   giờ   tiếp   theo   và  biểu hiện rhPDGF­BB đã được khảo sát tại 2 <br /> chuyển   sang   10,9   ml/l/giờ   cho   đến   hết   quá  điểm nhiệt độ  là 25oC và 30oC đồng thời kết <br /> trình lên men nhằm cảm ứng biểu hiện protein  hợp 3 giá trị  pH môi trường 3,5; 5,0 và 6,5.  <br /> mục tiêu. Tiến hành khảo sát điều kiện cảm  Đây là các giá trị đã được đề nghị bởi nhà sản  <br /> ứng biểu hiện hPDGF­BB lần lượt ở nhiệt độ  xuất Invitrogen (Mỹ) và được xây dựng dựa <br /> 25oC, 30oC kết hợp với các giá trị  pH 3,5, 5,0,  trên các khảo sát về  dãy nhiệt độ  và pH cho <br /> 6,5. Dịch  lên men  được  thu nhận sau mỗi  4  quá   trình   sinh   trưởng   của   chủng  P.   pastoris <br /> giờ, ly tâm thu dịch nổi để tiến hành phân tích. [7]. Dịch lên men được thu nhận sau mỗi 4 giờ <br /> Phân tích sự  biểu hiện protein hPDGF­ sau   đó   ly   tâm   để   xác   định   sinh   khối   tươi  <br /> BB bằng SDS­PAGE và Western blot:  dịch  (WCW). Dựa vào đồ  thị  (hình 1) ta thấy quá <br /> nổi   được   tiến   hành   điện   di   trên   gel   tricine  trình sinh trưởng của nấm men  ở các nghiệm <br /> SDS­PAGE 10% và chuyển thẩm protein lên  thức khác nhau là  ổn định và có độ  đồng đều. <br /> màng   lai   HybondTM   (Amersham,   Anh)   để  Kết   thúc   giai   đoạn   tăng   trưởng   trên   nguồn <br /> thực hiện lai  western với kháng thể  đa dòng  carbon chủ yếu là glycerol thể hiện  ở khoảng  <br /> kháng hPDGF­BB (R&D Systems, Hoa Kỳ) và  20­24 giờ đầu, lượng sinh khối tươi  ở các mẻ <br /> kháng thể   kháng IgG  của  thỏ  cộng hợp  với  đạt tương đương với khoảng 180­210g/l của <br /> horseradish   peroxidase   HRP   (Abcam,   Anh).  nhà   sản   xuất   Invitrogen  đưa  ra.   Điều   này <br /> Hiện   phim   bằng   bộ   Kit   ECL   (Amersham,  chứng tỏ việc nhân nhanh lượng sinh khối P.  <br /> <br /> <br /> 256<br /> pastoris  X33::pdgf­b  để   sử   dụng   cho   bước  giờ cảm  ứng biểu hiện bằng methanol, lượng  <br /> cảm  ứng biểu hiện tiếp theo đã diễn ra thành  sinh khối tươi của các mẻ thu được nằm trong <br /> công. Giai đoạn thứ  hai, chủng cần thời gian   khoảng 414­470g/l. Giá trị  này tương  đương <br /> để tổng hợp các thành phần cần thiết cho việc   với khoảng đề nghị do nhà sản xuất Invitrogen  <br /> sử   dụng     methanol   như   nguồn   carbon   duy   đề   ra   (350­450   g/l)   chứng   tỏ   quá   trình   sinh <br /> nhất, do đó hầu như chủng không tăng trưởng   trưởng và trạng thái sinh lý của chủng  Pichia  <br /> thêm. Thời gian đáp  ứng đối với methanol còn  pastoris  X33::pdgf­b  trong các thí nghiệm của <br /> tùy thuộc vào điều kiện sinh lý của chủng. Sau  chúng   tôi   đã   diễn   ra   bình   thường   và   tương <br /> đó,   khi   chủng   sử   dụng   methanol   là   nguồn  đồng với chuẩn của nhà sản xuất cũng như <br /> carbon   duy   nhất,   đồng   thời   promoter   AOX1   tương tự  một số  nghiên cứu sản xuất protein <br /> được kích hoạt, gen mục tiêu được biểu hiện   tái tổ  hợp khác trên hệ  thống  P. pastoris  [7 , <br /> và tiết protein mục tiêu ra ngoài. Kết thúc 72  10].<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình   1.  Đồ   thị   lượng   sinh   khối <br /> tươi theo giờ   ở  các điều kiện lên <br /> men khác nhau.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kiểm tra sự biểu hiện rhPDGF­BB ở các điều kiện lên men khác nhau (chú thích bên trên  <br /> hình) bằng (a) điện di gel tricine SDS­PAGE 10%; và (b) lai Western với kháng thể đặc hiệu cho <br /> hPDGF­BB. (LMW: Low Molecular Weight, thang trọng lượng phân tử thấp).<br /> <br /> Bên   cạnh   đó,   chúng   tôi   cũng   tiến   hành  không bị  tạp nhiễm mặc dù quá trình lên men  <br /> quan sát dịch lên men dưới kính hiển vi quang  dài ngày và môi trường nuôi cấy không hề  bổ <br /> học để xem xét khả năng tạp nhiễm trong quá  sung kháng sinh hay các chất kháng nấm. Có <br /> trình lên men. Kết quả  cho thấy dịch lên men  thể  là do môi trường BSM  chỉ  gồm khoáng, <br /> <br /> 257<br /> glycerol   và   nguồn   nitrogen   cung   cấp   cho   protein   biểu   kiến   tính   toán   dựa   trên   tình   tự <br /> chủng tăng trưởng được lấy từ  NH4OH dùng  amino acid (khoảng 24,5kDa), và tương đương <br /> để   điều   chỉnh   pH   trong   quá   trình   nuôi   cấy.   với   trọng  lượng   các   protein  rhPDGF­BB   thu <br /> Mặt   khác,   ở   giai   đoạn   cảm   ứng   biểu   hiện,  được  từ  các hệ  thống biểu hiện khác  [3, 5, <br /> methanol là chất độc đối với phần lớn các vi  11].  Ở  điều kiện pH 6,5, các protein tạp kích <br /> sinh vật khác, chính vì vậy đã giúp hạn chế  thước  khoảng   43kDa   đến   94kDa   giảm   đáng <br /> được sự tạp nhiễm. kể,  tuy nhiên  lên  men  ở   25oC lại  cho  nhiều <br /> Kiểm tra sự biểu hiện rhPDGF­BB  protein tạp dưới 30kDa hơn . Một điểm thú vị <br /> Kết   quả   điện   di   gel   tricine   SDS­PAGE  đó   là   vạch  protein  rhPDGF­BB   ở   pH   3,5   có <br /> 10% các mẫu dịch nổi mỗi 12 giờ sau khi cảm   kích thước lớn hơn có thể do protein mục tiêu <br /> ứng  ở  (hình 2a) cho thấy tại vị trí tương  ứng   bị glycosyl hóa mức độ cao hơn khi lên men ở <br /> với vạch 30kDa của thang chuẩn có xuất hiện  pH thấp, làm tăng trọng lượng phân tử. Quá <br /> một   vạch  protein   to  và   đậm   tương   ứng   với  trình glycosyl hóa này cũng góp phần làm thay <br /> trọng lượng biểu kiến của protein hPDGF­BB   đổi kích thước phân tủ  hPDGF­BB sản xuất <br /> vào   khoảng   25kDa   và   có   sự   biểu   hiện   các  bằng hệ  thống  P. pastoris  so với hPDGF­BB <br /> protein tạp khác nhau khi thay đổi điều kiện  sản xuất từ  vi khuẩn như  E. coli  thường có <br /> pH cảm  ứng. Kích thước vạch protein to đậm  kích thước nhỏ hơn 30kDa [5]. Tuy nhiên cần  <br /> này   tuy   lớn   hơn   kích   thước   biểu   kiến   của   tiến hành thêm các bước phân tích khác để xác <br /> hPDGF­BB   nhưng   lại   phù   hợp   với   kết   quả  định mức độ glycosyl hóa và sự ảnh hưởng lên <br /> của một số  nghiên cứu sản xuất rhPDGF­BB  hoạt tính của protein mục tiêu. Để khẳng định <br /> trên  các hệ  thống  biểu hiện  nhân thực  khác  các vạch protein trên là rhPDGF­BB, chúng tôi <br /> như   nấm   men  S.   cerevisiae  hay   nấm   ăn  tiến hành lai Western với kháng thể  đặc hiệu <br /> Pleurotus   eryngii  [11,   2].   Trong  khi   đó,   điều  cho hPDGF­BB. Kết quả lai Western (hình 2b) <br /> kiện nhiệt  độ  dường như  không  ảnh hưởng  cho thấy, trên bảng phim xuất hiện tín hiệu <br /> nhiều tới thành phần tạp. Cụ thể, ở điều kiện  dương   tính   chứng   tỏ   chúng   tôi   đã   cảm   ứng <br /> pH 3,5 và 5,0 đều cho những vạch protein tạp  biểu   hiện   thành   công   hPDGF­BB   bằng <br /> phần   lớn   có  kích   thước   trên   30kDa.   Kích  phương   pháp   lên   men   mật   độ   cao   dưới   sự <br /> thước   này   gần   tương   đương   trọng   lượng  cảm ứng của methanol.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình   3.  Đồ   thị   lượng   protein <br /> tiết   tổng   số   theo   giờ   của   các <br /> mẻ lên men trong quá trình cảm <br /> ứng biểu hiện protein mục tiêu<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Bảng 1. Nồng độ protein tổng số và lượng protein rhPDGF­BB có trong dịch lên men sau 72 giờ <br /> <br /> <br /> 258<br /> cảm ứng giữa các mẻ<br /> 30oC 25oC<br /> Điều kiện lên men<br /> pH 3,5 pH 5,0 pH 6,5 pH 3,5 pH 5,0 pH 6,5<br /> Lượng protein tổng số (mg/l) 1104,4 1174,7 1204,3 583,3 997,3 1319,9<br /> Tỷ lệ hPDGF­BB(%) 54,83 48,35 57,02 44,03 44,63 34,12<br /> Lượng hPDGF­BB (mg/l) 605,54 567,97 686,69 256,83 446,18 450,35<br /> <br /> Xác định lượng protein hPDGF­BB    được  chế  sự  tiết protease ra môi trường, làm tăng <br /> tiết ra sản lượng protein mục tiêu [1, 7, 8]. Tuy nhiên <br /> trong trường hợp này, khi lên men  ở  nhiệt độ <br /> Lượng protein tiết tổng số của các mẻ lên <br /> thấp và pH thấp, lượng protein mục tiêu lại <br /> men tại các thời điểm mỗi 12 giờ sau khi cảm <br /> giảm hẳn so với điều kiện nhiệt độ  cao hơn  <br /> ứng (hình 3) ở các điều kiện lên men nhiệt độ <br /> và pH cao hơn.<br /> 30oC, dường như  không có sự  khác biệt lớn <br /> giữa các pH cảm  ứng khác nhau và nằm trong  KẾT LUẬN<br /> khoảng 1100 ­ 1200 mg/l (bảng 1). Trong khi  <br /> đó,  ở  điều kiện 25oC, có sự  khác biệt lớn về  Khả   năng  tăng  trưởng   của   chủng  Pichia <br /> lượng protein tiết ra, thấp nhất là ở pH 3,5 với   pastoris  X33::pdgf­b  không   bị   ảnh   hưởng <br /> 583,3 mg/l, tiếp theo là pH 5,0 với 997,3 mg/l  nhiều khi lên men ở các điều kiện nhiệt độ và  <br /> và cao nhất là  ở  pH 6,5 1319,9 mg/l. Lượng   pH khác nhau. Chủng nấm men tái tổ  hợp đã <br /> tiết  ở  điều kiện 25oC pH 6,5 lại không chênh  biểu hiện thành công rhPDGF­BB tái tổ  hợp <br /> lệch nhiều so với  ở  30 oC pH 6,5 và đều cao  dưới dạng tiết ra môi trường nuôi cấy khi lên  <br /> hơn so với nuôi cấy  ở  những pH thấp hơn.   men mật độ  cao  ở  các điều kiện nhiệt độ  và <br /> Điều đó chứng tỏ, khi hạ nhiệt độ lên men kết  pH khác nhau dưới sự cảm  ứng bởi methanol.  <br /> hợp với hạ  thấp pH của môi trường đã làm  Việc cảm  ứng biểu hiện  ở pH 3,5 có thể  làm <br /> giảm lượng protein tiết ra bên ngoài mặc dù  tăng   mức   độ   glycosyl   hóa   đối   với   protein  <br /> không   làm   ảnh   hưởng   nhiều   đến   khả   năng  hPDGF­BB.   Lên   men   ở   điểu   kiện   nhiệt   độ <br /> sinh trưởng của chủng.  30oC và pH 6,5 cho lượng hPDGF­BB cao nhất <br /> 686,69   mg/ml   với   độ   tinh   sạch   cao   nhất <br /> Ghi   nhận   hình   ảnh   và   phân   tích   lượng <br /> 57,02%. Độ  tinh sạch cao giúp cho việc tinh <br /> rhPDGF­BB có trong mẫu 72 giờ của tất cả 6 <br /> chế  thu nhận hPDGF­BB được dễ  dàng hơn. <br /> mẻ lên men được điện di trên cùng một miếng <br /> Mặt khác khi lên men ở 30oC sẽ giúp giảm bớt <br /> gel SDS­PAGE bằng phần mềm ImageJ (Viện <br /> chi   phí   cho   việc   làm   mát   so   với   lên   men   ở <br /> nghiên cứu Sức khỏe Quốc gia, Hoa Kỳ). Kết  <br /> 25oC.<br /> quả  cho thấy,  ở  điều kiện nhiệt độ  30oC, độ <br /> tinh sạch cao hơn hẳn so với  ở điều kiện 25oC  Lời cảm  ơn:  nghiên cứu được thực hiện từ <br /> và điều kiện lên men 30oC và pH 6,5 cho độ  nguồn kinh phí của đề tài nghiên cứu khoa học  <br /> tinh sạch cao nhất với 57,02% tương  ứng với   cấp Sở  KH&CN  Tp.  HCM  “Nghiên cứu tạo <br /> lượng hPDGF­BB  cao  nhất  686,69 mg/l,  cao   yếu   tố   tăng   trưởng   tái   tổ   hợp   từ   tiểu   cầu  <br /> gấp   7,63  lần  so   với   nuôi   cấy   lắc   (bảng   1).   (Platelet­derived   growth   factor­PDGF)   nhằm <br /> Trong khi đó, cùng điều kiện pH 6,5 nhưng khi  điều trị loét bàn chân đái tháo đường” (số hợp  <br /> hạ   nhiệt   độ   từ   30oC   xuống   25oC   thì   lượng  đồng: 219/2013/HĐĐH­SKHCN).<br /> rhPDGF­BB lại giảm xuống còn 450,35 mg/l. <br /> Lên men  ở điều kiện pH 3,5 và nhiệt độ 25oC  TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> cho lượng hPDGF­BB thấp nhất 256,83 mg/l. 1. Anasontzis   G.   E.   et   al.,   2014.   Effects   of <br /> Theo một số nghiên cứu, việc nuôi cấy P.  temperature   and   glycerol   and   methanol­<br /> pastoris  ở  pH thấp và nhiệt độ  thấp sẽ  hạn   feeding   profiles   on   the   production   of <br /> <br /> <br /> 259<br />  recombinant   galactose   oxidase   in  Pichia   Quantitation   of   Protein.   Methods   in <br /> pastoris. Biotechnol Prog., 30(3): 728­735. Enzymology, 463(8): 73­95.<br /> 2. Heldin   C.   H.,   Westermark   B.,   1999.  7. James   M.   C.,   2007. Pichia   protocols. <br /> Mechanism   of   action   and   in   vivo   role   of  Humana Press, USA, 5­6.<br /> platelet­derived growth factor. Physiological  8. Pınar   Ç.   et   al.,   2010.   Influence   of   pH   on <br /> Reviews, 79(4): 1283­1316. recombinant   human   growth   hormone <br /> 3. Choi Jun­Hui et al., 2011, Expression and  production   by  Pichia   pastoris.   Journal   of <br /> production   of   therapeutic   recombinant  Chemical   Technology   &   Biotechnology, <br /> human platelet­derived growth factor­BB in  85(12): 1628­1635.<br /> Pleurotus   eryngii.   Applied   Biochemistry  9. Rožman P., Bolta Z., 2007. Use of platelet <br /> and Biotechnology, 165(2): 611­623. growth factors in treating wounds and soft­<br /> 4. Vương Cát Khánh, Ngô Thị  Huyền Trang,   tissue   injuries. Acta   Dermatovenerologica <br /> Nguyễn  Phạm   Phương   Thanh,   Đặng  Thị  Alpina,   Panonica   Et   Adriatica, 16(4):   156­<br /> Phương   Thảo,   Trần   Linh   Thước,   2014.   165.<br /> Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm  10. Thomas   I.   P.   et   al.,   2010.  Antibody <br /> men  Pichia pastoris  tái tổ  hợp đa bản sao  Expression   Kinetics   in   Glycoengineered <br /> biểu hiện nhân tố  tăng trưởng từ tiểu cầu  Pichia   pastoris.   Biotechnology   and <br /> PDGF­BB mức độ  cao. Tạp chí Sinh học,  Bioengineering, 106(6): 918­927.<br /> 36(1se): 77­83.<br /> 11. Wang Y. et al., 2009. High­level Secretory <br /> 5. Nagaraju   K.   et   al.,   2007.   Simple,   Rapid,  Production of Recombinant Human Platelet­<br /> High­Purity   Preparation   of   Recombinant  Derived   Growth   Factor­Bb   by <br /> Human Platelet­Derived Growth Factor­BB.  Saccharomyces Cerevisiae Under the Non­<br /> Biotechnology Letters, 29(9): 1333­1339. Selective Conditions. Applied Biochemistry <br /> 6. Noble   J.   E.,   Bailey   M.   J.   A.,   2009.  and Microbiology, 45(2): 156­161.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> OPTIMIZATION OF FERMENTATION CONDITIONS FOR THE PRODUCTION <br /> OF RECOMBINANT hPDGF­BB IN Pichia pastoris <br /> <br /> Duong Long Duy, Pham Minh Vu, Nguyen Tri Nhan, <br /> Tran Linh Thuoc, Dang Thi Phuong Thao<br /> University of Science, VNU ­ HCM city<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> hPDGF­BB (human Platelet­derived Growth Factor BB) is a growth factor that plays an important role in <br /> wound healing. It is indicated for treatment of foot ulcers in diabetic patients by FDA. Besides that, hPDGF­<br /> BB  also stimulates the recruitment  and proliferation  of a variety  of cell  types, including bone cells and  <br /> mesenchymal stem cells, and used to enhance bone graft. In order to produce rhPDGF­BB for therapeutic <br /> purposes, we  conducted  the research  on production of rhPDGF­BB  in Pichia  pastoris. In this study, we <br /> applied the fed­batch fermentation in 1­liter scale including glycerol batch, glycerol fed­batch and induction <br /> the   expression   of   rhPDGF­BB   by   feeding   methanol.   The   induction   stage   was   carried   out   at   different <br /> temperature (25oC, 30oC) and different pH (3.5; 5.0; 6.5). The result showed that fermentation at different <br /> <br /> <br /> 260<br /> temperature and different pH did not affect the growth of the recombinant Pichia pastoris X33::pdgf­b clone. <br /> Induction at low temperature and low pH will decrease the amount of secreted protein. Fermentation at 30 oC <br /> and pH 6.5 produced the highest amount of rhPDGF­BB with 686.69 mg/l which was 7.63­fold higher than  <br /> that of shake flask batch culture.<br /> Keywords: Pichia pastoris, fed­batch, one­liter fermenter, rhPDGF­BB.<br /> <br /> <br /> Ngày nhận bài: 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 261<br />