Khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen Pura ở các khác nhau

Chia sẻ: Thi Thi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

54
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) từ chủng E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam (E. ictaluri WT).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen Pura ở các khác nhau

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ĐỘT BIẾN GEN purA Ở CÁC ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU ASSESSTMENT OF DEVELOPMENT OF purA GENE KNOCKED-OUT EDWARDSIELLA ICTALURI STRAIN IN THE DIFFERENT STORE CONDITATIONS Nguyễn Thị Chi1, Võ Văn Nha2 Ngày nhận bài: 10/11/2014; Ngày phản biện thông qua: 21/12/2015; Ngày duyệt đăng: 25/12/2015 TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) từ chủng E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam (E. ictaluri WT). Kết quả nghiên cứu cho thấy sự phát triển của chủng E. ictaluri PAM ở các điều kiện bảo quản khác nhau cũng tương tự như sự phát triển của chủng E. ictaluri WT. Số lượng tế bào chủng E. ictaluri PAM có thể tồn tại ở mật độ khoảng 108 cfu/ống ở điều kiện bảo quản bằng lạnh sâu -300C, nhiều hơn so với việc bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có và không có phủ dầu khoáng ở 40C sau 90 ngày bảo quản. Từ khóa: Edwardsiella ictaluri đột biến gen purA, gen purA, vắc xin ABSTRACT The study was conducted to determine the growth of purA gene knocked-out Edwardsiella ictaluri strain (E. ictaluri PAM) from pathogenic strains of E. ictaluri ESC catﬁsh in the Mekong Delta, Vietnam (E. ictaluri WT). The results showed that in different storage conditions, the purA gene knocked-out strain (E. ictaluri PAM) had similar growth as the E. ictaluri WT. The number of E. ictaluri PAM strain cells was about 108 cfu/ tube in cold storage conditions at -300C, that was higher than in inclined BHI agar none or under oil at 40C after 90 days. Keywords: purA gene knocked-out Edwardsiella ictaluri, purA gene, vaccine I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới, các nghiên cứu đã phát hiện ra rằng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là một tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá nheo ở Mỹ, cá trê trắng ở Thái Lan và trên một số loài cá da trơn khác ở Indonesia, Trung Quốc [1]. Ở Việt Nam, tại hội thảo bàn về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra do Bộ NN&PTNT tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh cũng đã 1 2 đi đến kết luận rằng: Vi khuẩn E. ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam. Bệnh nhiễm khuẩn gây bởi E. ictaluri đã làm tổn thất lớn cho nghề nuôi cá da trơn ở Mỹ hàng năm từ 20-30 triệu USD [6]. Ở Việt Nam, E. ictaluri làm chết cá tra nuôi từ 10-90%, gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá tra hàng năm [4]. Vi khuẩn E. ictaluri có đặc tính sinh miễn dịch rất mạnh [7]. Nguyễn Thị Chi: Cao học Nuôi trồng thủy sản 2011 – Trường Đại học Nha Trang TS. Võ Văn Nha: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III Nha Trang TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 85 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 Thune và cộng sự (1997) đã tạo ra chủng vi không chọn lọc BHIA (Brain Heart khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA (LSU-E2), Infusion Agar), hãng Biorad - Mỹ và môi trường chủng chủng E. ictaluri đột biến gen purA nuôi cấy chọn lọc EIM (Edwardsiella Ictaluri (LSU-E2) được đem thử nghiệm độc lực cho Medium) theo Shotts và Waltman (1990) cho thấy, cá thí nghiệm tiêm chủng LSU-E2 ở phân lập chủng E. ictaluri; Môi trường BHIB nồng độ 105 và 106 cfu/cá , có tỷ lệ chết tích (Brain Heart Infusion Broth), hãng Biorad - Mỹ lũy của cá là 0% , trong khí đó với nồng độ được sử dụng để nuôi cấy tăng sinh chủng tiêm tương tự đối với chủng E. ictaluri hoang E. ictaluri. dại ban đầu thì tỷ lệ này tương ứng là 96,7% Ngoài ra, một số hóa chất, kháng sinh: và 100% [6]. Nghiên cứu này đã cung cấp Kanamycin, colistin sulphate, thuốc nhuộm thêm căn cứ cho thấy khả năng phòng bệnh Gram (cồn, acetone, fucsine, crystian violet), gan thận mủ cá tra của chủng E. ictaluri đột chlorin, NaCl, parafﬁn, cũng đã được sử dụng biến gen purA bằng công nghệ đột biến gen trong nghiên cứu này. là chấp nhận được. Năm 2010-2012, chương trình công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì đã tạo được dòng E. ictaluri đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) nhược độc, có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch, làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng công nghệ đột biến gen (knocked-out gene) [4].Tuy nhiên, cho đến nay việc lưu giữ, bảo quản chủng E. ictaluri đột biến gen purA chưa thấy có tài liệu đề cập. Nghiên cứu này nhằm xác định khả năng phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA ở các điều kiện bảo quản khác nhau. Từ đó có được điều kiện bảo quản phù hợp, phục vụ sản xuất vắc xin 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Xác định các chỉ tiêu về hình thái của E. ictaluri Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường BHIA (Peptone: 10 g; Veal Brain heart extract: 12,5 g; Beef Brain heart extract: 5 g; NaCl: 5 g; Disodium phosphate: 2,5 g; Glucose: 2 g; Agar: 15 g; Nước cất cho đủ 1000 ml) ở nhiệt độ 28oC, sau 48 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc bằng mắt thường và đo kích thước khuẩn lạc bằng thước đo có độ chính xác đến mm. Hình dạng, kích thước vi khuẩn E. ictaluri: Được xác định bằng phương pháp nhuộm nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cá tra. Gram [5], soi và đo kích thước vi khuẩn trên II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU vi thị kính, quan sát ở độ phóng đại 1000 lần. 1. Vật liệu Chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA kính hiển vi (Olympus CX 31, Nhật) có gắn trắc 2.2 Khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn được lưu giữ trên thạch nghiêng BHI ở 40C (E. ictaluri PAM) từ chủng E. ictaluri chưa đột + Vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA (E. biến, gây bệnh gan thận mủ cá tra nuôi ở đồng ictaluri PAM) và E. ictaluri chưa đột biến (E. bằng sông Cửu Long (E. ictaluri WT) có độc lực ictaluri WT) giữ đông ở -800C được đem nuôi cao được cung cấp bởi đề tài cấp Nhà nước ở cấy phục hồi trên môi trường EIM, ủ ở 280C Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III. sau 48 giờ. Sau đó chọn một khuẩn lạc đơn (có Môi trường phân lập, nuôi cấy tăng sinh, màu xanh lá, trong mờ) trên môi trường EIM, đã được sử dụng, gồm: Môi trường nuôi cấy tăng sinh trong môi trường BHIB chứa 50 µg/ml 86 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 nghiệm được tiến hành theo dõi trong 90 ngày. + Các bước chuẩn bị vi khuẩn đem bảo quản tương tự như mục 2.2. Tuy nhiên, vi khuẩn sau khi ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút được trộn với 10% glycerol đã được thanh trùng (về thể tích) như là chất chống đông. + Dùng pipet Pasteur hút khoảng 1ml dịch huyền phù đưa vào trong ống lạnh sâu và đóng nắp. Bao ống lạnh sâu bằng parafﬁn. + Toàn bộ các ống lạnh sâu đem bảo quản được để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào vi khuẩn. + Các ống lạnh sâu đem bảo quản được làm lạnh từ từ (thang 50C/lần) đến -300C và cuối cùng bảo quản ở - 300C. + Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ -300C, kiểm tra hình dạng, kích thước và mật độ vi khuẩn đem bảo quản tương tự như phương pháp bảo quản bằng thạch nghiêng. Thí nghiệm được tiến hành theo dõi trong 30 ngày. Lưu ý: khi đem các ống lạnh sâu bảo quản ở nhiệt độ -300C để kiểm tra hình dạng, kích thước và mật độ vi khuẩn thì cần phải được hoạt hóa bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (đưa ngay vào tủ ấm 370C trong 40 giây). 2.3. Khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN colistin (đối với chủng E. ictaluri WT) và môi trường BHIB chứa 50µg adenine/ml, 50 µg/ml colistin + 50 µg/ml kanamycin (đối với chủng E. ictaluri PAM). Tiến hành nuôi cấy lắc ở 280C, 250 vòng/phút trong 24 giờ. + Lấy 10ml dịch vi khuẩn li tâm ở 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C thu phần huyền phù cặn (vi khuẩn) sao cho đạt giá trị OD600nm khoảng 1,0 (tương đương khoảng 109CFU/ ml); kiểm tra mật độ vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo phương pháp gián tiếp của Koch để xác định mật độ vi khuẩn ban đầu đem bảo quản, đồng thời nhuộm gram để xác định hình dạng và kích thước khi đem bảo quản. + Chia dịch huyền phù (vi khuẩn) với thể tích 1ml vào ống thạch nghiêng BHI đã được chuẩn bị sẵn, sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ 40C. + Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ 4 C, 3 ống thạch nghiêng đem bảo quản được 0 lấy ra nuôi cấy để kiểm tra hình dạng, kích thước vi khuẩn trên môi trường thạch BHI theo phương pháp gián tiếp của Koch để xác định mật độ vi khuẩn sau 30 ngày bảo quản. Thí được lưu giữ trên thạch nghiêng BHI có phủ lớp dầu khoáng (parafﬁn) ở 40C + Phương pháp được tiến hành tương tự như mục 2.2 nhưng dịch huyền phù vi khuẩn sau khi được đưa vào các ống thạch nghiêng BHI đã được chuẩn bị trước được đem phủ một lớp dầu khoáng dày 1 – 2 cm rồi mới đem bảo quản ở nhiệt độ 40C. + Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như mục 2.2. 2.4. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn được lưu giữ bằng phương pháp lạnh sâu (âm 300C) 1. Kết quả khảo sát kích thước của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) theo thời gian và điều kiện bảo quản khác nhau Vi khuẩn E. ictaluri PAM sau mỗi 30 ngày bảo quản ở các điều kiện khác nhau: Thạch BHI nghiêng và thạch BHI nghiêng có phủ dầu khoáng ở nhiệt độ 40C, bảo quản lạnh sâu -300C được kiểm tra kích thước trên kính hiển vi. Kết quả khảo sát kích thước của chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA theo thời gian và điều kiện bảo quản khác nhau được thể hiện ở bảng 1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 87 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 Bảng 1. Kích thước chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) và E. ictaluri chưa bị đột biến gen (E. ictaluri WT) theo thời gian và điều kiện bảo quản khác nhau Điều kiện bảo quản Thời gian bảo quản (ngày) Thạch nghiêng Thạch nghiêng + dầu khoáng Lạnh sâu Kích thước khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri PAM sau 24 giờ (mm) Thạch nghiêng Thạch nghiêng + dầu khoáng Lạnh sâu Kích thước (chiều dài) vi khuẩn E. ictaluri PAM sau 24 giờ (µm) 0 2,42 ± 0,14 2,42 ± 0,14 2,42 ± 0,14 3,0 ± 0,25 3,0 ± 0,255 30 2,17 ± 0,38 2,18 ± 0,52 2,25 ± 0,25 2,88 ± 0,033 2,75 ± 0,25 2,92 ± 0,380 60 1,92 ± 0,29 2,00 ± 0,25 1,67 ± 0,29 2,50 ± 0,25 2,67 ± 0,14 1,42 ± 0,29 1,58 ± 0,14 2,33 ± 0,14 2,50 ± 0,25 90 3,0 ± 0,25 2,33 ± 0,52 Kích thước khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri WT sau 24 giờ (mm) Kích thước (chiều dài) vi khuẩn vi khuẩn E. ictaluri WT sau 24 giờ (µm) 0 2,43 ± 0,21 2,43 ± 0,21 2,43 ± 0,21 2,80 ± 0,30 2,80 ± 0,30 2,80 ± 0,30 30 2,20 ± 0,10 2,20 ± 0,26 2,40 ± 0,10 2,6 ± 0,40 2,60 ± 0,4 2,8 ± 0,40 60 2,23 ± 0,21 2,33 ± 0,21 2,17 ± 0,38 2,6 ± 0,30 2,80 ± 0,30 2,9 ± 0,40 2,10 ± 0,26 2,13 ± 0,06 - 2,40 ± 0,14 2,80 ± 0,29 90 Kết quả từ bảng 1 cho thấy: + Chiều dài vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) ở các điều kiện bảo quản khác nhau không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tuy nhiên, theo thời gian bảo quản: 0, 30, 60 và 90 ngày lại cho sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p0,05), có thể là do ở điều kiện bảo quản bằng thạch BHI nghiêng và thạch BHI nghiêng phủ dầu khoáng ở nhiệt độ 40C là tương tự nhau, việc phủ một lớp dầu khoáng dày 1 – 2 cm chỉ giúp vi khuẩn không thể tiếp xúc trực tiếp được với không khí nên không thể phát triển được. Còn bảo quản ở lạnh sâu -300C do đã được bổ sung glycerol – chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh, đồng thời nhờ vào việc giảm nhiệt độ từ từ trong quá trình bảo quản mẫu nên đã hạn chế được rất nhiều việc tế bào vi khuẩn có thể bị vỡ do quá trình làm lạnh và làm tan mẫu (do việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào vi khuẩn). Do vậy, vi khuẩn E. ictaluri PAM được bảo quản ổn định. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 2. Kết quả khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) ở các điều kiện bảo quản khác nhau 2.1 Ở điều kiện bảo quản bằng thạch nghiêng ở 40C Kết quả theo dõi khả năng phát triển của chủng E. ictaluri PAM và E. ictaluri chưa đột biến (E. ictaluri WT) ở điều kiện bảo quản bằng thạch BHI nghiêng ở 40C trong 90 ngày thể hiện ở hình 1. Hình 1. Đồ thị kết quả khảo sát số lượng tế bào E. ictaluri PAM và E. ictaluri WT theo thời gian bảo quản bằng thạch BHI nghiêng ở 40C Kết quả từ hình 1 cho thấy, không có sự E. ictaluri PAM bị giảm dần theo thời gian bảo khác nhau có ý nghĩa thống kê (p>0,05) giữa quản và chủng vi khuẩn E. ictaluri PAM bị chết số lượng tế bào vi khuẩn chủng E. ictaluri đi sau 90 ngày. Điều này cũng đúng với những đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) và chủng thông báo trước đây của Nguyễn Lân Dũng và E. ictaluri chưa bị đột biến (E. ictaluri WT) theo cộng sự (2001) [2], Nguyễn Đức Hùng và cộng thời gian bảo quản bằng thạch BHI nghiêng ở sự (2004) [3] cho rằng, phương pháp bảo quản 4 C. Tuy nhiên, số lượng tế bào vi khuẩn của bằng thạch nghiêng (phương pháp cấy truyền chủng E. ictaluri PAM và chủng E. ictaluri WT vi sinh vật) chỉ bảo quản được vi sinh vật trong giảm nhanh theo thời gian bảo quản, đặc biệt một thời gian ngắn (không quá 3 tháng), sau sau 90 ngày bảo quản, mật độ tế bào cả hai đó vi sinh vật phải được cấy truyền sang môi chủng đều là 0 CFU/ml. Như vậy, có thể thấy trường mới trước khi già và chết đi. rằng thời gian lưu giữ chủng vi khuẩn E. ictal- 2.2. Ở điều kiện bảo quản bằng thạch nghiêng uri PAM (đột biến gen purA) bằng phương pháp có phủ dầu khoáng ở 40C 0 thạch BHI nghiêng chỉ duy trì trong 60 ngày, Kết quả theo dõi khả năng phát triển sau thời gian bảo quản trên, bắt buộc phải của chủng vi khuẩn E. ictaluri PAM (đột biến được cấy truyền sang môi trường mới. Kết quả gen purA) và chủng vi khuẩn vi khuẩn E. ictaluri kiểm tra kích thước chủng vi khuẩn E. ictaluri WT (chưa đột biến) ở điều kiện bảo quản bằng PAM (đột biến gen purA) sau 60 ngày bảo quản thạch BHI nghiêng có phủ dầu khoáng ở 40C (bảng 1) cũng cho thấy kích thước vi khuẩn trong 90 ngày thể hiện ở hình 2: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 89